1998년 8~10월에 남해안 일원 해상 가두리 양식장에서 사육중인 돌돔, Oplegnathus fasciatus이 60%이상 폐사하였다. 병어의 체색은 검어지거나 퇴색되며 아가미는 빈혈증상이 심하고 비장은 특이적으로 비대되어 있었고, 비장, 신장, 심장 및 간장 조직에서 퓰겐양성과 호염기성의 비대세포가 관찰되었다. 병어의 비장조직 마쇄액을 GF세포에 접종배양한 결과, 세포가 구형화 되면서 커지는 세포변성효과가 나타나 감염된 GF 세포로부터 바이러스가 분리되었다. 분리된 바이러스 배양액($10^4TCID_{50}$/0.1 ml)을 건강한 돌돔 치어에 복강주사하면 자연감염어와 유사한 증상을 나타내면서 폐사가 일어났고, 또한 병어의 비장조직을 전자현미경으로 관찰한 결과, 조직내 비대세포의 세포질에서 직경이 120~130 nm이며 외막이 있는 정 20면체의 바이러스 입자가 관찰되었다. 그리고 genebank로부터 얻은 참돔 이리도바이러스(RSIV)의 ATPase gene의 DNA염기서열을 주형으로 제작된 primer를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 500 bp의 PCR 생성물이 병어나 인위감염된 GF세포에서 얻어졌는데, 이들 PCR 생성물은 RSIV의 ATPase cDNA gene과 95%의 상동성을 나타내었다. 따라서 양식돌돔에 대량 폐사를 일으킨 원인 바이러스는 참돔 이리도바이러스(RSIV)와 유사한 이리도바이러스로 밝혀졌다.
1998년 8~10월에 남해안 일원 해상 가두리 양식장에서 사육중인 돌돔, Oplegnathus fasciatus이 60%이상 폐사하였다. 병어의 체색은 검어지거나 퇴색되며 아가미는 빈혈증상이 심하고 비장은 특이적으로 비대되어 있었고, 비장, 신장, 심장 및 간장 조직에서 퓰겐양성과 호염기성의 비대세포가 관찰되었다. 병어의 비장조직 마쇄액을 GF세포에 접종배양한 결과, 세포가 구형화 되면서 커지는 세포변성효과가 나타나 감염된 GF 세포로부터 바이러스가 분리되었다. 분리된 바이러스 배양액($10^4TCID_{50}$/0.1 ml)을 건강한 돌돔 치어에 복강주사하면 자연감염어와 유사한 증상을 나타내면서 폐사가 일어났고, 또한 병어의 비장조직을 전자현미경으로 관찰한 결과, 조직내 비대세포의 세포질에서 직경이 120~130 nm이며 외막이 있는 정 20면체의 바이러스 입자가 관찰되었다. 그리고 genebank로부터 얻은 참돔 이리도바이러스(RSIV)의 ATPase gene의 DNA염기서열을 주형으로 제작된 primer를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 500 bp의 PCR 생성물이 병어나 인위감염된 GF세포에서 얻어졌는데, 이들 PCR 생성물은 RSIV의 ATPase cDNA gene과 95%의 상동성을 나타내었다. 따라서 양식돌돔에 대량 폐사를 일으킨 원인 바이러스는 참돔 이리도바이러스(RSIV)와 유사한 이리도바이러스로 밝혀졌다.
From August to October 1998, over 60% mortality of cultured striped beakperch Oplegnathus fasciatus was occurred in net cages along the southern coast of Korea. Moribund fish showed some clinical signs of lethargic behavior, dark coloration or decoloration, severe gill anemia and enlargement of sple...
From August to October 1998, over 60% mortality of cultured striped beakperch Oplegnathus fasciatus was occurred in net cages along the southern coast of Korea. Moribund fish showed some clinical signs of lethargic behavior, dark coloration or decoloration, severe gill anemia and enlargement of spleen. Also enlarged basophilic cells showing Feulgen -positive reaction were observed in the tissue section of spleen, kidney, liver and heart of the diseased fish. GF cells inoculated with spleen homogenate of diseased fish produced cytopathic effect of enlarged and rounded cells, therefore the causative virus was isolated from diseased fish. Striped beakperch fingerlings intraperitoneally inoculated with the causative virus ($10^4TCID_{50}$/0.1 ml) revealed symptoms similar to those of naturally infected fish and died from 7 to 14 days post injection. Transmission electron microscopy revealed that the causative virus was enveloped icosahedral particle with 120~130 nm in diameter. PCR products of the expected size (500 bp) were amplified with a primer set based on the ATPase gene of RSIV(red sea bream iridovirus) using template DNAs which were extracted from the spleen of diseased fish and GF cells inoculated with the causative virus. According to the analysis of nucleotide sequence of these PCR products, the sequence from ATPase cDNA gene of the causative virus showed 95% homology with that of RSIV. These results indicate that the mass mortality in the cultured striped beakperch was caused by the infection of iridovirus similar to RSIV.
From August to October 1998, over 60% mortality of cultured striped beakperch Oplegnathus fasciatus was occurred in net cages along the southern coast of Korea. Moribund fish showed some clinical signs of lethargic behavior, dark coloration or decoloration, severe gill anemia and enlargement of spleen. Also enlarged basophilic cells showing Feulgen -positive reaction were observed in the tissue section of spleen, kidney, liver and heart of the diseased fish. GF cells inoculated with spleen homogenate of diseased fish produced cytopathic effect of enlarged and rounded cells, therefore the causative virus was isolated from diseased fish. Striped beakperch fingerlings intraperitoneally inoculated with the causative virus ($10^4TCID_{50}$/0.1 ml) revealed symptoms similar to those of naturally infected fish and died from 7 to 14 days post injection. Transmission electron microscopy revealed that the causative virus was enveloped icosahedral particle with 120~130 nm in diameter. PCR products of the expected size (500 bp) were amplified with a primer set based on the ATPase gene of RSIV(red sea bream iridovirus) using template DNAs which were extracted from the spleen of diseased fish and GF cells inoculated with the causative virus. According to the analysis of nucleotide sequence of these PCR products, the sequence from ATPase cDNA gene of the causative virus showed 95% homology with that of RSIV. These results indicate that the mass mortality in the cultured striped beakperch was caused by the infection of iridovirus similar to RSIV.
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문제 정의
그런데, 1998년 8월경 남해안 일원의 통영, 거제, 삼천포, 여수 등의 해상가두리 양^장에서 사육 중인 양돌돔이 폐사하기 시작하여 수온이 하강하는 10월말까지 사육량의 60%정도가 폐사하여, 기생충성 및 세균성 질병검사를 하였지만 병원성 기생충 및 세균은 검출되지 않았다. 따라서 정확한 폐사 원인을 규명하기 위해 병어를 수집하여 병리학적 검사를 수행한 결과, RSIV의 감염증상과 유사한 비대 세포가 비장조직 등에서 관찰됨으로 인해 양 돌돔의 폐사가 이리도바이러스가 원인일 가능성이 매우 높아 양^ 돌돔의 폐사원인 규명을 위해 본연구를 수행하여 결과를 보고하고자 한다.
PCR로 증폭된 500 bp 크기의 생성물을 1.5% agarose gel에서 분리하여 pGEM-T easy vector (Promega, pGEM-T Easy Vector System I,USA)에 삽입시킨 plasmid DNA를 E. coli DH5a에 형질전환시켜 대량 배양한 후 DNAplasmid를 주출하여 Hiarmacia Biotech automatic sequencer(Pharmacia Biotch, USA)을 이용해서 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열을 genebank 상에 존재하는 RSIV 유전자의 염기서열과 비교 분석하였다.
실시하였다. primer는 Kurita et 0.(1998) 이 보고한 RSIV ATPase gene을 이용해서 5'-GTACCA GGGCCATGTGAAGT-3, 와 5-GCAC AATGAGCITCATTCCA-3'를 제작하여 사용하였으며, PCR중폭반응은 10mM의 각각의 primer와0.5 unit TaKaRa Ex Taq™, 0.2 mM dNTPs, 2 mM MgCL, 1 mM 2-mercaptoethanol이 포함된 혼합물에 10 ng의 template DNA를 각각 첨가한후 Geneamp PCR system 2400(Perkin Elmer,USA)을 이용해 94℃ 30초간 변성, 58℃에서 45 초간 결합, 72℃에서 45초간 신장을 30회 반복수행하였다. 증폭된 반응생성물(product)은 1.
돌돔에서 분리된 이리도바이러스와 일본에서 보고된 참돔에 치명적인 피해를 일으키는 RSIV(red sea bream iridovirus)의 연관성을 확인하기 위흐)],폐사한 돌돔의 비장조직과 비장조직의 마쇄액을 접종시켜 배양한 GF세포로부터 high pure PCR template preparation kit(Boehringer Mannhem,USA)를' 이용하여 template DNA을 각각 분리하고 PCR을 실시하였다. primer는 Kurita et 0.
5% glutaraldehyde sol.로 4℃에서 4시간 고정하고, 1% osmium tetroxide로 실온에서 2시간 후고정한 다음, ethylalchol계열로 탈수시켜 Epon mixture로 포매하고 60~90nm박절해서 1% uranyl acetate와 lead citrate로 이 중 염색하여 투과전자현미경 (Hitachi-7200)으로 바이러스 입자를 관찰하였다.
coli DH5a에 형질전환시켜 대량 배양한 후 DNAplasmid를 주출하여 Hiarmacia Biotech automatic sequencer(Pharmacia Biotch, USA)을 이용해서 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열을 genebank 상에 존재하는 RSIV 유전자의 염기서열과 비교 분석하였다.
2 mM dNTPs, 2 mM MgCL, 1 mM 2-mercaptoethanol이 포함된 혼합물에 10 ng의 template DNA를 각각 첨가한후 Geneamp PCR system 2400(Perkin Elmer,USA)을 이용해 94℃ 30초간 변성, 58℃에서 45 초간 결합, 72℃에서 45초간 신장을 30회 반복수행하였다. 증폭된 반응생성물(product)은 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후 Ethidium bromide (Sigma, USA)로 염색해서 DNA 크기를 비교하였다.
대상 데이터
1998년 8~10월 경남 통영군 및 거제군의 관내해상 가두리 양^장에서 체색이 검어지거나 퇴색되며 힘없이 유영하는 빈사상태의 돌돔과 폐사된돌돔(체장 15~26cm)을 채집하여 시험에 사용하였다.
성능/효과
, 1998). 그리고 병든 돌돔으로부터 분리된 바이러스를 인위감염법으로 건강한 돌돔에 감염시킨 결과 자연감염어와 유사한 증상을 나타내면서 폐사함으로 인해 돌돔 폐사원인이 바이러스 감염에 의한 것임을 알 수 있다. 돌돔의 비장조직에서 관찰된 바이러스 입자들의 크기는 참돔이 리도바이러스(직경, 120-240nm; Inouye et al.
1), 이러한 비대세포는 Feulgen 양성반응을 나타내며 심장, 신장 및 아가미조직 둥에서도 관찰되었다. 그리고 비장조직을 도말하여 hemacolor로 염색한 결과, 정상 적혈구보다 훨씬 큰 호염기성 비대세포가 관찰되었다(Fig. 2).
돌돔 병어의 비장조직과 비장조직의 마쇄여과액을 접종한 GF세포를 대상으로 RSIV ATPase gene을 이용하여 제작한 primer를 이용하여 PCR 을 실시한 결과, Fig. 6에서와 같이 돌돔병어의 비장조직과 비장조직 마쇄액을 접종하여 배양한 GF 세포에서는 크기가 500 bp인 반웅생성물(product)이 증폭되었지만 바이러스를 접종하지 않은 GF 세포에서는 반응생성물이 증폭되지 않았다.
병든 돌돔으로부터 분리된 바이러스를 돌돔에 인위 감염시킨 결과 Fig. 5에서와 같이 돌돔은 감염시킨 후 7일째부터 폐사가 일어나기 시작하며, 14일째 전량 폐사되어 누적 폐사율이 100%였지만, 대조 구로서 EMEM만을 주사한 돌돔은 시험기간동안 전혀 폐사가 일어나지 않았다.
병어의 비장조직을 전자현미경으로 관찰한 결과, Fig. 4에서와 같이 이형비대세포의 세포질내에서 크기가 120시30 nm이면서 외막이 있는 정 20 면체 모양의 바이러스 입자가 무수히 관찰되었다.
특히 진한 호염기성의 비대세포가 비장과 간장조직에서 특이적으로 다수 관찰되었으며 (Fig.1), 이러한 비대세포는 Feulgen 양성반응을 나타내며 심장, 신장 및 아가미조직 둥에서도 관찰되었다. 그리고 비장조직을 도말하여 hemacolor로 염색한 결과, 정상 적혈구보다 훨씬 큰 호염기성 비대세포가 관찰되었다(Fig.
후속연구
그리고 돌돔에서 분리된 이리도바이러스가 일본의 참돔에서 분리된 이리도바이러스인 RSIV와의 유전학적인 연관성을 확인하기 위해 RSIV ATPase cDNA의 염기서열을 이용하여 제작한 primes를 사용한 PCR결과, 이리도바이러스에 감염된 돌돔 비장조직과 돌돔비장 마쇄액을 접종한 GF세포에서500 bp의 PCR산물을 얻어 sequencing하여 gene-bank상에 등록되어 있는 염기서열과 상동성을 검색한 결과, RSIV ATPase cDNA gene과 95%의상동성을 나타내어 돌돔의 폐사 원인바이러스는 일본의 참돔 이리도바이러스와 유사한 것으로 추정되지만, 돌돔이 리도바이러스는 현재까지 보고된 RSIV나 GSIV와 같은 이리도바이러스와의 상관관계가 밝혀지지 않았으므로 향후 이들 바이러스 DNA 염기서열의 비교연구가 필요한 것으로 생각된다.
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