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문제 정의
- 체계화되어 있지 않은 상태이다.8)따라서 저자들은 백서의 간에 방사선조사를 시행하여 cytokine의 발현과 apoptosis와의 상호관계를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
가설 설정
- A) Hepatic lobular architecture is well preserved in normal control tissue(H&E stain, ×l00).
- B) IL4 is not detected (Immunostain, ×200).
- D) TNF expression is decreased in postirradiation 3 days (Immunostain, ×l00).
제안 방법
- Apoptosis의 발현 빈도는 광확대(400배)에서 관찰되는 apoptosis 세포 수를 다섯 번 세어 평균을 구하였고, in situ nick end labelling method는 탈파라핀, 함수를 시킨 후 proteinase K와 반응시키고 Apoptag kit (Oncor, Gaithersburg, USA)를 사용하여 시행하였다. 즉, Tdt (terminal dioxynucleotidyl transferase) 효소와 반응시켜 digoxigenine이 표지된 누클레오티드를 결합시킨 후 효소 반응을 중단시키고, anti-digoxi-genine-peroxidase를 반응시켜 DAB (3, 3"diaminobenzidiiie)로 발색시켰다. Apoptosis의 발현빈도는 광확대(400배)에서 관찰되는 apoptosis 수를 역시 다섯 번 세어 평균치를 구하였다.
- Ⅱ.-6의 생물학적 활성도 측정은 IL-6 의존성 설치류 교잡체 아콜론(IL-6 dependent murine hybridoma subclone) B 9.55 세포주를 이용하여 IL-6의 활성을 측정하였다. B 9.
- 10% 포르말린에 고정된 간 조직을 통상의 방법대로 파라핀에 포매한 후 절편기를 이용하여 5 ㎛ 절편을 만들어 슬라이드에 붙인 후 hematoxylin-eosin 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. Apoptosis의 발현 빈도는 광확대(400배)에서 관찰되는 apoptosis 세포 수를 다섯 번 세어 평균을 구하였고, in situ nick end labelling method는 탈파라핀, 함수를 시킨 후 proteinase K와 반응시키고 Apoptag kit (Oncor, Gaithersburg, USA)를 사용하여 시행하였다.
- 관찰하였다. Apoptosis의 발현 빈도는 광확대(400배)에서 관찰되는 apoptosis 세포 수를 다섯 번 세어 평균을 구하였고, in situ nick end labelling method는 탈파라핀, 함수를 시킨 후 proteinase K와 반응시키고 Apoptag kit (Oncor, Gaithersburg, USA)를 사용하여 시행하였다. 즉, Tdt (terminal dioxynucleotidyl transferase) 효소와 반응시켜 digoxigenine이 표지된 누클레오티드를 결합시킨 후 효소 반응을 중단시키고, anti-digoxi-genine-peroxidase를 반응시켜 DAB (3, 3"diaminobenzidiiie)로 발색시켰다.
- 즉, Tdt (terminal dioxynucleotidyl transferase) 효소와 반응시켜 digoxigenine이 표지된 누클레오티드를 결합시킨 후 효소 반응을 중단시키고, anti-digoxi-genine-peroxidase를 반응시켜 DAB (3, 3"diaminobenzidiiie)로 발색시켰다. Apoptosis의 발현빈도는 광확대(400배)에서 관찰되는 apoptosis 수를 역시 다섯 번 세어 평균치를 구하였다.
- 일차항체 반응 후 결합이 안 된 항체를 PBS로 수세하고 바이오틴이 결합된 이차 항체antirabbit IgG antibody)를 20분간 반응시킨 다음 PBS로 수세한 후 과산화효소가 결합된 streptavidin 용액을 다시 20분간 반응시킨 후 수세하고 AEC (3-amino-9-ethylcarbazole)를 사용하여 발색시켰다. Mayer's hematoxylin으로 대조염색한 후 증류수로 수세하고 수성 접착제로 포매하여 광학현미경으로 IL-1, IU4, IL-6 및 TNF의 발현정도를 관찰하여 염색정도를 grade로 분류하였다. 일차 항체 대신 PBS로 반응시킨 군을 음성 대조군으로 하였으며, 대부분의 세포가 가장 강한 양^으로 보이는 경우를 grade 3, 대부분의 세포에서 양성반응을 보이나 염색정도가 약한 경우를 grade 2, 그 사이의 염색상을 보이는 경우 중에 일부의 세포만 양성을 보이는 경우를 grade 1로 분류하였다.
- 방사선조사 후 1일(1군), 3일(2군), 5일(3군), 7일(4군), 14일(5군)에 희생시켰으며, 대조군은 방사선을 조사하지 않고, 각 군의 희생일에 맞추어 각각 2마리씩 희생시켜 실험하였다. 방사선 면역측정법(radioimmuno-assay, RIA)과 생물학적 활성도 측정(bioassay)을 위한 혈액채취는 심장에서 하였고, 간 조직은 1/2은 활성도 측정을 위해 냉동하였으며, 1/2은 면역조직화학 염색을 위해 10% 포르말린용액에 보관하였다.
- 백서를 가볍게 에테르로 흡입 마취한 후 고정틀에 사지를 고정하고, 6 MV 선형가속기(NEC 1006X, Tokyo, Japan)를 사용하여 전신에 8 Gy의 방사선을 분당 2 Gy의 선량률로 단일조사하였다. 방사선조사 후 1일(1군), 3일(2군), 5일(3군), 7일(4군), 14일(5군)에 희생시켰으며, 대조군은 방사선을 조사하지 않고, 각 군의 희생일에 맞추어 각각 2마리씩 희생시켜 실험하였다. 방사선 면역측정법(radioimmuno-assay, RIA)과 생물학적 활성도 측정(bioassay)을 위한 혈액채취는 심장에서 하였고, 간 조직은 1/2은 활성도 측정을 위해 냉동하였으며, 1/2은 면역조직화학 염색을 위해 10% 포르말린용액에 보관하였다.
- 백서를 가볍게 에테르로 흡입 마취한 후 고정틀에 사지를 고정하고, 6 MV 선형가속기(NEC 1006X, Tokyo, Japan)를 사용하여 전신에 8 Gy의 방사선을 분당 2 Gy의 선량률로 단일조사하였다. 방사선조사 후 1일(1군), 3일(2군), 5일(3군), 7일(4군), 14일(5군)에 희생시켰으며, 대조군은 방사선을 조사하지 않고, 각 군의 희생일에 맞추어 각각 2마리씩 희생시켜 실험하였다.
- 8 Ci/mmol)으로 표지하였다. 세포는 자동세포 분주기를 이용하여 유리여과지에 모아, 방사성표지된 DNA의 양을 liquid scintillation counter (Beckman, LS 6000A, Brea, USA)로 측정하였다.
- Mayer's hematoxylin으로 대조염색한 후 증류수로 수세하고 수성 접착제로 포매하여 광학현미경으로 IL-1, IU4, IL-6 및 TNF의 발현정도를 관찰하여 염색정도를 grade로 분류하였다. 일차 항체 대신 PBS로 반응시킨 군을 음성 대조군으로 하였으며, 대부분의 세포가 가장 강한 양^으로 보이는 경우를 grade 3, 대부분의 세포에서 양성반응을 보이나 염색정도가 약한 경우를 grade 2, 그 사이의 염색상을 보이는 경우 중에 일부의 세포만 양성을 보이는 경우를 grade 1로 분류하였다.
대상 데이터
- 실험 동물은 체중 250-300 gm의 생후 4~5개월 된 백서(Sprague-Dawley) 60 마리로 암수 구별 없이 사용하였고, 방사선조사군은 1군부터 5군으로 구분하여 각 군을 10마리로 하였다. 백서를 가볍게 에테르로 흡입 마취한 후 고정틀에 사지를 고정하고, 6 MV 선형가속기(NEC 1006X, Tokyo, Japan)를 사용하여 전신에 8 Gy의 방사선을 분당 2 Gy의 선량률로 단일조사하였다.
데이터처리
- 각 방사선조사군의 apoptosis의 수, IL-6의 활성도 측정, 방사선 면역 측정의 결과는 대조군과의 차이를 group t-test를 이용하여 검정, 유의수준 0.05구간에서 통계학적 의의를 분석하였다.
이론/모형
- -6의 생물학적 활성도 방사선면역측정을 함께 하였다. 면역조직 화학 염색은 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin, DAKO, Car-tenteria, USA)kit를 사용하여 Hsu 등9)이 기술한 방법으로 염색하였으며, 일차항체로는 단클론성 IL-1, IL4항체와 다클론성 IL-6 및 TNF항체를 사용하였다. 파라핀 포매조직으로부터 5㎛의 절편을 만들어 크실렌과 에탄올로 탈파라핀과 함수를 시킨 후 H2O2로 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)를 차단시키고 인산화 완충용액 (phosphate buffered saline, PBS, pH 7.
성능/효과
- TNF는 17kD의 폴리펩티드로 처음에는 cachectin으로 불리 우며, 심한 염증이나 종양 등에서 패혈성 쇽과 악액질을 유 발하며 그 외에도 다양한 기능을 가진다고 하였다.21) TNF와 IL-6는 IL-1과 함께 급성기 반응을 유발하며, 또한 섬유모세 포, 혈관내피세포, 상피세포 등에 작용하여 IL-6를 합성하도 록 한다.26) 방사선조사 후 여러 세포에서 N의 증가는 여러 연구에서 보고되었고 또 그 기전은 TNF와 방사선조사 모두 spingomyelin을 ceramide로 가수분해를 활성화시킴으로 apoptosis를 유도한다고 하였다.
- 한 cytokinee 여러 자극에 대한 반응으로 다양한 세포에서 생산될 뿐 아니라, 다양한 표적세포에 대해 여러 가지의 생물학적 효과로 작용한다.4) Cytokine의 역할은 수용자의 면역을 증강시키며, 손상된 조직을 복원하고 세포반응과 계통적 항상성을 복구시키는 생물학적 반응을 중재하며, 조절된 cytokine의 반응은 조직복원과 수용자 방어반응에 중요한 요소이기는 하지만, 과량의 cytokinee 조직에 손상과 섬유화를 초래하기도 한다고 한다.5)급성 반응에서 분비되는 cytokinee 주로 인터루킨 1 (interleukin 1, 이하 IL-1S.
- B) IL-6 expression is markedly decreased in postirradiation 5 days (Immunostain, ×100).
- C) TNF expression is highest in postirradiation 1 day (Immunostain, ×l00).
- In situ detection method에 의한 관찰결과, 방사선조사 후 1일(Fig. 2A, B)에 현미경 소견으로 관찰된 8.2개 보다 많은, 14.8개의 apoptosis가 3일부터는(Fig. 2C, D) 9.4로 감소되면서 점차 감소하는 경향을 뚜렷이 보였다. 대조군에 비해 통계적으로 의미있게 증가되어 있는 경우는 1일부터 7일의 결과이고, 14일에는 대조군과 통계적인 차이는 없었다(Table 1)
- 결론적으로 방사선조사 후 1일과 3일에 IL-1, IL-6 및 TNF 가 증가되는 것은 방사선에 의한 세포와 조직의 손상 즉, apoptosis와 연관되어 있으며, cytokine에 의해 apoptosis가 유 도된다는 기존의 연구 결과에 따르면, 이들 cytokine이 apoptosisf- 유발하는 것으로 생각할 수 있다. Kuida 등32)도 Interleukin-1 converting enzyme (ICE)이 없을 경우에 IL-6와 TNF의 양이 감소하였고, ICE가 있는 경우는 Fas Ab에 의한 apoptosis가 관찰되나, ICE가 없을 경우에는 apoptosis가 발생되지 않기 때문에, IL-1이 IL-6와 INF를 유도하고, 이것이 apoptosis를 발생시킬 것이라고 하였다따라서 방사선조사 에 의한 조직 손상은 급성 반응의 일부로 IL-1, IL-6, TNF 등의 cytokine을 분비하여 이것이 apoptosis를 유도함으로써 발 생한다고 생각할 수 있다.
- 그러나 모든 방사선조사군이 대조군에 비해서는 활성도가 증가되어 있었고 1일부터 14일에 이르기까지 점차 감소하는 경향을 뚜렷이 보여주었다(Table 3).
- 2C). 방사선조사 후 7일부터는 apoptosis수는 정상범위인 2.3개로 관찰되면서, 섬유화가 시작되는 것을 알 수 있었다(Table 1, Fig. 1C).
- '6* 방사선조사는 여러 세포에서 IL-1의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있는데, 폐에서 IL-1을 포함한 cytokine의 분비가 방사선조사 후의 염증반응 과 섬유화의 원인이며, 이는 2 Gy의 방사선조사 후 18시간 이내에 일어났다고 하였고 비장에서도 20 Gy의 방사선조사 후 IL-1의 증가를 보고하였는데, 이때 IL-1은 방사선 반응의 발생과 진행을 조절하는 역할을 한다고 하였다.본 연구 에서도 방사선조사 후 1일과 3일에 L1이 증가되어 다른 연 구결과들과 같이, IL-1이 방사선조사 후 빠른 시기에 증가되는 것을 볼 수 있었다. 따라서 1일부터 분비되는 이이 방 사선조사에 의한 조직 손상에 관여한다고 생각되었고 이는 섬유화 뿐 아니라 apoptosis에도 관여한다고 생각된다.
- 간에서 방사선조사에 의한 apoptosis는 1995년 Terashima 등8)에 의하여 처음 기술되었으며, 전신에 7 Gy의 방사선조사 후 30분에 DNA 분절화를 볼 수 있었고, 이는 조사 후 1~6시간에 정점에 도달하였다고 하였다. 본 연구에서 apoptosi가 방사선조사 후 1일에 가장 많이 관찰된 것과 일치하는 소견이다. 물론 조사 후 시간별로 희생시켜 보지는 못했지만 6시간에 나타나는 병리조직학적 소견은 날 짜로는 1일에서 많이 나타나는 것으로 생각할 수 있으므로 방사선조사 후 apoptosis가 일어나는 것은 급성 반응으로 생각된다.
- 특히 IL-6가 면역조직화학염색 뿐 아니라 방사선면역측정에서 확인되었고 또한 생물학적 활성도 측정에서 활성도가 증가한 것은 IL-6의 발현 뿐 아니라, 활 성이 증가한 것으로 나타나 방사선조사시 IL-6가 어떤 역할을 하리라는 것이 확실하다고 생각된다. 시기적으로도 IL-6 발현 정도가 apoptosis 발현빈도와 일치함으로써 상관관계가 있음을 추측할 수 있었다.
- 따라서 간 조직에서 방사선조사 후 발생하는 apoptosis는 IL-6와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 특히 IL-6가 면역조직화학염색 뿐 아니라 방사선면역측정에서 확인되었고 또한 생물학적 활성도 측정에서 활성도가 증가한 것은 IL-6의 발현 뿐 아니라, 활 성이 증가한 것으로 나타나 방사선조사시 IL-6가 어떤 역할을 하리라는 것이 확실하다고 생각된다. 시기적으로도 IL-6 발현 정도가 apoptosis 발현빈도와 일치함으로써 상관관계가 있음을 추측할 수 있었다.
후속연구
- Kuida 등32)도 Interleukin-1 converting enzyme (ICE)이 없을 경우에 IL-6와 TNF의 양이 감소하였고, ICE가 있는 경우는 Fas Ab에 의한 apoptosis가 관찰되나, ICE가 없을 경우에는 apoptosis가 발생되지 않기 때문에, IL-1이 IL-6와 INF를 유도하고, 이것이 apoptosis를 발생시킬 것이라고 하였다따라서 방사선조사 에 의한 조직 손상은 급성 반응의 일부로 IL-1, IL-6, TNF 등의 cytokine을 분비하여 이것이 apoptosis를 유도함으로써 발 생한다고 생각할 수 있다. 그러나 본 연구 결과로는 백서 간 에서 apoptosise]-cytokine의 발현의 시기가 일치하는 것만을 확인함으로써 apoptosis와 cytokine의 상호 연관성을 입증하였 지만, 양자간의 인과관계를 규명하기 위한 연구가 필요하다. 앞으로의 연구는 방사선조사 후 1일 이내의 시간대별 cytokine의 발현과 apoptosis를 확인하거나, cytokine 혹은 그 항체 를 전처치하는 등의 방법을 이용하여 cytokine에 의한 apoptosis의 유발을 확인하는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 그러나 본 연구 결과로는 백서 간 에서 apoptosise]-cytokine의 발현의 시기가 일치하는 것만을 확인함으로써 apoptosis와 cytokine의 상호 연관성을 입증하였 지만, 양자간의 인과관계를 규명하기 위한 연구가 필요하다. 앞으로의 연구는 방사선조사 후 1일 이내의 시간대별 cytokine의 발현과 apoptosis를 확인하거나, cytokine 혹은 그 항체 를 전처치하는 등의 방법을 이용하여 cytokine에 의한 apoptosis의 유발을 확인하는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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