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문제 정의
- 1996)와 세 포고사(Lin 등, 1998) 등 여러 기관에서 독성이 나타남이 밝혀지고 있다. 별아교세포에서의 peroxynitrite는 장시간의 노출 시 다른 자유 라디칼에 비해 특히 독성을 나타낼 가능성 이 보고되었는데 (Amir과 Pearce, 1997) 본 연구에서는 백서의 뇌조직으로부터 분리한 별아교세포에 신경계 에서 발생할 수 있는 여러 자유 라디칼들이 미치는 영향을 조사하고 특히 독성을 보이는 SIN-1에 의한 세포고사(apoptosis) 현상을 연구하였다.
제안 방법
- 먼저, FBS가 들어있지 않은 DMEM으로 배지를 갈아주고 1시간 안정화시킨 후 NO에 의한 세포독성을 조사하였다. NO 공여제인 SNP을 다양한 농도로 24시간 처리하면서 NO의 별아교세포에 대한 세포독성을 설치류 대식세포주인 RAW 264.7세포와 비교하면서 생존세포의 활성도(%) 를 계산하였다. SNP는 RAW 2647의 생존율을 농도 의존적으로 감소시키는 IrnM에서 40%의 생존율을 보였으나 별아교세포는 88% 정도의 생존율을 보였다 (Fi동.
- SIN-1에 의한 별아교세포 독성이 peroxyntrite 생성에 의하여 유도됨을 확인하기 위하여를 제거시키는 효소인 superoxide dismutase(SOD, 200 U/ml)와 H2O2를 분해하는 catalase(400 U/m/)를 전처리하였다. 2.
- 4B). SIN-1에 의한 별아교세포 죽음의 현상이 세포고사(apoptosis) 인지를 확인하기 위하여, SIN-1 을 처리한 20시간 후의 별아교세포를 4% 포르말린으로 고정한 후 여기에 Hoechst 33258을희 석하여 핵을 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다 (Fig.5). SIN-1 처리에 의하여 별아교세포핵의 크기가 줄어들어 수축하는 현저한 핵응축이 관찰되었으며 일부에서는 분절 현상을 확인할 수 있었다 (Fig.
- SIN-1 처리 이전에 SOD의 전처리는 SIN-1에 의한 별아교세포의 세포독성을 예방하지 못했으며 catalase는 SIN-1에 의한 별아교세포의 세포독성을 10% 예방하였다. SIN-1에 의한 별아교세포의 세포독성이 세포 내항산화제(antioxidant) 기능과의 연관성을 조사하기 위하여 글루타치온(glutathione)의 생성을 고갈시킬 수 있는 화학물질인 BSO를 24시간 동안 처리하여 세 포내의 글루타치온의 생성을 지연시킨 후 SNP(lmM),benzene triol(0.1 mM), H2O2(0.4 mM), SIN-1(2.5 mM)을처리 24시간 후에 별아교세포의 생존율을 조사하였다 (Fig.7). 단독처리시 별아교세포의 생존율에 거의 영향을 미치지 않았던 SNP(1 mM)과 benzene triol(0.
- 생후 3일 이내의 백서로부터 분리한 대뇌를 무균적으로 분리하여 Ca+\ Mg"이 없는 Hank's balanced salt solulion(HBSS)로 세척한 후 3 m/의 1% trypsin/ phosphaLe buffered saline(PBS)에 옮긴 후 실온에서 10분 방치하였다. Trypsin에 의하여용해된 백서대뇌 조칙에 10% FBSdhk penicillin(50 U/m/) 및 streptomycin(250 ng/E)이 포함된 DMEM으로 trypsin을 희석시킨 후 파스퇴르 파이펫으로 살게 분쇄하여 10~20분 계속 하여 절개하였다. 얻어진 세포는 멸균된 거즈를 통과시켜서 200 xg로 원심분리하여 침 전세포만을 모은 다음 10% FBS/DMEM로 현탁하여 poly-L-lysine으로 coating된 75 cm2 flasks에 부착시키기 위하여 37℃, 습기가 충분한 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 이상의 결과에서 별아교세포는 NO에 의하여 세포독성을 보였으며 고농도의 NO에 비교적 내성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 시험관내에서 O2를 방출시키는 화학물질인 benzene triot을 별아교세포에 농도별로 처리한 후 세포독성을 조사 하였다(Fig. 2A). Benzene triol 자극 6시간 후에 고농도인 0.
- 본 연구에서 사용한 백서별아교세포는 24 well에 분주하여 12시간 배양용기에 부착시킨 후 실험에 임하였다. 먼저, FBS가 들어있지 않은 DMEM으로 배지를 갈아주고 1시간 안정화시킨 후 NO에 의한 세포독성을 조사하였다. NO 공여제인 SNP을 다양한 농도로 24시간 처리하면서 NO의 별아교세포에 대한 세포독성을 설치류 대식세포주인 RAW 264.
- 백서의 뇌조직으로부터 별아교세포는 Fischer 등(1985)의 방법에 따라 분리하였으며 필요에 따라 약간의 변형을 가하였다. 생후 3일 이내의 백서로부터 분리한 대뇌를 무균적으로 분리하여 Ca+\ Mg"이 없는 Hank's balanced salt solulion(HBSS)로 세척한 후 3 m/의 1% trypsin/ phosphaLe buffered saline(PBS)에 옮긴 후 실온에서 10분 방치하였다.
- 별아교세포를 lx]CP개로 slide chambere] 밤새 부착시킨 후 2.5 mM의 STN-1> 20시간 동안 처리 후 PBS로 세척하여 죽어 떨어진 세포를 제거한 후 10% FBS/DMEM을 다시 채워서 도립광학 현미경 (converted phase-contrast microscopy)하에서 100X의 배율로 사진을 찍었다. 이후 PBS로 세척한 후 4% 포르마린으로 10분 고정시켜서 세척한 후 핵형광염색제인 Hoechist33258(l : 10, 000 회석)으로 염색하여 형광현미경 (fluorescence microscopy, Leica, Germany)하에서 필름에 노출시켜 현상하였다.
- SIN-1 어 '! 의한 별아교세포 죽음의 현상을 확인하기 위하여 SIN-1 을 처리한 20시간 후에 세포손상을 광학현미경하 에서 확인하였다 (Fig. 4). FBS가 들어있지 않은 DMEM상태에서 25mM의 SIN의을 처리한 12시간 후 별아교세포는 형태가 변하기 시직하여 세포 모양의 수축, 세포돌기 성 장의 감소, 그리고 배양용기로부터 부착력 상실에 의한 세포의 부유상태 등이 관찰되었다 (Fig.
- 5 mM의 STN-1> 20시간 동안 처리 후 PBS로 세척하여 죽어 떨어진 세포를 제거한 후 10% FBS/DMEM을 다시 채워서 도립광학 현미경 (converted phase-contrast microscopy)하에서 100X의 배율로 사진을 찍었다. 이후 PBS로 세척한 후 4% 포르마린으로 10분 고정시켜서 세척한 후 핵형광염색제인 Hoechist33258(l : 10, 000 회석)으로 염색하여 형광현미경 (fluorescence microscopy, Leica, Germany)하에서 필름에 노출시켜 현상하였다.
대상 데이터
- )에서 구입하였다. S-nitroso-n-acetylpenicillamine(SNAP)은 Alexis사(San Diego. CA, USA)로부터 구입하였다.
- MTT, DL- Buthionine-[S, R]-sulfoximine(BSO), Hoechst33258, S- nitrosoglutathione(GSNO), sodium nitroprusside(SNP), benzene triol, Cu/Zn-SOD. catalase 등은 Sigma사(St. Louis, USA)제품을 사용하였으며, 3-morpholinosydnonie mine(SIN-l)은 BiomoPkHaniburg, F.R.K.)에서 구입하였다. S-nitroso-n-acetylpenicillamine(SNAP)은 Alexis사(San Diego.
- 본 연구에서 사용한 백서별아교세포는 24 well에 분주하여 12시간 배양용기에 부착시킨 후 실험에 임하였다. 먼저, FBS가 들어있지 않은 DMEM으로 배지를 갈아주고 1시간 안정화시킨 후 NO에 의한 세포독성을 조사하였다.
- USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 및 핵염색 관찰에 이용한 slide chamber는 Nunc사(Germany)로부터 구입하여 사용하였다. MTT, DL- Buthionine-[S, R]-sulfoximine(BSO), Hoechst33258, S- nitrosoglutathione(GSNO), sodium nitroprusside(SNP), benzene triol, Cu/Zn-SOD.
- 실험동물은 임신 중인 Sprague Dawley 백서를 대한실험동물센터로부터 구입하여 사육하다가 태어난 생후 3일 이내의 백서를 암수구별없이 사용하였다. Dulbecco'smodified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS).
- Dulbecco'smodified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS). 항생제 및 trypsin 등의 세포배양에 필요한 성분은 GrBCO BRL사(Grand Island. NY USA)로부터 구입하였으며 배양용기(24 well plate와 10 cm dish)는 Falcon (Becton Dickinson, San Jose, CA. USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 및 핵염색 관찰에 이용한 slide chamber는 Nunc사(Germany)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- )를 산출하여 표시하였다. 세포독성을 보이는 값의 비교에 있어서는Student's Zest를 사용하였으며 P<0.01, 혹은 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며 이들의 평균과 표준편차(standard deviation. S.D.)를 산출하여 표시하였다. 세포독성을 보이는 값의 비교에 있어서는Student's Zest를 사용하였으며 P<0.
이론/모형
- 세포의 활성도는 MTT assay 방법을 이용하여 측정하였다. 먼저 세포자극에 의해 활성도가 떨어져 바닥으로부터 부착력이 떨어진 세포를 흡입기에 의해 버린 후 완충용액 (lx PBS)K로 세척한 후 완충용액으로 용해한 MTT(5 mg/ml) 배양액의 1/10 부피가 되게 각 well에 넣고 다시 4시간 배양기에서 반응시킨다.
성능/효과
- SIN-1에 의한 별아교세포 독성이 peroxyntrite 생성에 의하여 유도됨을 확인하기 위하여를 제거시키는 효소인 superoxide dismutase(SOD, 200 U/ml)와 H2O2를 분해하는 catalase(400 U/m/)를 전처리하였다. 2.5 mM SIN-1 처리 24시간 후에 별아교세포의 생존율은 대조군의 55% 정도로 감소하였으나 SOD와 catalase> 병용하여 전처리 시 SIN"에 의한 별아교세포의 생존율은 85%로 증가시켰다(Fig. 6). SOD 및 catalase 단독처리시 별아교세포의 생 존율에 미치는 영향은 없었다.
- 4). FBS가 들어있지 않은 DMEM상태에서 25mM의 SIN의을 처리한 12시간 후 별아교세포는 형태가 변하기 시직하여 세포 모양의 수축, 세포돌기 성 장의 감소, 그리고 배양용기로부터 부착력 상실에 의한 세포의 부유상태 등이 관찰되었다 (Fig. 4B). SIN-1에 의한 별아교세포 죽음의 현상이 세포고사(apoptosis) 인지를 확인하기 위하여, SIN-1 을 처리한 20시간 후의 별아교세포를 4% 포르말린으로 고정한 후 여기에 Hoechst 33258을희 석하여 핵을 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다 (Fig.
- 이렇게 방출된 이는 자체적인 독성뿐만 아니라 NO와 결합하여 강한 활성물질인 peroxynitrite# 생성하게 된다. NO와 O2를 동시에 방출시키면서 peroxynitrite를 생성시킴을 보고된 바 있는 공여제인 SINJ을 24지간 처리한 후에 MTT 방법에 의한 세포 생존율을 조사한 바별아 교세포는 peroxyn itrite에 의하여 현저한 생존율 감소를 보였다(Fig.3.이상의 결과에서 별아교세포는 peroxynitrite에 의하여 현저한 생존율 감소를 보였다(Fig. 3). 이상의 결과에서 별아교세포는 고농도의 NO 단독이나 산소자유기 산물에 의해 80% 이상의 세포 생존도를 유지하였으며 실제 생체 내의 조건에서 NO와 O2가 반응하여 생성하는 활성물질의 하나인 peroxynitrite 매개에 의한 세포손상이 유발되리라 추정되었다.
- 1A). RAW 264.7세포의 생존율을 30%로 감소시키는 고농도인 2mM SNP 처리 시에도 별아교세포는 79%의 생존률을 보였다. 또 다른 종류의 NO 공여제인 GSNO와 SNAP를 처리하였을 경우에도 고농도의 NO를 내는 0.
- 핵응축과 분절 현상은 세포고사의 특징적인 현상의 하나이다. SIN-1에 의한 세포죽음이 다른 자유기들과 다르게 세포고사에 의해 이루어짐을 확인하였다.
- 7세포와 비교하면서 생존세포의 활성도(%) 를 계산하였다. SNP는 RAW 2647의 생존율을 농도 의존적으로 감소시키는 IrnM에서 40%의 생존율을 보였으나 별아교세포는 88% 정도의 생존율을 보였다 (Fi동. 1A). RAW 264.
- 7). 단독처리시 별아교세포의 생존율에 거의 영향을 미치지 않았던 SNP(1 mM)과 benzene triol(0.1 mM) 처리군이BSO 전처리에 의하여 현저한 별아교세포의 생존율 감소를 보였다. SIN-1 처리 24시간 후 별아교세포는 항산화제 생성 억제에 의하여 대부분의 세포가 사멸하였다.
- 5 mM)의 경우 40%까지 그 생존율이 감소하였다. 또한 글루타치온을 보충한 경우에는 SIN-1 단독 처리군보다 5% 정도 높게 유지되는 것을 알 수 있었으며 항산화제인 NACE. 세포생존율을 증가시켰다 (출판되지 않은 결과).
- 또한 NO는 별아교세포의 마이토콘드리아 호흡계 (mitochondrial respiratory chain)를 저하시킨다고 보고되어 있다(Bolanos 등, 1994).본 결과에서 대식세포주인 RAW 264.7는 40%의 생존율을 보이는 농도인 1 mM SNP 처리군에서 별아교세포는 88%의 생존율을 유지하였다. 즉, NO 단독으로 직접적인 세포죽음을 초래하지 않았으나 고농도에 노출되었을 때 독성을 보였다.
- 본 연구에서 별아교세포는 NO 혹은 산소자유기산물 (O; 및 H2O2) 단독 처리에 의해서는 세포독성이 미약했으나 이들의 화합물인 peroxynitrite를 생성시키는 S1N-1에 의해서는 생존율이 급격하게 감소하였다. 별아교세포는 중 추신경계에서 가장 많이 분포하는 세포이며, 이들 세포에서 iNOS 발현증가는 신경세포와 회돌기교세포의 손상에 관련된 중추신경계 염증성 질환의 중요 병인으로 알려져 있어서, 뇌기능에 영향을 미치는 산소자유기에 의한 조직 손상을 조절하기 위해서 신경세포 자극과 염증반응 시 수반되는 NO의 생성기 전에 관한 연구도 활발히 이루어지고있다(Dawson등, 1993; Merrill 등.
- 이러한 보고들은 별아교세포가 중추신경계에서 글루타치온를 이용하여 외부자극에 대항하여 항산화제 역할을 수행 하고 있음을 보여주는 결과이다. 이러한 보고와 본 연구의 결과에 비추어별아교세포 세포독성의 주요 원인은 NO와 superoxide가 만나서 생성되는 화합물인 peroxynitritee} 의한 세포 독성 임을 암시하며 이는 세포고사 현상을 수반하였으며 또한 이러한 세포독성은 세포 내 글루타치온을 포함하는 항산화물질에 의하여 조절될 수 있음을 추정할 수 있었다.
- 실제로 0를 제거시키는 효소인 SOD와 를 분해시키는 catalase를 전처리한 다음 SIN-1 을 처리한 경우 세 포생존율을 85%까지 유지하였다. 이러한 현미경상으로 관찰되는 peroxynitrite의 공여제인 SIN-1에 의한 별아교세포 독성의 현상적 특성은 세포괴사(necrosis)와는데별 되는 세포고사를 통해 이루어짐을 핵의 응축 및 분절 현상을 통하여 확인할 수 있었다. 세포고사현상은 1980년대 후반기부터 세포생물학 영역에 주요 관심 분야로 도입되면서 많은 분야에 혁명적인 변화를 가져왔으며 특히 신경계와 면역계세포의 생성, 분화 및 기능 발현 등에 중요하게 작용함이 밝혀졌다(Raff 등, 1993).
- IB). 이상의 결과에서 별아교세포는 NO에 의하여 세포독성을 보였으며 고농도의 NO에 비교적 내성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 시험관내에서 O2를 방출시키는 화학물질인 benzene triot을 별아교세포에 농도별로 처리한 후 세포독성을 조사 하였다(Fig.
- 3). 이상의 결과에서 별아교세포는 고농도의 NO 단독이나 산소자유기 산물에 의해 80% 이상의 세포 생존도를 유지하였으며 실제 생체 내의 조건에서 NO와 O2가 반응하여 생성하는 활성물질의 하나인 peroxynitrite 매개에 의한 세포손상이 유발되리라 추정되었다.
- 7는 40%의 생존율을 보이는 농도인 1 mM SNP 처리군에서 별아교세포는 88%의 생존율을 유지하였다. 즉, NO 단독으로 직접적인 세포죽음을 초래하지 않았으나 고농도에 노출되었을 때 독성을 보였다. Peroxynitrite 처리시 농도의존적인 별아교세포의 급격한 생존율 감소는 별 아교세포가 실제 생체 내에서 세포손상을 입을 수 있는 가능성은 NO가 다른 자유 라디칼과 결합하여 만드는 NO 유도성 화합물에 의해 매개되어질 가능성을 의미하였다.
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