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문제 정의
- 정자의 첨체를 검사하기 위한 방법으로 위상차현미경이나 differential interference contrast(DIC)가 장착된 현미경을 이용하는 법, naphthol yellow S-ery- throsin B 또는 Bismark brown-rose Bengal 등으로 염색하거나 형광염색 후 검사하는 방법 등이 보 고되었다(Cross와 Meizel, 1989). 본 연구는 소정자의 생사 및 첨체성상을 검사할 수 있는 간편하교 효과적인 염색법을 규명하기 위하여 수행되었다.
제안 방법
- blue-naphtho yellow S-eythrosin B 염색의 비교 정자첨체염색의 정확성과 편리성을 조사하기 위하여 기존의 naphthol yellow S-erythrosin B 염색 (생존율은 eosin-nigrosin 염색으로 검사)과 이를 웅용한 복합 trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색을 비교 실험하였다. 동결윰해 직후 및 heparin으로 수정능획득을 유도한 5시간 후의 생존율과 첩체 반응률을 각각 조사하여 비교 검토하였다.
- 다른 염색을 병행할 수 있는 trypan blue 염색과 일반적인 정자생사판정법인 eosin-nigrosin 염색을 비교 검토할 목적으로 동결정액을 융해하여 각각 2 시간 및 10시간 배양 후의 생존율을 조사하였다.
- blue-naphtho yellow S-eythrosin B 염색의 비교 정자첨체염색의 정확성과 편리성을 조사하기 위하여 기존의 naphthol yellow S-erythrosin B 염색 (생존율은 eosin-nigrosin 염색으로 검사)과 이를 웅용한 복합 trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색을 비교 실험하였다. 동결윰해 직후 및 heparin으로 수정능획득을 유도한 5시간 후의 생존율과 첩체 반응률을 각각 조사하여 비교 검토하였다.
- Trypan blue 염색은 염색은 Sanchez 둥《1995)의 방법을 변형하여 실시하였다. 원심관에 정자부유액 과 동랑의 0.2% trypan blue(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 염색액을 혼합한 후 37P 수 조에서 10분간 배양하여 염색하였으며, modified Tyrode's 배먕액으로 2회 원심세정하였다. 정자를 1X107 sperm cells /ml 농도로 재 부유한 후 slide glass에 도말하고 공기 중에서 건조시 킨 후 광학현 미경하에서 검경하였다〔X400).
- Louis, MO, USA) 염색액을 혼합한 후 37P 수 조에서 10분간 배양하여 염색하였으며, modified Tyrode's 배먕액으로 2회 원심세정하였다. 정자를 1X107 sperm cells /ml 농도로 재 부유한 후 slide glass에 도말하고 공기 중에서 건조시 킨 후 광학현 미경하에서 검경하였다〔X400). 정자생사의 판정기 준은 두부가 푸르게 염색된 것을 사멸정자로, 염색 되지 않고 밝게 보이는 것을 생존정자로 하였으며 (Fig.
- 정자의 첨체염색은 Lenz 둥(1983)의 방법에 준하여 실시하였다. 정자부유액을 slide glass에 도말하여 4012 가온판에서 건조시 켰으며, 0.1% naphthol yellow S 염색액에서 30분간 염색한 후 1% aqueous acetic acid로 10초간 세성하였다, 정자 도말표 본을 0.2% aqueous naphthol yellow S와 0.2% aqueous erythrosin B를 동량 흔합한 염색 액 (pH4.8) 에서 13분간 염색하였고, 증류수로 세정한 후 공기 중에서 건조시켰으며, cover slip으로 덮어 광 학현미경 하에서 검경하였다(X400, X1000).
- 정자를 1X107 sperm cells /ml 농도로 재 부유한 후 slide glass에 도말하고 공기 중에서 건조시 킨 후 광학현 미경하에서 검경하였다〔X400). 정자생사의 판정기 준은 두부가 푸르게 염색된 것을 사멸정자로, 염색 되지 않고 밝게 보이는 것을 생존정자로 하였으며 (Fig. 2), 한 표본 당 200개의 정자를 관찰하여 생존율을 조사하였다
- Eosin-nigrosin 염색은 Barth와 Oko(1989)의 방법에 준하여, 정자부유액 20ul와 동량의 eosin-nigrosin 염색액을 slide glass 위에 점적하여 5초간 흔 합, 염색한 후 도말하였으며 alcohol lamp 상에서 건조시킨 후 괌학현미경하에서 검경하였다(X400).정자생사의 판정기준은 두부가 붉게 염색된 것을 사멸정자로, 염색되지 않고 밝게 보이는 것을 생존 정자로 하였으며 (Fig. 1), 한 표본 당 200개의 정자를 관찰하여 생존율을 조사하였다.
- 4). 현미경검 사시 1차로 생사판정을 위하여 200개의 정자를 관 찰하여 생존율을 산정하였으며, 2차로 생존 정자 중에서 200개를 관찰하여 첨체반응률을 조사하였다.
이론/모형
- Eosin-nigrosin 염색은 Barth와 Oko(1989)의 방법에 준하여, 정자부유액 20ul와 동량의 eosin-nigrosin 염색액을 slide glass 위에 점적하여 5초간 흔 합, 염색한 후 도말하였으며 alcohol lamp 상에서 건조시킨 후 괌학현미경하에서 검경하였다(X400).정자생사의 판정기준은 두부가 붉게 염색된 것을 사멸정자로, 염색되지 않고 밝게 보이는 것을 생존 정자로 하였으며 (Fig.
- 정 자의 첨 체 반응판정 은 trypan blue 염색 과 naphthol yellow S-erythrosin B 염색법의 기준에 따라 네 가지로 구분하였다. 즉, 생사의 판정기준은 postacrosomal region이 푸르게 염색된 것을 사멸 정자로, 분홍빛으로 염색된 것을 생존정자로 하였으며, 각각의 경우에 대하여 첨체부위가 탈색된 것 처럼 엽색이 되지 많은 것을 첨체반응이 일어난 것 으로, 첨체의 막부위가 짙게 염색된 것을 첨체반응 이 일어나지 않은 젓으로 하였다(Fig.
- 정자의 첨체염색은 Lenz 둥(1983)의 방법에 준하여 실시하였다. 정자부유액을 slide glass에 도말하여 4012 가온판에서 건조시 켰으며, 0.
성능/효과
- 05), 동일 조건하에서 염 색법에 따른 첨체반응률에는 유의적인 차이가 인정 되지 않았다. 결과적 으로 trypan blue-naphthol yel- low S-erythrosin B 염색의 생존율과 첨체반웅률온 각각 eosin-nigrosin 염색 및 naphthol yellow S-erythrosin B 염색과 유사한 정확도를 보여 유용 성이 확인되었다.
- 05), 동일 조건하에서 염색법에 따른 생존율에는 유의적인 차이가 없었다. 결과적 으로 정자의 생존율을 검사하는데 있어서 trypan blue 염색은 eosin-nigrosin 염색과 유사한 정확도 를 보여 유용성이 확인되었다.
- 동결정액 융해 후 및 판정능획득 5시간 후의 생존 율은 eosin-nigrosin 염 색 및 naphthol yellow S-erythrosin B 염색에서 각각 88.0 및 75.3%이었고, trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색 에서는 각각 89.2 및 76.7% 이었다(Table 2). 생존 율은 두 염색법 모두에서 배양시간의 경과에 따라 유의적으로 감소하였으나동일 조건하에서 염색법에 따른 생존율에는 유의적인 차이가 인정되지 않았다.
- 배양시간이 경과할수록 생존율은 유의적으로 감 소하였으나 (p<0.05), 동일 조건하에서 염색법에 따른 생존율에는 유의적인 차이가 없었다. 결과적 으로 정자의 생존율을 검사하는데 있어서 trypan blue 염색은 eosin-nigrosin 염색과 유사한 정확도 를 보여 유용성이 확인되었다.
- Trypan blue 염색은 온수조 내에서의 배양 과 염색액을 제거하기 위한 원심세정 등 과정이 복 잡한 단점이 있지만 생사판별이 확실하고 다른 염 색법과 병행 할 수 있다는 장점믈 가진다(Talbot와 Chacon, 1981; Varner 등, 1987; Cross와 Meizel, 1989; Sanchez 둥, 1995). 본 실험에서 동일 조건하 의 소 정자에 대하여 위의 두 가지 염색법을 비교 검토한 결과, 샘존성 판정에 있어 염색법 사이에 비슷한 결과를 보였으며 두 방법 모두 정자의 생사판 별에 적합하였다. 정자의 검사복적, 정자 표본수 및 실험조건 등에 따라 eosin-nigrosin 염색은 정자의 생사판별과 형태검사를 할 때, trypan blue 염색은 첨체반응검사를 위하여 다른 염색과 병용할 때 이용하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.
- 그러나 이 방법은 사람, 마우 스, 말과 염 소의 정 자를 검사하는 데는 유용하지 만, 소에는 부적합하여 일관성 있는 결과를 얻을 수 없 었다(Cross와 Meizel, 1989). 본 실험에서는 이러한 문제를 해결하고자 소 정자의 첨체염색에 유용 한 방법 인 naphthol yellow S-erythrosin B 염색과 생사판별염색인 trypan blue 염색을 병용하여 유용 성을 검토하였다, Trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색으로 생존율과 첨체반응률을 동시에 검사한 군과 기존의 eosin-nigrosin 염색으 로 생존율을 검사하고 naphthol yellow S-erythrosin B 염색으로 첨체반움률을 검사한 군에서 일치되는 결과를 보여 trypan blue 염색과 naphthol yellow S-erythrosin B 염색이 서로의 염색을 방해하 지 많고 정확한 생존율과 첨체반웅률을 검사할 수 있는 것으로 확인되었다. 더불어 eosin-nigrosin 염 색과 naphthol yellow S-erythrosin B 염 색으로 생 사와 첨체상태를 검사는 것은 별개의 표본을 대상으로 하기 때문에 정자의 사멸에 의한 첨체소실과 생존정자의 진성첨체반웅을 감별할 수 없어 결과의 신뢰도가 떨어지지만 trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색은 동일 표본을 대상으로 1차로 생사판정을 하고 2차보 생존정자 중에서딴 첨체반응검사를 하므로 정자의 사멸에 의한 변성의 결과인 첨체소실을 완전히 배제할 수 있다는 장점이 있으며, 앞으로 소뿐만 아니라 다른 동물의 첨 체 검사시에도 응용이 가능할 것으로 생각된다.
- 7% 이었다(Table 2). 생존 율은 두 염색법 모두에서 배양시간의 경과에 따라 유의적으로 감소하였으나동일 조건하에서 염색법에 따른 생존율에는 유의적인 차이가 인정되지 않았다.
- 소 정자의 첨체염색은 eosin-nigrosin 염색으로 생사판정 을 하고 naphthol yellow S-erythrosin B 염색으로 첨체반응을 조사하는 것보다 trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염 색 으로 동시에 생사 및 첨체반응 판정을 하는 것이 더 정확하고 효과적 이었다.
- 본 실험에서 동일 조건하 의 소 정자에 대하여 위의 두 가지 염색법을 비교 검토한 결과, 샘존성 판정에 있어 염색법 사이에 비슷한 결과를 보였으며 두 방법 모두 정자의 생사판 별에 적합하였다. 정자의 검사복적, 정자 표본수 및 실험조건 등에 따라 eosin-nigrosin 염색은 정자의 생사판별과 형태검사를 할 때, trypan blue 염색은 첨체반응검사를 위하여 다른 염색과 병용할 때 이용하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.
후속연구
- 본 실험에서는 이러한 문제를 해결하고자 소 정자의 첨체염색에 유용 한 방법 인 naphthol yellow S-erythrosin B 염색과 생사판별염색인 trypan blue 염색을 병용하여 유용 성을 검토하였다, Trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색으로 생존율과 첨체반응률을 동시에 검사한 군과 기존의 eosin-nigrosin 염색으 로 생존율을 검사하고 naphthol yellow S-erythrosin B 염색으로 첨체반움률을 검사한 군에서 일치되는 결과를 보여 trypan blue 염색과 naphthol yellow S-erythrosin B 염색이 서로의 염색을 방해하 지 많고 정확한 생존율과 첨체반웅률을 검사할 수 있는 것으로 확인되었다. 더불어 eosin-nigrosin 염 색과 naphthol yellow S-erythrosin B 염 색으로 생 사와 첨체상태를 검사는 것은 별개의 표본을 대상으로 하기 때문에 정자의 사멸에 의한 첨체소실과 생존정자의 진성첨체반웅을 감별할 수 없어 결과의 신뢰도가 떨어지지만 trypan blue-naphthol yellow S-erythrosin B 염색은 동일 표본을 대상으로 1차로 생사판정을 하고 2차보 생존정자 중에서딴 첨체반응검사를 하므로 정자의 사멸에 의한 변성의 결과인 첨체소실을 완전히 배제할 수 있다는 장점이 있으며, 앞으로 소뿐만 아니라 다른 동물의 첨 체 검사시에도 응용이 가능할 것으로 생각된다.
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