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문제 정의
- (Park 등 1992). 따라서 본 연구는 Eisenia and re [를 재료로 하여 장에서의 ALP 활성 분포와 분자량, 등전점 (pl), 열안정성, neuraminidase와 PLC 처리에 대한영향 및 기질 특이성 등 몇 가지 특성을 관찰하여 포유류를 비롯한 타종과 비교함으로써 대표적인 토양 무척추동물인 지렁이에서 중장의 ALP의 생리학적 중요성과 그 기능을 이해하고자 하였다.
제안 방법
- Ptdlns-PLC의 처리는 Hoffmann-Bhime 등(1991)에 의한방법을 약간 변형하여 사용하였다, 부분 정제된 중장 ALP10 μg에 Ptdlns-PLC (from Bacillus cereus, 1, 6 Ul/ml; Sigma, USA)가 포함된 0.1 M, pH 5.0 acetate 완충용액 300 pl를 첨가하여 25"C에서 24시간 배양하였다. 배양 후 non-denature PAGE와 activity staining을 수행하여 처리전과 후를 비교하였다.
- 제작된 절편은 chrom- alum gelatin으로 precoating된 glass slide 위에 mounting하고. 0.25% a-naphthyl phosphate와 0.05% diazonium salt가포함된 50 mM, pH 9.3 borate 완충용액 에서 30분간 배 양하여 ALP enzyme product를 형성케 한 후 광학현미 경 (Olympus, VANOX-S)으로 관찰하였다.
- ALP의 활성도를 측정하기 위하여 0.1 M, pH 9.0 Tris-HCl 완충용액으로 용해한 효소원 100μ1에 기 질 IOOul(l0mM p-Nitrophenyl phosphate)를 첨가하여 37℃에서 J5분간 반응시켰다. 그 후 0.
- Neuraminidase의 처리는 Wiliam고} Linda (198응)의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 부분 정제된 중장 ALP 10Vg에 Neuraminidase (from Clostridium perfrmgens, 4.
- 5% ampholyte (Bio-Rad, pH range 3-10)가 포함된 2차 증류수로 희석한 후. Rotofor Cell (BioRad) 을 사용하여 10W에서 약 2시간 동안 분리한 후 각각의 분획을 수집하였다. 수집된 각 분획의 효소 활성도와 pH를 측정하여 최고 활성도가 나타난 분획의 pH를 등전점으로 결정하였다.
- non-denaturing PAGE는 Ornstein (1964)의 방법을 약간변형하여 수행하였다. Separating gel (6%, 8 x 12x0.
- 50℃, 65℃에서 10분간 배양한 후 기질 100nl (10 mM p- nitrophenyl phosphate)를 첨가하여 각 온도에서 15분간 반응시 켰다. 반응 후 1 M NaOH 1 ml을 첨가하여 분광광도계로 400nm에서 흡광도를 측정하여 각 온도에 대한 활성도를 비교하였다.
- 0 acetate 완충용액 300 pl를 첨가하여 25"C에서 24시간 배양하였다. 배양 후 non-denature PAGE와 activity staining을 수행하여 처리전과 후를 비교하였다.
- 5 Tris-HCl 완충용액 300 μ1를 첨가하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 배양 후 non-denaturing PAGE와 activity staining을 수행하여 처리전과 후를 비교하였다.
- 부분 정제된 효소의 기질 특이성을 관찰하기 위해 효소와 각 기질을 반응시킨 다음, 효소활성의 대사산물인 무기인의 농도를 측정하여 비교하였다. 무기인은 Fiske와 Subbarow(1925)의 방법에 의해 정량하였다.
- 상기 과정에 의해 확인된 ALP 부위만을 gel cutter로 조심스럽 게 잘라 세절하고, 4℃, 30mA에서 6시간 동안 Elec- tro-Eluter (Bio-Rad)로 ALP를 회수하였다. 이때 사용된 ehnion 완충용액은 영 동시 사용된 reservoir 완충용액과 동일한 것을 사용하였다.
- 1 MNaOH I ml을 첨가하여 반응을 멈추게 하고. 생성된 p-nitrophenol anion을 분광광도계 (Becksnarl DU 600) 로 400 nm에서 흡광도를 측정하여 활성 도를 측정하였다. 상기 조건에서 p-nitrophenol의 extinction coef- ficient는 1.
- 배양 후 분광광도계로 820nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 무기인의 양은 potassiumphosphate dibasic (K2HPO4, Yakuri, Japan)을 표준시 약으로정량그래프를 만들었으며, 실험결과 측정된 흡광도를 그래프에 대응시켜 그 양을 산출하였다. 이때 사용된 기질은 P-nitrophenyl phosphate (2 mM, Fluka, Swiss), adenosine 5'- monophosphae (2 mM, Sigma, USA), adenosine S'-diphos- phae (2 mM, Sigma, USA), adenosine S'-triphosphae (5 mM, Sigma, USA), glucose 1'phosphate (2 mM, Sigma, USA), glucose 6-phosphate (2 mM, Sigma, USA), fructose 6-phos- phate (2 mM, Sigma, USA), bis (p-nitrophenyl)phosphate (20 m, Sigma, USA), a-glycerophosphate (2 mM, Sigma, USA), 및 p-glycerophosphate (2 mMf Sigma, USA) 등이 었다.
- Rotofor Cell (BioRad) 을 사용하여 10W에서 약 2시간 동안 분리한 후 각각의 분획을 수집하였다. 수집된 각 분획의 효소 활성도와 pH를 측정하여 최고 활성도가 나타난 분획의 pH를 등전점으로 결정하였다.
- 전기영동이 끝난 후 ALP 부위를 확인하기 위하여 activity staining-g- 실시하였다. activity staininge separating gel 을 15 mM a-naphthyl phosphate (Sigma, US A) 와 fast blue BB dye(l mg/1 ml.
- 중장내 ALP의 분포를 알아보기 위하여 조직화학적 방법을 이용하였다. 성체에서 중장을 적출하여 4% formal-dehyde와 1 % glutaraldehyde가 포함된 50 mM.
- 지렁 이의 중장을 적출하기 위하여 지렁 이를 70% ethanol 로 마취시킨 후 두부에서 미부로 절개하여 체절 33번-52 번까지의 중장을 적출하였다.
- 효소 활성에 미치는 온도의 영향을 알아보기 위하여ALP를 포함하는 효소원 100 μ1를 4℃, 15℃, 25℃, 37℃. 50℃, 65℃에서 10분간 배양한 후 기질 100nl (10 mM p- nitrophenyl phosphate)를 첨가하여 각 온도에서 15분간 반응시 켰다.
대상 데이터
- 낚시 미끼용 지렁 이 (EVsemk gdrei)를 구입하여 다른 종에속하는 지렁이를 제거한 후, 환대가 잘 발달된 성숙한 개체만을 선택하였다. 선택된 지렁이는 증류수로 수 차례 세척하였다.
- 이때 유속은 20ml/hr 로 하였고. 분획당 1.5 ml 씩 수집하여 각 분획의 효소 활성도를 측정한 후, 효소 활성이 높게 나타난 분획만을 실험에 사용하였다. 최종 부분정제도 는 약 100배 정도였다.
- 실험에 사용된 지렁이는 장내 미생물의 영향을 최소화하기 위하여, 지렁 이 생리식 염수 (25 mM NaCl, 2.5 mMK2SO4, 67.5 mM Na2SO4, 0.5 mM MgSO4, 13.25 mM CaCl, , 5 mM Tris, 2.7 mM glucose)로 적신 filter paper에서 24시간배양하여 중장내 물질을 배출시킨 후 사용하였다.
이론/모형
- 단백질 정 량은 Bradford (1976)의 방법에 따라 측정 하였다. 이때 표준 단백 질로 bovine serum albumin (Bio-Rad)을사용하였다.
- 각 기질을 반응시킨 다음, 효소활성의 대사산물인 무기인의 농도를 측정하여 비교하였다. 무기인은 Fiske와 Subbarow(1925)의 방법에 의해 정량하였다. 그 방법은 다음과 같다.
- 중장 ALP는 Park 등(1996)에 의한 방법으로 분리하였다. 분리 된 각 조직 은 Glass-teflon homogenizer (Wheaton) 로 균질액을 만든 후 13.
- 지렁 이는 Park 등(1996)에 의한 방법으로 사육하였다. 낚시 미끼용 지렁 이 (EVsemk gdrei)를 구입하여 다른 종에속하는 지렁이를 제거한 후, 환대가 잘 발달된 성숙한 개체만을 선택하였다.
성능/효과
- ALP의 둥전점을 측정하기 위해 isoelecnic focusing의 방법을 이용하여 Rotofor Cell (0.5% ampholyte, pH range 3-10)로 확인한 결과 등전점이 약 4.0-4.3으로 산성 단백질인 것으로 확인되었다(Fig. 3).
- Neuramnidase와 Phosphatidylinositol-specific phosphatase C (Ptdlns-PLC)를 처리한 실험 결과 neuraminidase Ptdins-PLC의 효소에 의해서 ALP의 활성은 영향을 받지 않았으며, gel 상에서의 ALP의 이동성에도 차이가 나타나지 않았다 (Fig. 4).
- 2). Rotofor Cell-g- 이용하여 isoelectro focusing에 의 한등전점 (pl)을 관찰한 결과 중장 ALP의 등전점은 약 4.0- 4.3 정도로 산성 단백질인 것으로 나타났다(Fig. 3). 이러한결과는 포유류 liver-type ALM] 등전점 (4.
- neuraminidase를 처리하고 처리전과 후의 이동성변화를 전기영동의 방법으로 관찰하였다. 골격과 간장-특이성 ALP는 neuraminidase의 처리에 의해 이동성에 차이가 나타났으며, 그 정도는 ALP가 기원한 조직에 따라 차이 가 있었다. 그러나 장 ALP에서는 이동성의 차이를 관찰할 수 없었다.
- 본 연구에서 Eisenia andrei 중장 ALP의 온도에 대한 활성 변화는 37℃에서 최대 활성을 나타냈으며. 낮은 온도와 높은 온도 모두에서 비교적 낮은 열안정성을 갖는 것으로 나타났다
- (Hoffmann-Blume 등 1991). 본 연구 결과에 으]해서는 위와 같은 분비성 ALP의역할을 직접적으로 증명할 수는 없으나 지렁이 중장 내로분비된 ALP가 phosphoprotein을 제외한 대부분의 phosphorylated macromolecule-g- 기질로 하여 비교적 높은 활성을 유지한다는 사실은 위와 같은 생리적 기능을 수행할 가능성을 뒷받침 해주고 있다.
- terrestris chloragogue tissue에 Barogasterannandal는 상피세포에 대부분의 ALP를 포함하고 있는 것으로 보고되었다. 본 연구결과 Eisia cmdrei는 B. anna- 의 ALP 분포와 유사한 것으로 관찰되 었으며 Epith-elium-polarized (EP) type인 것으로 사료된다. (Fig.
- 또한, Jose 등 (1991)은 rat 의 골격 ALP 연구에서 골격 ALP는 4-37T 사이의 온도에서는 비교적 안정하나 37℃ 보다 높은 온도에서는 불안정하여 골격 ALP의 낮은 열안정성을 보고하였다. 본 연구에서 Eisenia andrei 중장 ALP의 온도에 대한 활성 변화는 37℃에서 최대 활성을 나타냈으며. 낮은 온도와 높은 온도 모두에서 비교적 낮은 열안정성을 갖는 것으로 나타났다
- 본 연구에서 도 Eisenia andrei 중장 ALP에 neuraminidase를 처리한 결과 ALP 활성과 이동성의 변화를 관찰할 수없었다(Fig. 4A). 이러한 결과는 sialic acid side chain이 열안정성을 증가시킨다는 사실에 비추어볼 때 지렁이 중장 ALP는 sialic acid 잔기가 결여되어 있으며, 이로 인하여 낮은 열안정 성을 갖는 것으로 생각된다.
- 온도가 효소활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 효소 활성도 측정시 배양온도를 변화시켜 중장 ALP의 활성을 측정한 결과, 중장 ALP의 활성은 온도가 상승함에 따라 37℃에서 최대 활성을 보였다. 그러나 37℃ 이후는 온도가 상승함에 따라 ALP 활성은 급격히 감소하였으며, 65 ℃에서는 ALP 활성이 거의 나타나지 않았다(Fig.
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