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문제 정의
- 筋) 1985 년 일본 히로시마의 원폭피해자들중 어성초를 지속적으로 마신 사람들은 목숨을 구했다고 하였다?) 현재 많은 연구자들이 천연물을 이용하여 중금속 해독 물질을 연구하고 있으며, ") 최근에는 엑기스, 환, 건조 분말 등 여러 가지 형태로 제품화되어 많은 사람들이 건강보조식품으로 이용되고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 이렇게 이용되고 있는 어성초를 물로 추줄하여 카드뮴에 중독 된 흰쥐에게 경구 투여한 후, 조직 내 카드뮴의 농도와 metallothionein의 농도 및 체중 변화를 측정하고, 카드뮴 세포독성효과를 1차 검색 방법인 비색법중 가장 민감하고 안정적인 MTT 정량분석법과 SRB 정량분석법을 이용하여 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 0% acetic acid로 5회 세척하고 완전히 건조하였다. 10 nM Ins base로결합된 protein stain을 녹인 후, 흡광도는 분광광도계 ELISA reader(Spectra MAX 250, U.S.A, 520 nm) 로 측정하여 SRB50군과 비교하였다.
- 3T3 섬유모세포에 대한 카드뮴의 SRB50 농도를 결정하였다. MTT 정량의 방법과 동일하게 대조군, SRB®군 및 실험군으로 하여 어성초 물추출물이 첨가된 배양액에서 48시간 배양한 후, 배양액을 버리고 5회 세척한 후, 0.
- plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 3T3 섬유세포에 대한 카드뮴의 MTT50(midpoint inhibition value) 농도를 결정하였다. 수복효과 실험은 6개군으로구분하였는 데, 배양액만으로 배양한 군을 대조군, MTT50량의 카드뮴과 배양액으로 배양한 군을 MTTjo 군, MTT%량과 각각의 어성초 물추출물의 10~2~10-5 mg/m/ 농도를 배양액에 넣어 배양한 군은 실험 군으로 하여 48시간 동안 배양 완료 후 분석당일 조제한 MTT(Sigma) 50 临/mZ가 함유된 배양액을 well당 1 m血씩 넣어 3시간 배양하였다.
- 4. MTT 및 SRB분석은 배양액만으로 배양한 군을 대조군, 세포독성실험에 의하여 결정된 IC50농도의 카드뮴과 어성초 물추출물을 배양액에 넣어 배양한 군을 실험군으로 분류하여 실험하였다. 모든 군은 동일한 조건에서 48시간 배양한 후, MTT 흡광도 및 SRB 농도를 측정하고, 광학현미경적 관찰을 실시하였다.
- 3T3 섬유모세포에 대한 카드뮴의 SRB50 농도를 결정하였다. MTT 정량의 방법과 동일하게 대조군, SRB®군 및 실험군으로 하여 어성초 물추출물이 첨가된 배양액에서 48시간 배양한 후, 배양액을 버리고 5회 세척한 후, 0.4% sulforhodamine B를 200 pZ씩 첨가하여 1 시간 동안 실온에 방치한 다음, 1.0% acetic acid로 5회 세척하고 완전히 건조하였다. 10 nM Ins base로결합된 protein stain을 녹인 후, 흡광도는 분광광도계 ELISA reader(Spectra MAX 250, U.
- 총 25마리를 사육하였다. 고령 pellet 사료(삼양유지)와 음용수는 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였으며, 사육기간 (투여기간)은 4주로 하였다.
- MTT 및 SRB분석은 배양액만으로 배양한 군을 대조군, 세포독성실험에 의하여 결정된 IC50농도의 카드뮴과 어성초 물추출물을 배양액에 넣어 배양한 군을 실험군으로 분류하여 실험하였다. 모든 군은 동일한 조건에서 48시간 배양한 후, MTT 흡광도 및 SRB 농도를 측정하고, 광학현미경적 관찰을 실시하였다. 어성초 물추출물이 MTT 농도 및 SRB 농도에서 정량적으로 유의성 있는 해독경감효과를 나타냈으나, 농도에 따른 흡광도의 변화는 SRB 정량분석법이 MTT 정량분석법보다 민감하게 감소하는 경향을 볼 수 있었다.
- 배양액으로는 MEM(Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum(Gibco, U.S.A)과 penicillin G(25 unit/mZ), streptomycin(0.25 ag/m/)를 첨가하여 사용하였다. 각 세포의 배양은 온도 37°C, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기 (CO? incubatoi; SheUab, U.
- 수복효과 실험은 6개군으로구분하였는 데, 배양액만으로 배양한 군을 대조군, MTT50량의 카드뮴과 배양액으로 배양한 군을 MTTjo 군, MTT%량과 각각의 어성초 물추출물의 10~2~10-5 mg/m/ 농도를 배양액에 넣어 배양한 군은 실험 군으로 하여 48시간 동안 배양 완료 후 분석당일 조제한 MTT(Sigma) 50 临/mZ가 함유된 배양액을 well당 1 m血씩 넣어 3시간 배양하였다. 배양후 배양액을 버리고 dimethylsulfoxide①MSO)를 2 m〃weH씩 넣어 5분간 실온 방치후, MTT formazan을 용해한 후 분광광도계 ELISA reader(Spectra MAX 250, U.S.A, 520 nm)로 흡광도를 측정하여 MTT%군과 비교하였다.
- 세포배양 - 어성초 추출물에 대한 해독작용을 측정하기 위하여 NIH 3T3 섬유모세포를 사용하였다. 배양액으로는 MEM(Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum(Gibco, U.
- 세포의 광학현미경적 관찰 - 광학현미경으로 세포를 관찰하기 위하여, NIH 3T3 섬유모세포는 MTT정량및 SRB정량을 하기 전에 도립현미경(Inverted micro scope, Olympus)으로 관찰하고, 사진을 촬영하였다.
- 세포의 배양은 CO2 incubator(Shellab Co., USA)를 사용하였고, 세포수의 계산은 TurkS 혈구계산기를 사용하였으며 , 현미경은 도립 현미경 (Inverted Microscope, Olympus)을 사용하였다. MTT 정량 및 SRB정량은 ELISA reader(Spectra Max 250, U.
- 3T3 섬유세포에 대한 카드뮴의 MTT50(midpoint inhibition value) 농도를 결정하였다. 수복효과 실험은 6개군으로구분하였는 데, 배양액만으로 배양한 군을 대조군, MTT50량의 카드뮴과 배양액으로 배양한 군을 MTTjo 군, MTT%량과 각각의 어성초 물추출물의 10~2~10-5 mg/m/ 농도를 배양액에 넣어 배양한 군은 실험 군으로 하여 48시간 동안 배양 완료 후 분석당일 조제한 MTT(Sigma) 50 临/mZ가 함유된 배양액을 well당 1 m血씩 넣어 3시간 배양하였다. 배양후 배양액을 버리고 dimethylsulfoxide①MSO)를 2 m〃weH씩 넣어 5분간 실온 방치후, MTT formazan을 용해한 후 분광광도계 ELISA reader(Spectra MAX 250, U.
- A)를 사용하였다. 실험을 위하여 배양한 Hask의 세포를 0.25% trypsin으로 처리하여, Itirk형 혈구계산기를 이용하여 세포 수가 5X104 cells/mZ가 되도록 세포부유액을 만들었다.
- 1% bromothymol blue(BTB) indicator 용액을 2~3방울 넣고, 용액의 색이 황색에서 녹색으로 변할때까지 ammonium hydroxide용액으로 중화시켰다. 여기에 10 m2의 40% ammonium sulfete 용액과 10 mZ의 sodium diethyl dithiocarbamate(DDTC) 용액을 넣고 세차게 흔든 후수 분간 방치한 다음, 20 mH의 MIBK(methyl isobutyl ketone)층을 가하고 흔든 후 방치한 다음, MIBK층을 취하여 120°C hot plate상에서 휘산시켜 0.1N HC1로용해한 후, wave length 228.8 nm, slit path 1.3 nm, lamp current 9 nm의 분석조건하에서 원자흡광광도계(Hitachi Z-5700X 이용하)여 장기내의 카드뮴 함량을 측정하였다.
- 2 m/를 가하여 과량의 카드뮴과 MT이외의 모든 bioligaimd를 제거하고, 100°C 수욕탕에 1분간 정치시켜 Cd-bound hemoglobin을 변성시킨 후, 원심분리하여 상층 액을 취흐]였다. 이와같이 rat RBC hemolysate첨가와 열처리 및 원심분리 과정을 3회 반복하여, MT 분획층을 분리하여 측정하였다. 최종적인 MT농도 계산은 원자흡광광도계에 의해 검출된 카드뮴의 양을 기초로, MT분자량 6, 050 g 당 카드뮴 6 g 원자가 포함되는 것으로 환산하여 조직 ng 당 mgMT 농도를 표시하였다.
- 체중측정 -모든 동물에 대해서 시험개시일로 부터시험종료일까지 매주 2회 측정하였다.
- 이와같이 rat RBC hemolysate첨가와 열처리 및 원심분리 과정을 3회 반복하여, MT 분획층을 분리하여 측정하였다. 최종적인 MT농도 계산은 원자흡광광도계에 의해 검출된 카드뮴의 양을 기초로, MT분자량 6, 050 g 당 카드뮴 6 g 원자가 포함되는 것으로 환산하여 조직 ng 당 mgMT 농도를 표시하였다.
- 흰쥐 장기내의 카드뮴의 농도 측정 -실험 24시간 전부터 절식시킨 흰쥐를 에테르로 마취시키고, 신장과 간장을 적출하여 3차 증류수로 3회 세척하여, 진공건조 기(110°C)내에서 24시간 건조시킨 후, 200°C hot plate상에서 각각 질산, 황산, 및 과염소산을 이용한 습식탄화방법에 의하여 유기물을 분해시키고, 25%의 ammonium citrate용액 10 m/와 0.1% bromothymol blue(BTB) indicator 용액을 2~3방울 넣고, 용액의 색이 황색에서 녹색으로 변할때까지 ammonium hydroxide용액으로 중화시켰다. 여기에 10 m2의 40% ammonium sulfete 용액과 10 mZ의 sodium diethyl dithiocarbamate(DDTC) 용액을 넣고 세차게 흔든 후수 분간 방치한 다음, 20 mH의 MIBK(methyl isobutyl ketone)층을 가하고 흔든 후 방치한 다음, MIBK층을 취하여 120°C hot plate상에서 휘산시켜 0.
- 흰쥐에게 카드뮴 경구투여시, 어성초 물 추출물의 경구 투여한 후 카드뮴의 독성에 대한 해독경감 효과와 카드뮴이 3T3 섬유모세포에 미치는 세포독성을 검정하고, 카드뮴 IC5O(MTT5O 및 SRB%)에 의하여 손상된 3T3 섬유모세포의 재생효과에 대하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 검액의 조제 - 본 연구에 사용된 생약제인 어성초는 전북 익산시 팔봉동에서 채취하여, 어성초의 잎을 잘게 썰어 음건한 후, 건조된 어성초의 잎을 분쇄하여 500 g을 5000 m/ 둥근 플라스크에 물 2500 i血를 넣고, 75°C에서 4시간 동안 환류 추출하였다. 이와같이세 번 반복하여 얻은 추출물을 0.
- 세포배양에 사용한 MEM(Minimum Essential Medium), fetal bovine serum, penicillin G, strep tomycin, fungizone 시약은 Gibcc제 GR급이었으며, MTT정량 및 SRB정량에 사용한 시약은 Sigma사에서구입하였다. 세포의 배양은 CO2 incubator(Shellab Co.
- 시약 및 기기 - 어성초 추출물에 사용된, 용매로는 3 차 증류수를 사용하였으며, 흰쥐 신장과 간장내의 카드뮴 함량 분석에 사용된 시약은 GR을 사용하였고, Cd표준용액(CdCL)은 Sigma제를 사용하였다. 전처리에 사용된 초자기구는 질산으로 세척하여 중금속을 완전히 제거한 후 사용하였으며, 분석용 기기는 원자흡광광도계 (Hitachi Z-5700)을 사용하였다.
- 실험동물 - 실험에 사용된 동물은 원광대학교 의과대학 실험동물 사육장에서 사육한 생후 6~8주 정도의 Sprague-Dawley계 흰쥐 숫컷으로 체중은 150±20 g 을 사용하였으며, 실험시작 1주전부터 안정화 시켰고, 사육은 온도 22°C±2°C, 습도는 50%±10%의 동물사육실에서 흰쥐용 깔집을 깔고 1군당 5마리씩으로 하였으며, 2개군은 대조군과 카드뮴 대조군, 3개군은 실험군으로 총 25마리를 사육하였다. 고령 pellet 사료(삼양유지)와 음용수는 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였으며, 사육기간 (투여기간)은 4주로 하였다.
- 실험재료 - 어성초는 1998년 8월 전북 익산시 팔봉동에서 채취하여 음건한 후 사용하였다. 실험에 사용된 식물체는 원광대학교 한의학전문대학원 천연물 학교 실에 보관되어 있다.
- 전처리에 사용된 초자기구는 질산으로 세척하여 중금속을 완전히 제거한 후 사용하였으며, 분석용 기기는 원자흡광광도계 (Hitachi Z-5700)을 사용하였다.
- 카드뮴 및 어성초 추출액 투여 - 실험에 사용한 중금속은 cadmium chloride(CdCl2; Japan Wako Chemical 사 GR급)이며, 어성초 물 추출물을 흰쥐 구강내 투여용량은 Table Ⅰ과 같이 5개군으로 구분하였으며, 1군당 5마리씩으로 실험하였다.1°)
데이터처리
- 통계학적 해석 -실험결과의 통계학적처리는 Students t-test를 이용하였으며, p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- MTT정량분석법 -Mosmaim의 방법】기에 따라 세포를 5X104 cells/welP] 되도록 조절하여 1 mZ씩 24 well plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 3T3 섬유세포에 대한 카드뮴의 MTT50(midpoint inhibition value) 농도를 결정하였다.
- SRB정량 분석법 -Skehag 등'»의 방법에 따라, 세포를 5X104 cells/well이 되도록 조절하여 1 m/씩 24 well plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 3T3 섬유모세포에 대한 카드뮴의 SRB50 농도를 결정하였다.
성능/효과
- 1. 흰쥐에게 어성초 물 추출물의 경구 투여용량이 증가할수록 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과는 증가하였으며, 신장에서보다 간장에서 해독경감효과가 좋았다.
- 2. 흰쥐 신장 및 간장의 MTS) 농도는 간장에서 보다 신장에서 우수한 결과를 보였으며, 신장에서는 어성초 물 추출물의 경구 투여 농도가 10 mg/kg 이상이 되면 MT 형성은 어성초 물 추출물의 투여농도가 증가하여도 크게 증가하지는 않았다.
- 3. 흰쥐의 체중변화는 어성초 물 추출물의 경구 투여용랑이 증가할 수록, 흰쥐의 체중변화도 증가흐}는 경향을 보였으나, 3주 이후에는 체중의 증가가 적게 나타났다.
- 3T3 섬유모세포를 여러농도의 카드뮴으로 처리한 후, MTT 및 SRB의 흡광도를 측정하고, 대조군의 흡광도를 100%로 하여 마이크로몰농도에 대한 흡광도를 비례적으로 측정한 결과, MTT 및 SRB의 흡광도는 카드뮴의 농도에 의존하여 감소하였으며, IC50인 mtt50 은 33.04 pM 및 SRB50은 54.72 皿이었다.成 MTT 정량분석법을 이용하여 MTT 농도를 측정한 결과, 어성초 물 추출물의 10-2 mg^mZ—lO-3 mg/m/농도에서는 100%~98.
- 01 의 유의성을 보였다.分 간장내 MT 촉진과 비교해보면(Eble V), 어성초 물 추출물의 경구투여 시 신장에서 MT 촉진이 좋은 것으로 나타났다.
- 72 皿이었다.成 MTT 정량분석법을 이용하여 MTT 농도를 측정한 결과, 어성초 물 추출물의 10-2 mg^mZ—lO-3 mg/m/농도에서는 100%~98.9% 범위의 통계적으로 유의성 (p<0.001) 있는 카드뮴 해독경감효과를 나타냈으나, 다른 분석농도에서도 통계적으로 유의성이 없었다(Table Ⅷ).
- 간장에서도 신장과 같이 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 증가할 수록 흰쥐 간장내 카드뮴의 농도가 줄어드는 경향을 볼 수 있다. 신장내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과보다 간장내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과가 높게 나타났다. 어성초의 물 추출물 투여농도가 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg에서 통계적으로(p<0.
- 이 결과를 볼 때 흰쥐 신장내 MT의 촉진은 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 증가할 수록 신장내 MT형성도 증가하는 경향을 보였다. 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 10 m以kg에서 통계적으로(p<0.05) 유의성을 보였으며, 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 20 mg/kg, 40 mg/kg에서 p<0.01 의 유의성을 보였다.分 간장내 MT 촉진과 비교해보면(Eble V), 어성초 물 추출물의 경구투여 시 신장에서 MT 촉진이 좋은 것으로 나타났다.
- 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 증가함에 따라서 체중변화의 기폭은 심하였으나 체중이 감소하지는 않았다. 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 40 mg/kg에서 카드뮴의 독성에 대한 해독경감 효과가 가장 우수하게 나타났고, 어성초 물 추출물의 투여 기간이 2주까지가 카드뮴 독성에 대한 해독경감 효과가 뚜렸하였으며, 2주 이후에는 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과는 조금씩 감소하였다. 일반적으로 어성초의 물 추출물의 농도가 증가함에 따라, 주별 흰쥐의 체중의 증가도 나타났으며, 이 체중 변화 중에 일주일후의 체중증가가 가장 현저히 증가하는 경향을 알 수 있었다.
- C). 어성초 물추출물을 이용하여, 카드뮴 해독경감효과를 측정한 보고가 없어 직접적인 비교는 할 수 없으나, 본 실험결과에 의하면, 카드뮴에 대한 세포독성을 어성초 물추출물이 억제하는 해독경감 효과가 있는 것으로 인정된다. 이에 어성초의 물 추출물의 카드뮴에 대한 해독물질이 함유되어 있을 것으로 판단되어 분광화학적인 방법으로 분자구조를 규명하는 노력을 계속할 계획이다.
- 모든 군은 동일한 조건에서 48시간 배양한 후, MTT 흡광도 및 SRB 농도를 측정하고, 광학현미경적 관찰을 실시하였다. 어성초 물추출물이 MTT 농도 및 SRB 농도에서 정량적으로 유의성 있는 해독경감효과를 나타냈으나, 농도에 따른 흡광도의 변화는 SRB 정량분석법이 MTT 정량분석법보다 민감하게 감소하는 경향을 볼 수 있었다. 광학현미경적 소견에서도 세포의 재생이 뚜렸하였다.
- 신장내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과보다 간장내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과가 높게 나타났다. 어성초의 물 추출물 투여농도가 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg에서 통계적으로(p<0.05) 유의성을 보였다. 이 결과를 볼 때, 어성초의 물 추출물이 카드뮴 착물의 배설로 인한 간장내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과가 나타났으며, 뇨와 변으로 배설된 것으로 판단된다.
- 01으로 나타났고, 일반적으로 어성초의 물 추출물의 경구 투여 농도가 증가할수록 흰쥐 신장 내 카드뮴의 농도가 저하된 것을 알 수 있다. 어성초의 물 추출물의 경구 투여 농도가 40 mg/kg에서 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과는 51.23 ±0.01 mg/kg (81.06%)로 가장 우수한 결과를 보였다.分 하지만 간장 내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과와 비교해보면, 신장 내 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과는 낮게 나타나는 결과를 볼 수 있다.
- 分 하지만 간장 내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과와 비교해보면, 신장 내 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과는 낮게 나타나는 결과를 볼 수 있다. 어성초의 물 추출물의 투여농도가 20 mg/kg, 40 mg/kg에서 통계적으로 유의성을 보였다(p<0.05).
- 00%) 으로 나타나는 것을 볼 수 있다. 이 결과를 볼 때 흰쥐 신장내 MT의 촉진은 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 증가할 수록 신장내 MT형성도 증가하는 경향을 보였다. 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 10 m以kg에서 통계적으로(p<0.
- 05) 유의성을 보였다. 이 결과를 볼 때, 어성초의 물 추출물이 카드뮴 착물의 배설로 인한 간장내 카드뮴 독성에 대한 해독경감효과가 나타났으며, 뇨와 변으로 배설된 것으로 판단된다.7-9, 13)
- 이상과 같이 어성초 물 추출물의 경구 투여시켰을경우 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과와 카드뮴에 의하여 손상된 3T3 섬유모세포의 재생효과가 있는 것으로 판단된다.
- 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 40 mg/kg에서 카드뮴의 독성에 대한 해독경감 효과가 가장 우수하게 나타났고, 어성초 물 추출물의 투여 기간이 2주까지가 카드뮴 독성에 대한 해독경감 효과가 뚜렸하였으며, 2주 이후에는 카드뮴의 독성에 대한 해독경감효과는 조금씩 감소하였다. 일반적으로 어성초의 물 추출물의 농도가 증가함에 따라, 주별 흰쥐의 체중의 증가도 나타났으며, 이 체중 변화 중에 일주일후의 체중증가가 가장 현저히 증가하는 경향을 알 수 있었다. 이는 흰쥐의 카드뮴 축적에 대한 독성을 완화시킬 뿐만 아니라, 카드뮴 착물을 형성하여 배출을 촉진시키리라 사료된다.
- 07 mg/kg으로 나타났다. 카드뮴 대조군은 0.53±0.07 mg/kg으로 나타났으며, 어성초 물 추출물 경구 투여용량이 10 mg/kg에서는 0.54-0.01 mg/kg(1.89%)으로 MT의 촉진이 낮게 나타났으나, 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 40 mg/kg 이 되면 간장내 MT 촉진은 10 m以kg에 비해 약 7 배가 되는 것으로 나타났다. 통계적인 유의성은 어성초의 물 추출물의 투여농도가 20 mg/kg과 40 mg/kg 에서 p<0.
- 89%)으로 MT의 촉진이 낮게 나타났으나, 어성초 물 추출물의 경구 투여농도가 40 mg/kg 이 되면 간장내 MT 촉진은 10 m以kg에 비해 약 7 배가 되는 것으로 나타났다. 통계적인 유의성은 어성초의 물 추출물의 투여농도가 20 mg/kg과 40 mg/kg 에서 p<0.05로 나타났다.")체내에 중금속이 흡수될 경우 자체 해독기전으로 간장 및 신장조직에서 MT를 형성하여 조직내에서 독성이 강한 유리금속과 결합하여 수용성으로 전환시켜 배설함으로써 해독작용에 관여한다.
후속연구
- 어성초 물추출물을 이용하여, 카드뮴 해독경감효과를 측정한 보고가 없어 직접적인 비교는 할 수 없으나, 본 실험결과에 의하면, 카드뮴에 대한 세포독성을 어성초 물추출물이 억제하는 해독경감 효과가 있는 것으로 인정된다. 이에 어성초의 물 추출물의 카드뮴에 대한 해독물질이 함유되어 있을 것으로 판단되어 분광화학적인 방법으로 분자구조를 규명하는 노력을 계속할 계획이다.
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