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문제 정의
- 본 연구에서는 현호색의 methanol추출물과 hexane, chloroform, butanol 및 물 분획물에 대한 간 손상 보호효과를 검색하고 유의성 있는 효과를 나타낸 물 분획물을 이용하여 간손상 보호효과와 그 기전을 밝히고자 하였다. 즉 현호색이 간손상에 미치는 영향을 보기 위하여 혈액 중의alanine aminotransferase(ALT)#^, 사lolesterol 량 및 tHglyceride(TG)량과, 간조직의 cholesterol량, TG량, 지질과산화물 함량을 측정하고, 현호색의 간손상 보호효과의 기전을 밝히기 위해 phasel 대사에 관여하는 cytochrome P450(CYP)량과 calcium함량, phasell 대사에 관여하는 GSH량과 glutathione S-transrase(GST)활성, 항산화효소인 SOD활성, GPX활성 및 CAT활성을 측정하였다.
제안 방법
- ALT 활성도, Cholesterol 함량 및 TG 함량은 kit를 이용하여 분석하였다.
- CC1, 투여 24시간 후 적출한 간 조직 중의 일부를 취하여 phosphate buffer (pH 7.0)에 넣고 약 1분간 분쇄한 후 10% liver homogenate를 만들어 ki를 이용하여 분석하였다.
- CC1, 투여 24시간 후 흰 쥐를 ether로 마취시키고 복부 정중선을 절개하여 심장에서 채혈하였다. 이를 3000rpm에서 15분간 원심 분리시켜서 얻은 혈청을 검체로 사용하였다.
- Sample cell에 CO기체를 Ibubble/sec의 속도로 1분간 bubbling시킨 후 다시 450 nm와 490nm에서 CYP-CO binding complex의 흡광도를 측정하였다. CYP함량은 CYP-CO complex형성 전후의 각각 450 nm와 490 nm사이의 흡광도의 차이로 계산하였다.
- Carduus Marianus 주줄물과 각 분획물은 수득률에 따라 환산하여 0.5% CMC에 현탁하여 3일간 경구투여 하였다. CC1는 com oil을 vehicle로 하여 예비실험결과를 토대로 하여 0.
- Cytosol에 존재하는 SOD의 활성도는 Fridovich, I. 등*의 방법을 변형하여 시행하였다.
- 현 탁용액을 semimicrocuvette 1 씩 넣어 reference cell 과 sample cell로 하고 소량의 di thionite를 각 cell 에가한 후 450nm와 490nm에서 기준선을 정하였다. Sample cell에 CO기체를 Ibubble/sec의 속도로 1분간 bubbling시킨 후 다시 450 nm와 490nm에서 CYP-CO binding complex의 흡광도를 측정하였다. CYP함량은 CYP-CO complex형성 전후의 각각 450 nm와 490 nm사이의 흡광도의 차이로 계산하였다.
- 간균질액을 원심분리하여 o-cresolphthalein complexon과반응시킨 다음 25, 546nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 이 때 superoxide dismutase가 존재하면 생성된 superoxide anion 을 hydrogen peroxide로 전환시키므로 superoxide anion이 cytochrome c를 환원하는 작용을 저해한다. 따라서 cytochrome c의 환원작용이 저해되는 정도를 측정하여 SOLD활성도를 측정하였다.
- 즉 GSH가 cumene hydroperoxide와 반응하여 산화형 glutathione(GSSG)가 형성되고 GSSG가 NADPH를 산화시키면서 GSH으로 환원되므로 340 nm에서 NADPH환원량을측정하여 계산하였다.
- 시행하였다. 즉 과산화수소가 240nm에서 최대 흡광도를 나타내므로 CAT에 의해서 소모되는 과산화수소의 양을 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
- 즉 현호색이 간손상에 미치는 영향을 보기 위하여 혈액 중의alanine aminotransferase(ALT)#^, 사lolesterol 량 및 tHglyceride(TG)량과, 간조직의 cholesterol량, TG량, 지질과산화물 함량을 측정하고, 현호색의 간손상 보호효과의 기전을 밝히기 위해 phasel 대사에 관여하는 cytochrome P450(CYP)량과 calcium함량, phasell 대사에 관여하는 GSH량과 glutathione S-transrase(GST)활성, 항산화효소인 SOD활성, GPX활성 및 CAT활성을 측정하였다.
- 4)에 현탁시켰다. 현 탁용액을 semimicrocuvette 1 씩 넣어 reference cell 과 sample cell로 하고 소량의 di thionite를 각 cell 에가한 후 450nm와 490nm에서 기준선을 정하였다. Sample cell에 CO기체를 Ibubble/sec의 속도로 1분간 bubbling시킨 후 다시 450 nm와 490nm에서 CYP-CO binding complex의 흡광도를 측정하였다.
- 현호색을 Schem 1과 같이 methanol로 수욕상에서 4시간씩 5회 추출한 후 온시 여과하고 여액을 감압 농축하였다.현호색 methanol추출물을 hexane, chloroform 및 butanol로 계통분획하여 얻은 분획물은 감압 농축하여 밀봉 냉장 보관하였으며 필요시 적정농도로 환산하여 사용하였다.
대상 데이터
- Sprague-Dawley계 웅성 흰 쥐를 삼육실험동물 연구소 (주) 에서 공급받아 실내 온도 22±20에서 충분한 물과 고형사료(삼양사료)를 공급하여 환경에 적응시킨 후 체중 200~ 220g의 흰 쥐를 실험에 사용하였다.
- 기기로서 high speed centrifuge (DuPont Sorvall instrument, Model RC 5C), ice maker (Welbilt Co. USA), micropipette (Gilson medical electronics, France), UV-spectrophotometer (Hewlett Packard HP 8452A Diode-Array), ultracentrifuge (Beckman Co., Ltd. L-80), tissue tearor (Biospec products, Inc. Model 985-370) 및 evaporator (EyelaX 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 현호색은 경동 시장 내 한약 건재상으로부터 구입하였다.
- 실험에 사용한 시약으로서 carbon tetrachloride(Duksan Pharmaceutical Co., Korea), ALT kit, total bilirubin kit, albumin kit, TP kit, 사lolesterol kit, TG kit (Yeongdong Pharmaceutical Co., Korea), Tris acetate, EDTA, Tris base, glycerol, dithionite, foline ciocalteau's phenol reagent, bovine serum albumin, thiobarbituric acid, 1, 1, 3, 3-tetraeth- oxypropane, xanthine, cytochrome c, xanthine oxidase, NADPH, sodium dithionite, cumene hydroperoxide, hydrogen peroxide, 1 -chloro-2, 4-dinitrobenzen(CDNB), GSH, 1, 1- diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 5, 5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB), L-ascorbic acid(Sigma chemical Co., StLouis, MO, USA)을 사용했으며 기타시약 및 추출 용매는 시판 특급시약을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균치와 표준편차를 계산하고, 각 군간의 차이는 Student's t-test를 사용하여 p 값이 0.05미만일때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- Cytosol에 존재하는 GST 활성도는 Habig등"의 방법에 따라 시행하였으며 CDNB가 GST에 의하여 GSH와 포합되었을 때 고유의 노란 색이 탈색되는 속도를 측정함으로써 효소의 활성도를 산출하였다.
- Cytosol에 존재하는 GPX의 활성도는 Flohe등의 방법에 따라 시행하였다.
- Cytos이에 존재하는 CAT의 활성도는 Aebi의 방법에 따라 시행하였다. 즉 과산화수소가 240nm에서 최대 흡광도를 나타내므로 CAT에 의해서 소모되는 과산화수소의 양을 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
- Microsome에 존재하는 CYP 함량은 Omura등, 의 방법에 따라 시행하였다. Microsome을 단백질량이 l~2mg/mL이 되도록 0.
- Microsome의 지질과산화물 함량측정은 Uchiyama등의 방법에 따라 시행하였다.
- 간 조직중의 GSH량은 thi이기에 DTNB를 작용시켜 형성된 p-nitrothiophenol anion을 비색 정량 하는 원리로 Ellman의 방법에 따라 실시하였다.
성능/효과
- CC'가 간세포의 ER에서 대사되어 trichloromethyl radical과 같은 대사 중간체로 되어 지질과산화를 초래하고지질과산화물이 생체막에 구조적인 변화를 일으키며 내부의 효소계가 파괴됨으로써 혈액 및 조직내 과산화 지질함량이 증가하게 된다는 연구결과에 근거하여지질과산화물을 TBA법에 근거하여 측정한 결과 물 분획물 300 ㎎/㎏ 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였으므로 현호색 물 분획물이 free radicals 과다 생성으로 인한 조직 손상의 방어에 효과가 있는 것으로 생각된다.
- CO4 단독 투여군에 비하여 물 분획물 100㎎/㎏ 투여군과 물 분획물 300 ㎎/㎏ 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다. CC14 단독 투여군에서 간조직의 cholesterol 및 TG가 현저히 증가하였으며 물 분획물 100 m矽kg 투여군과 물 분획물 300 ㎎/㎏ 투여군의 간 조직의 cholesterol 및 TG의 감소는 간에서 지방대사 및 lipoprotein의 합성이 회복된 것 에 의한 것으로 생각된다.
- 는 약물 대사 효소 중에서 phasel 약물 대사 효소인 CYP와 NADPH-CYP reductase에 의해서 대사되며 매우 반응성이강한 대사 중간체를 형성하여 단백 합성 및 약물대사 효소 활성에 변화를 일으킨다. 따라서 독성물질의 대사에 관여하는 CYP의 활성 및 발현의 선택적인 억제는 조직 손상 및 암 발생을 차단할 수 있다(3) 물 분획물 300 ㎎/㎏ 투여군에서 CYP함량이 유의성있게 감소한 것으로 보아 현호색 물 분획물이 CYP함량을 감소시켜 CCL에 의한 조직 손상 방어에 효과가 있는 것으로 생각된다
- 체내에서 지방의 자동산화, 유기물의 산화 및 superoxide dismutase 에 의해 생성된 hydrogen peroxide# GPX와 함께 산소와 HQ로 전환시키는 작용을 하는 산화환원 효소의 일종으로 GPX에 비해 Km값이 높기 때문에 과산화수소의 농도가 높을 때 주로 작용한다. 본 실험에서는 CC14 단독 투여군에 비하여 모든 처치군에서 CAT의 활성도가 감소한 것을 볼 수 있으며 이는 oxidative stress의 감소에 의한 것으로 생각된다.
- 로전환시킨다. 본 실험에서는 GPX에 의한 항산화 작용의 증가가 기대되었으나 각 처치군 사이에서 큰 변화는 보이지 않았다.
- 이러한 결과로 볼 때 현호색 물 분획물 300㎎/㎏ 투여군에서 ALT활성도와 cholesterol함량의 감소, 간 조직 중의 TG 및 MDA 함량의 저하등으로 사염화탄소에 의한 간 손상 보호효과를 확인하였으며 이는 phasel 대사에 관여하는 CYP 함량의 감소와 CCB로서의 작용 및 phasell 대사에 관여하는 GST 활성도의 증가에 기인한 것으로 생각된다. 또한 항산화 효소의 감소는 CYP함량의 감소로 인하여 사염화탄소의 대사가 감소되어 free radicals의 생성이 감소흐} 여유도되지 않는 것으로 생각된다.
- 0 mg/g liver, Carduus marianus ext. 투여 군은 4.6+ 0.8 mg/g liver로 CC14 단독 투여군에 비하여 모든 처치군에서 감소하는 경향을 보였다.
- 02 nmol/mg protein, Carduus marianus ext. 투여군은 1.24+0.11 nmol/mg protein으로 CC14 단독 투여군에 비하여 모든 처치군에서 감소하는 경향을 보였으며 물 분획물300 ㎎/㎏ 투여군과 Carduus marianus ext. 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 9 KA unit/L, Carduus Marianus ext. 투여군은 118.7±53.7 KA imit/L로 CC14 단독 투여군에 비하여 물 분획물 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 8 KA unit/L, Carduus Marianus ext. 투여군은 118.7±53.7KA imit/L로 CCe 단독 투여군에 비하여 methanol 추출물 1000 ㎎/㎏ 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 9【Jnit/mg protein, Carduus marianus ext. 투여군은 29.(±7.45 Unit/mg protein正로 CC1_ 단독 투여군에 비하여 모든 처치군에서 감소하는 경향을 보였으며 특히 물 분획물 100 ㎎/㎏ 투여군과 Carduus marianus ext. 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 0mg/dL, Carduus marianus ext. 투여군은 35.0± 17.5 mg/dL로 CC14 단독 투여군에 비하여 물 분획물 100 ㎎/㎏ 투여군에서 유의성 있는 증가를보였다.
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