선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- Agrobacterium mmefaciens를 매개로 한 형질전환 과정에 서 제균제로 사용되고 있는 항생제인 carbenicillin이 담배 (Nicotiana tabacum L. cv. BY-4) 잎절편 배양 시 기관분화 에 미치는 영향을 검토하였다. BAP와 kinetin을 각각 0.
- 또한 실제 배양 중에 사용되고 있는 생장조절제의 종류 및 조합에 따른 carbenicillin^ 영향에 대한 상세한 관 찰은 부족한 실정이다. 그러므로, 본 연구는 담배의 carbenicillin 첨가에 따른 생장조절제의 영향을 조사하여 효율 높은 형질전환 배양계를 개발하는 데 있어 기초자료를 얻을 목적 으로 수행하였다.
제안 방법
- Agrobacterium 감염조직으로부터 균을 제거하기 위하여 일반적으로 사용되고 있는 500 mg/L의 carbenicillin 처리가 배양조직에서 신초형성을 억제하는 auxin과 유사한 효과가 있다는 사실을 고려하여 식물체 재분화 조건을 조사하였다. 그 결과, 0.
- Carbenicillin이 미세하게 캘러스 형성을 촉진하였기 때문에 auxin과 혼용하여 캘러스 형성효과를 검토하였다. MS 배지에 0.
- MS 기본배지에 BAP와 kinetin을 각각 0.5 mg/L 첨가한 후 carbenicillin 0, 250, 500, 1000, 2000 mg/L 농도가 포함된 배지에 엽조직을 치상하고, 배양 4주 후에 분화된 길이 2 mm 이상의 신초 수를 조사하였다.
- MS 기본배지에 NAA와 2, 4-D를 각각 0.5 mg/L 첨가한 후, carbenicillin 0, 250, 500, 1000, 2000 mg/L의 농도로 처리한 배지에 상기와 동일하게 엽조직을 치상하였다. 배양 4주 후에 치상된 조직으로부터 캘러스의 생중량을 조사하였다.
- 건조시킨 시료는 preculture 배지 상에서 36시간 공조배양 하였다. 공조배양한 잎절편은 상기 여 러 농도의 BAP와 500 mg/L carbenicillin을 각각 혼합첨가한 MS배지에 치상하여 배양 5 주 후에 분화된 2 mm 이상 되는 신초수와 생중량을 조사하였다. 또한 제초제 저항성 유전자의 도입여부를 확인하기 위해서 재분화된 유식물체를 선발, bialaphos 20 mg/L가 포함된 MS 배지에 유식물체를 이식하여 식물체의 고사여부를 관찰하였다.
- Agrobacterium법을 이용하여 식물에 형질전환을 시도할 경우 담배를 포함한 대부분의 식물에서 균을 제거하기 위하 여 500 mg/L의 carbenicillin을 주로 사용하고 있다. 그러므 로 BAP 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/L가 포함된 MS 배지에 500 mg/L의 carbenicillin을 첨가 또는 무첨가 한 후, 배양 4 주 후 신초 수와 생중량을 조사하였다.
- 공조배양한 잎절편은 상기 여 러 농도의 BAP와 500 mg/L carbenicillin을 각각 혼합첨가한 MS배지에 치상하여 배양 5 주 후에 분화된 2 mm 이상 되는 신초수와 생중량을 조사하였다. 또한 제초제 저항성 유전자의 도입여부를 확인하기 위해서 재분화된 유식물체를 선발, bialaphos 20 mg/L가 포함된 MS 배지에 유식물체를 이식하여 식물체의 고사여부를 관찰하였다.
- 5 mg/L 첨가한 후, carbenicillin 0, 250, 500, 1000, 2000 mg/L의 농도로 처리한 배지에 상기와 동일하게 엽조직을 치상하였다. 배양 4주 후에 치상된 조직으로부터 캘러스의 생중량을 조사하였다.
- 소독한 종자는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지를 사용한 한천배지에 파종하여 10주째 식물체의 2 ~4엽의 엽신부위를 직경 4 mm의 코르크 보러로 채취하여 치상하였다. 배지는 MS 기본배지 성분에 3% sugar, 0.8% 한 천을 첨가하였고, pH 5.8로 적정하였다. 본 실험의 모든 배양 은 25±1℃, 연속광 (30 pmol • m 2 • s'1) 조건에서 실시하였 다
- 상기에서와 같이 carbenicillin0] 신초분화를 억제하였으므 로 실제 형질전환 후 제균과정에서 이용되고 있는 carbenicillin 농도인 500 mg/L에 BAP를 혼합 처리하여 형성된 신 초수의 변화를 조사하였다. 그 결과 배양 4주째 형성된 신초 수는 BAP 농도 전체에 걸쳐 carbenicillin 처리구에서 carbenicillin 무처리구보다 신초 수가 감소하였다 (Table 3, Figure 4A, B).
- 생장조절제가 첨가되지 않고 carbenicillin 0, 250, 500, 1000, 2000 mg/L가 첨가된 MS 배지에 직경 4 mm의 잎절편을 치상하고 배양 4주 후에 캘러스 형성 유무를 관찰하였다.
- BY-4) 종자를 2% sodium hypochlorite 용액에서 15분간 표면소독하여 멸균수에서 4회 수세 하였다. 소독한 종자는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지를 사용한 한천배지에 파종하여 10주째 식물체의 2 ~4엽의 엽신부위를 직경 4 mm의 코르크 보러로 채취하여 치상하였다. 배지는 MS 기본배지 성분에 3% sugar, 0.
- Agrobacterium twnefaciens 의 균주는 EHA101 로 pGPTV- HB를 형질전환시켜 사용하였다. 형질전환은 Bae 등 (1994) 과 Horsch 등 (1985)의 방법을 참고하여 채취한 잎절편을 BAP 0.25, 0.5, 2.0, 4.0 mg/L로 첨가한 MS 배지 상에서 24시간 동안 preculture 하였다. 이 잎절편을 Agro bacterium 균으로 3분간 감염시킨 후 여과지에서 건조시켰다.
대상 데이터
- 1998)로서 T-DNA 내부에 hygromycin phosphotransferase (Hyg*) 와 phosphinothricin acetyl transferase (Bar) 유전자를 포함하고 있으며 T-DNA 외부에 spectinomycin 저항성 유전자를 가지고 있다. Agrobacterium twnefaciens 의 균주는 EHA101 로 pGPTV- HB를 형질전환시켜 사용하였다. 형질전환은 Bae 등 (1994) 과 Horsch 등 (1985)의 방법을 참고하여 채취한 잎절편을 BAP 0.
- 담배 (Nicotiana tabacum L. cv. BY-4) 종자를 2% sodium hypochlorite 용액에서 15분간 표면소독하여 멸균수에서 4회 수세 하였다. 소독한 종자는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지를 사용한 한천배지에 파종하여 10주째 식물체의 2 ~4엽의 엽신부위를 직경 4 mm의 코르크 보러로 채취하여 치상하였다.
- 또한 carbenicillin의 auxin 유사효과는 동일 식물체 내의 기관 부 위에 따라서도 다르게 나타나고 있으므로 (미발표자료), 효율 적인 형질전환을 위해서는 각 식물체의 조직부위에 따른 식 물체 재분화 과정에서 carbenicillin과 생장조절제의 상호작 용에 대한 영향을 다양하게 검토할 필요가 있다. 본 연구의 실험재료인 담배 (Nicotiana t사)acum)는 형질전환 연구에 있 어서 널리 이용되는 모델식물로 알려져 왔고, 담배의 품종에 따라서는 carbenicillin에 대한 auxin의 효과가 인정되었다는 보고도 있다. (Lin et al.
성능/효과
- BY-4) 잎절편 배양 시 기관분화 에 미치는 영향을 검토하였다. BAP와 kinetin을 각각 0.5 mg/L 첨가한 MS 배지에 250 mg/L~2000 mg/L의 carbenicillin을 처리한 배지에서 신초 수는 크게 감소하였다. 또한 carbenicillin을 단독첨가하거나 0.
- auxin과 혼용하여 캘러스 형성효과를 검토하였다. MS 배지에 0.5 mg/L 2, 4-D 또는 0.5 mg/L NAA와 여러 농도의 carbenicillin을 첨가한 결과, 2, 4-D 처리구에서는 250 mg/L, 500 mg/L 농도까지 캘러스의 형성이 촉진되었으나 1000 mg/L 이상의 농도에서는 캘러스 형성이 감소하였다 (Figure 2B). NAA 처리구의 경우 carbenicillin 무첨가구에서는 솜털 모양의 뿌리에 캘러스가 부착되다가 250, 500 mg/L의 carbenicillin이 포함된 배지에서 뿌리는 없어지고 캘러스가 증가하는 경향을 보이다가 1000 mg/L 이상의 고농도에서는 오히려 캘러스의 형성이 억제되었다 (Figure 2C).
- 상기에서와 같이 carbenicillin0] 신초분화를 억제하였으므 로 실제 형질전환 후 제균과정에서 이용되고 있는 carbenicillin 농도인 500 mg/L에 BAP를 혼합 처리하여 형성된 신 초수의 변화를 조사하였다. 그 결과 배양 4주째 형성된 신초 수는 BAP 농도 전체에 걸쳐 carbenicillin 처리구에서 carbenicillin 무처리구보다 신초 수가 감소하였다 (Table 3, Figure 4A, B). 또한 생중량도 BAP 0.
- Agrobacterium 감염조직으로부터 균을 제거하기 위하여 일반적으로 사용되고 있는 500 mg/L의 carbenicillin 처리가 배양조직에서 신초형성을 억제하는 auxin과 유사한 효과가 있다는 사실을 고려하여 식물체 재분화 조건을 조사하였다. 그 결과, 0.25-0.5 mg/L의 저농도의 BAP를 포함한 배지에 서는 잎절편 당 신초의 분화가 2개 미만이었으나 2.0~4.0 mg/L의 고농도의 BAP를 포함한 배지에서는 5.4~6.7개로 3 배 이상의 증가를 보였다. 그리고 잎절편의 생중량도 고농도 의 BAP가 포함된 배지가 저농도의 배지에 비해 그 증가폭이 높았다 (Table 4, Figure 5).
- 이와같이 Agrobacterium 감염 후 조직에서 신초 수가 크게 감소한 것은 여과지 위에서 조 직과 균의 공조배양, 감염시킨 조직의 건조와 같은 감염과정 이 치상조직의 신초형성에 부정적인 영향을 미친 것으로 볼 수 있다. 또한 Agrobacterium 감염 후 신초가 유도된 조직을 bialaphos 20 mg/L 포함된 배지에서 1 개월간 배 양한 결과, 녹 색을 나타낸 신초 수가 총 유도된 신초 수의 0.1 %로 BAP 농도에 따른 차이는 없었으나 녹색을 보인 절대적인 개체수는 3배 이상으로 관찰되었다 (자료 미제시). 이들 유식물체가 분자생물학적 방법을 통해 형질전환 식물체로 검증된 것은 아니지만 식물체의 재분화 비율이 높을수록 형질전환 식물체의 절대 수도 증가할 것으로 기대된다.
- 그 결과 배양 4주째 형성된 신초 수는 BAP 농도 전체에 걸쳐 carbenicillin 처리구에서 carbenicillin 무처리구보다 신초 수가 감소하였다 (Table 3, Figure 4A, B). 또한 생중량도 BAP 0.1 mg/L 이하를 제외한 모든 처리구에서 carbenicillin 무처리구에 비해 처리구에서 낮았다 (Table 3).
- 그러나, 2000 mg/L의 농도에서는 잎절편이 가벼운 갈변을 보였다 (Figure 2A). 또한 치상한 엽조직의 생중량은 carbenicillin의 농도가 250 mg/L, 500 mg/L일 때 각각 80.6±2.3 mg, 71.3 ±2.6 mg으로 무처리구의 50.7 ±2.3 mg 보다 증가폭이 큰 반면, 1000 mg/L 이상의 고농도 처리구에서는 각각 56.1 ±3.5 mg, 55.8±2.2 mg으로 그 증가폭이 경미하였다 (Table 1). 이와같이 일정한 범위 농도에서 carbenicillin이 첨가된 배지에서 캘러스 형성이 관찰되는 것은 carbenicillin0] 항생제 이외에 auxin 효과를 가지고 있다는 것을 보여준 것이며, 또한 2000 mg/L의 고농도에서 조직이 갈변되기 시작한 것은 고농도의 auxin 첨가에서 나타난 것과 유사하며 강한 항생 제의작용으로 조직세포에 피해를 준 것으로 보인다.
- NAA 처리구의 경우 carbenicillin 무첨가구에서는 솜털 모양의 뿌리에 캘러스가 부착되다가 250, 500 mg/L의 carbenicillin이 포함된 배지에서 뿌리는 없어지고 캘러스가 증가하는 경향을 보이다가 1000 mg/L 이상의 고농도에서는 오히려 캘러스의 형성이 억제되었다 (Figure 2C). 반면 생중 량은 2,4-D 및 NAA 처리 모두에서 carbenicillin$1 농도가 증가할수록 감소하여 형성된 캘러스 양의 증가와 생중량의 증가는 서로 일치하지는 않았다 (Table 1). 이와같이 carbenicillin은 배양중인 담배 조직에서 250 mg/L—500 mg/L 농도 범위에서는 캘러스 형성에 효과적이었으나 고농 도의 carbenicillin은 캘러스 형성을 억제하였다.
- 배양 4주째 BAP가 포함된 배지에서 carbenicillin 농도에 따른 신초형성을 보면, carbenicillin 농도가 250 mg/L 이상의 농도에서 신초 수가 급격하게 감소하여 1000 mg/L 이상 농도에서는 신초분화가 거의 관찰되지 않았다 (Table 2, Figure 3A). 또한 kinetin과 carbenicillin 혼합 처리구에 있어서도 carbenicillin 250 mg/L 이상 농도에서는 신초가 거의 형성되지 않았다 (Table 2, Figure 3B).
- 생장조절제가 포함되지 않고 여러 농도의 carbenicillin만 첨가된 MS 기본배지에서 잎절편을 치상한 결과, carbeni- cillin이 첨가되지 않은 잎절편에서는 절단부위에서 뚜렷한 캘러스 형성이 관찰되지 않았으나 250 mg/L~1000 mg/L 농도가 첨가된 배지에서는 캘러스의 형성이 관찰되었다. 그러나, 2000 mg/L의 농도에서는 잎절편이 가벼운 갈변을 보였다 (Figure 2A).
- 이러한 결과를 참고로 한다면 Agrobacterium 김.염 후 균 제거를 위해서 carbenicillin 이 첨가된 배지에서 식물체를 재분화시킬 경우, 본 연구의 담배와 같이 기존의 재분화 조건으로 검토된 배양계의 생장조절제의 농도를 미리 검토함으로써 형질전환 후에도 다수의 신초 수를 확보할 수 있다고 판단된다.
- 5 mg/L의 2,4-D, NAA.와 각각 혼합첨가한 배지에서 배양 4주째 치상조직의 생중량은 carbenicillin의 농도가 250 mg/L에서 2000 mg/L로 높아질수록 감소하였다.
- 이러한 결과는 carbenicillin이 캘러스 형성을 촉진하고 신초 형성을 억제하는 auxin과 유사한 효과를 가지고 있다는 것을 시사해 준다. 따라서 담배 잎절편에 Agrobacterium tumefaciens를 매개로 형질전환하고자 할 때 최적 재분화용 식물생장조절제의 농도는 carbenicillin이 제균제뿐만 아니라 auxin 유사효과를 가지는 물질임을 고려하여 결정하여야 한다.
- 이상의 결과를 종힙해보면 Agrobacterium tiunefaciens를 매개로 한 형질전환과정은 carbenicillin을 이용한 제균 과정에서 기존의 배양계에서의 최적 재분화 조건을 검토할 때 반드시 carbenicillin의 영향을 고려한 조건에서 최적의 재분화조건을 검토하는 것이 형질전환체를 보다 효율적으로 얻을 수 있고, 담배 이외의 식물에 있어서도 이러한 검토는 반드시필요하다고 본다.
- 이상의 결과에서 보는 바와 같이 carbenicillin이 포함된 배 지의 조직은 auxin류 첨가배지에서 흔히 나타나는 현상인 캘 러스 유도를 촉진하고 신초형성을 억제하는 효과를 가지고 있었다. 따라서, 서론에서 언급한 바와 같이 carbenicillin5] 구조가 아세트산기의 측쇄에 페놀기 또는 벤질기를 가진 오 옥신 (각각 2,4-D 및 NAA)의 화학구조와 유사성을 가지고 (Holford and Newbury 1992; Lin et al.
후속연구
- 1995), 금어초(Holford and Newbury 1992), 애기장대 (Patton and Meinke 1988), 포도 (Colby and Meredith 1990), Datura innoxia (Horsch and King 1983) 등의 식물에서 보고되었다. 또한 carbenicillin의 auxin 유사효과는 동일 식물체 내의 기관 부 위에 따라서도 다르게 나타나고 있으므로 (미발표자료), 효율 적인 형질전환을 위해서는 각 식물체의 조직부위에 따른 식 물체 재분화 과정에서 carbenicillin과 생장조절제의 상호작 용에 대한 영향을 다양하게 검토할 필요가 있다. 본 연구의 실험재료인 담배 (Nicotiana t사)acum)는 형질전환 연구에 있 어서 널리 이용되는 모델식물로 알려져 왔고, 담배의 품종에 따라서는 carbenicillin에 대한 auxin의 효과가 인정되었다는 보고도 있다.
- 이러한 결과는 carbenicillin 의 auxin 효과로 신초분화를 억제한 것으로 보이며, kine tin의 경우에는 그 효과가 더욱 민감하게 반영된 것으로 사료된다. 또한 실제 배양시에는 본 실험에서 사용한 0.5 mg/L kinetin 농도보다 높은 농도의 kinetin을 첨가하기 때문에 적정한 신초 수를 확보할 수 있다고 본다.
- 1 %로 BAP 농도에 따른 차이는 없었으나 녹색을 보인 절대적인 개체수는 3배 이상으로 관찰되었다 (자료 미제시). 이들 유식물체가 분자생물학적 방법을 통해 형질전환 식물체로 검증된 것은 아니지만 식물체의 재분화 비율이 높을수록 형질전환 식물체의 절대 수도 증가할 것으로 기대된다. 이러한 결과를 참고로 한다면 Agrobacterium 김.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.