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문제 정의
- 이렇게 꼼치에서 그 발현양이 매우 커서 in situ hybridization에서도 어느 특정한 세포에 강한 양성반응을 보이는 것은 아마도 이 유전인자가 그 특정세포에 매우 중요하게 작용하고 있다는 것을 의미한다. 그러므로 이렇게 선택되어진 5례의 클론을 집중적으로 조사하여 이들 유전인자들이 꼼치에서 어떤 역할을 하는가를 알기 위한 연구를 수행하였다. 한편, 본 연구에선 Northern blot을 통하여 mRNA의 전체 기능을 추정하였는데, C901 기의 경우에서는 전체 mRNA 길이가 대략 l.
- , 2000). 본 연구에서는 꼼치의 피부조직, 간질 조직 그리고 근육조직 등에서 특이하게 발현되는 cDNA 클론들을 얻기 위하여 추출된 cDNA library를 제작하였는데 이들에서 밝혀진 클론의 예는 이러한 꼼치의 특성을 잘 보여주었다. 꼼치의 몸통에서는 ribosomal protein, histatin, cystatin, lectin, statherin, secretory carrier membrane protein, keratin, desmin 등의 특수한 단백질 등이 다수 발현되어서 꼼치는 해 양동물에서도 간질조직의 성분이 매우 잘 발달되어 있는 동물임을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 이러한 가설에 의해서 꼼치의 생존 또는 진화에 관여하는 중요한 유전인자들을 발견하기 위하여 주출된 cDNA library를 이용해서 cloning과 sequencing을 수행하였다. 결과적으로 C90-77, C90-130, C90-161은 아마도 세포 외 기질단백질일 것으로 추측되고 C90-116은 C 말단에 다양한 인산화 부위들이 몰려 있고 N 말단으로 갈수록 소수성 인 구조가 2개의 상구조를 나타내므로 막투과성 단백질로써 신호 전달에 관여하는 단백질일 것으로 추측하였으며, C90-1 기은 꼼치의 몸통조직에서 풍부하게 발현되는 전자유전자로 추측 되었다.
- 국립수산진흥원, 1999). 아가미 형태, 지느러미 구조, 머리와 몸통의 뼈대구조는 퇴행성 변형이 깊은 바다 속 환경에 알맞게 새로운 형태의 어류로 진화하였다는 점에 착안하여 꼼치 살코기 내에 풍부하게 존재하는 물질이 생물학적으로 중요한 역할을 할 것으로 추측되어서 꼼치에서 발현되는 유전인자를 검색하고자 하였다. 특이한 성질의 꼼치 몸통 조직을 생화학 및 조직화학적으로 조사한 결과 당단백질 성분이 많이 존재하는 것을 관찰하였는데, 이렇게 꼼치의 살코기에 풍부하게 들어있는 당단백질은 꼼치가 매우 열악한 자연환경에서 견디어낼 수 있고, 한정된 먹이사슬 관계에서 생물학적인 번식을 유지하기 위하여 특수하게 사용될 것으로 생각된다.
- , 100㎕/ml ampicillin)에 배양하였다, 모두 200례 cDNA 클론을 얻었으며 충분히 배양된 세균을 resin bead (Promega, WI, USA)를 이용해서 cDNA를 포함하는 플라스미드를 분리하였고 분리된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)으로 삽입된 cDNA 크기를 확인한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 ALF-express (Phamacia Biotech, CA, USA)의 auto sequencer를 사용해서 부분적 염기 서열 배열을 시행하였는데 여기서 얻은 sequencing 결과는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 blast search program을 통하여 유사성 검색을 하였으며, 유사성 검색에서 비 반복성 유전인자으로 확인된 클론은 in situ hybridization을 시행하기 위하여 보관하였다.
- 이러한 당단백질은 신체구조를 유지하고 외부의 자극에 대하여 신체를 보호하면서, 원활한 근육, 신경, 뼈대계통 의 기능을 유지하기 위한 역할을 할 것으로 추측된다. 이에 본 연구에서는 분자생물학적인 클로닝 방법으로 꼼치에서 특이하게 발현되는 유전인자의 생물학적인 기능을 연구하였다.
가설 설정
- a4; sense probe, negative, bl ~b4: C90-116 clone, bl ~b3; antisense probe, positive in the peripheral cells of muscle bundles. b4; sense probe, negative. cl~c4: C90-130 clone, cl ~c3; antisense probe, positive in the epithelial cells and mesenchymal cells.
제안 방법
- 발색이 끝난 후 DIG4 (10mM Tris, ImM EDTA)용액으로 10분간 수세하였고, glycerol gel (DAKO, 106-1, CA, USA)로 봉입하였다.# situ hybridization에서 발현된 양성반응의 결과는 Image Pro-4.0 (Media Cybernetics, MA, USA)의 Image analyger 영상처리를 통하여 양성 반응의 정도를 분석하였다.
- 여분의 용액을 제거하고 anti-DIG antibody(Bo- ehringer mannehim GmbH, Germany) 를 DIG 1 용액으로 1:1000으로 회석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. DIG 1용액으로 30분씩 4회 수세하고 BCIP-NBT (Kirkegaard & Perry Lab, SF17, MA, USA)로 실온에서 20분간 발색시켰다. 발색이 끝난 후 DIG4 (10mM Tris, ImM EDTA)용액으로 10분간 수세하였고, glycerol gel (DAKO, 106-1, CA, USA)로 봉입하였다.
- 01 kcal/(mol*A)로 하였으며, Max Iteratione 1,000, 000으로 하였다. Energy Setup에서 Force Field는 Kollman United로 하였고, Charges는 Kollman으로 하여 얻은 가상의 단백질 구조를 입체적으로 영상 처리하여 관 찰하였다.
- digoxigeniibdUTP를 labeling 시켰으며, 55 ℃ 배양기에서 16시간 정도 hybridization을 시켰다. Hybridization 후 anti-DIG antibody(Boehringer mannehim GmbH,Germany)를 실온에서 1시간 반응시키고 나서, DIG 1용액으로 30분씩 4회 수세하고 BCIP-NBT (Kirkegaard & Perry Lab, SF17, MA, USA)로 실온에서 20분간 발색시켜 관찰하였다.
- 각각의 membranee 클로닝에서 얻은 cDNA를 사용해서 RNA probe를 제작하였는데 이 probe의 제작은 in situ hybridization에 사용된 RNA probe의 방법과 동일하다. digoxigeniibdUTP를 labeling 시켰으며, 55 ℃ 배양기에서 16시간 정도 hybridization을 시켰다. Hybridization 후 anti-DIG antibody(Boehringer mannehim GmbH,Germany)를 실온에서 1시간 반응시키고 나서, DIG 1용액으로 30분씩 4회 수세하고 BCIP-NBT (Kirkegaard & Perry Lab, SF17, MA, USA)로 실온에서 20분간 발색시켜 관찰하였다.
- ch/tools/)에서 아미노산 배열을 번역한 후, NCBI의 Genbank를 통하여 검색하였다. 검색된 클론의 아미노산 배열이 현재까지 Genbank에 수록된 단백질 구조와 유사성을 검색하기 위하여 ExPASy site뿐만 아니라 PDB(protein data bank) site를 이용하여 Sybyl 6.6 프로그램으로 단백질 특색을 검색하였다. 이렇게 얻은 단백질 배열을 Unix computer system의 Sybyl 6.
- 0 U/㎕)을 이용해서 second strand cDNA를 제작하였다. 그리고 NIH 3T3 세포주를 충분히 배양하여 같은 방법으로 mRNA를 추출하고 double strand cDNA를 제작하였으며, NIH 3T3 세포주에서 얻은 cDNA에 streptoavidin magnetic particle (Boehringer Mannheim, 1093274, Germany)을 붙인 probe를 사용해서 추출된 cDNA를 제작하였다. 이렇게 얻은 double strand cDNA의 양끝을 pfu DNA polymerase (2.
- 꼼치의 몸통조직에서 분리한 total RNA를 이용하여 Northern blot을 실행하였는데, 위의 방법으로 순수 분리한 total RNA를 이용하여 RNA loading buffer (5# 10X MOPS running buffer, 9# 37% formaldehyde, 25/#formamide, 11# RNA sample)에 55℃ 에 15분간 incubation시 킨 후 1% agarose/ formaldehyde gel을 통하여 전기영동 시켰다. 전기영동 후 젤 을 0.
- 꼼치의 추출된 cDNA library에서 클론을 얻기 위하여, SOLR strain의 세포와 Exassist helper phage의 도움으로 in vivo mass excision을 수행하였는데 이때 X-Gal (Sigma, SL,USA) 반응에 의해서 파란색 콜로니는 버리고 백색 콜로니를 취해서 ampicillin-LB broth (10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml IN NaOH, in IL H2O2, 100㎕/ml ampicillin)에 배양하였다, 모두 200례 cDNA 클론을 얻었으며 충분히 배양된 세균을 resin bead (Promega, WI, USA)를 이용해서 cDNA를 포함하는 플라스미드를 분리하였고 분리된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)으로 삽입된 cDNA 크기를 확인한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 ALF-express (Phamacia Biotech, CA, USA)의 auto sequencer를 사용해서 부분적 염기 서열 배열을 시행하였는데 여기서 얻은 sequencing 결과는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 blast search program을 통하여 유사성 검색을 하였으며, 유사성 검색에서 비 반복성 유전인자으로 확인된 클론은 in situ hybridization을 시행하기 위하여 보관하였다.
- 꼼치조직에 대한 조직화학적 검색은 신선한 꼼치 조직을 4% 중성 paraformaldehyde에 고정시킨 후 RNase protection된 방법으로 paraffin block을 제작하였으며, 4μm 두께의 현미경 절편을 silanized 유리 슬라이드에 부착하여 보관하였다. In situ hybridization에 사용되는 RNA probe를 제작하기 위하여, RNA in vitro transcription 반응을 시켰는데, DNA template (6 #), 10 X buffer (2#), RNAase inhibitor (1 #, NTP (DIG- UTP) mixture (1 #), T3 또는 T7 RNA polymerase (2#)를 DEPC H2O 10#의 용량을 만들어 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 formamide 용액 10#를 첨가하여 ・20"C에 보관하였다.
- 신선한 꼼치조직을 GTC (4.0 M guanidinium thiocyanate, 0.1 M Tris-Cl (pH 7.5), 1% 8-mercaptoethanol) 용액에 넣고 교반시킨 후 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) 추출 방법으로 total RNA를 일차적으로 분리하였으며, cesium chloride-EDTA 용액 (96.0g CsCl2 in 100 ml DEPC water, 0.01 M EDTA, pH 7.5)을 이용한 ultra centrifuge방법으로 순수한 total RNA를 얻었다. 이렇게 얻은 total RNA를 Oligotex (Qiagen, CA, USA)를 이용해서mRNA를 순수 분리하였으며, 순수 분리된 mRNA를 이용하여, Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) reverse transcriptase (Stratagene, CA, USA)로 single strand cDNA를 만들었으며 RNase H (1.
- 0)에 phenylmethylsulfonyl fluoride(lmM), aprotinin(10μg/ml) 그리고 leupe- ptin(10μg/ml) 등의 antiprotease를 넣어 혼합한 후 교반기로 분해시켰으며 다시 원심분리하여 상청액을 얻었다. 얻은 단백질 용액은 SDS-PAGE를 통하여 분리하였으며, Coomassie blue 염색과 toluidin blue 및 aniline blue 염색들을 통하여 단백질의 특성을 관찰하였다. 한편, 꼼치의 피부와 근육조직을 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후, 두께의 파라핀 절편을 만들어서 헤마톡실린과 에오진 중염색을하였으며 단백질의 특성을 관찰하기 위하여 PAS (periodic acid-Schiff), toluidin blue 및 Masson trichrome 염색을 한 후, 현미경 관찰하였다(Hibiya, 1982).
- EcoRl adaptor 부위는 T4 polynucleotide kinase로 인산화작용을 시키고, 다시 cDNA를 Xhol 으로 소화시켰다 (Stratagene, CA, USA). 이 cDNA는 T4 DNA ligase(4 U/㎕를 이용해서 Uni-ZAP XR vector에 ligation시켰으며 이vector를 packaging extract (Stratagen, CA, USA)을 사용하여 packaging시킨 후, Lambda phage의 증식을 XL 1-Blue MRF 세포를 사용해서 증폭시킴으로써 추출된 cDNA library를 제작하였다.
- 5)을 이용한 ultra centrifuge방법으로 순수한 total RNA를 얻었다. 이렇게 얻은 total RNA를 Oligotex (Qiagen, CA, USA)를 이용해서mRNA를 순수 분리하였으며, 순수 분리된 mRNA를 이용하여, Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) reverse transcriptase (Stratagene, CA, USA)로 single strand cDNA를 만들었으며 RNase H (1.5 U/㎕)와 DNA polymerase I (9.0 U/㎕)을 이용해서 second strand cDNA를 제작하였다. 그리고 NIH 3T3 세포주를 충분히 배양하여 같은 방법으로 mRNA를 추출하고 double strand cDNA를 제작하였으며, NIH 3T3 세포주에서 얻은 cDNA에 streptoavidin magnetic particle (Boehringer Mannheim, 1093274, Germany)을 붙인 probe를 사용해서 추출된 cDNA를 제작하였다.
- 6 프로그램으로 단백질 특색을 검색하였다. 이렇게 얻은 단백질 배열을 Unix computer system의 Sybyl 6.6 프로그램을 이용하여 단백질 구조를 관찰하였다. 이때 결합에너지를 최소화하기 위한 컴퓨터 환경설정은 다음과 같다: Method는 Powel로 하고, Termination Gradient는 0.
- 전체 cDNA의 염기서열을 완성하고 이 cDNA 염기서열을 ExPASy site (http://www.expasy.ch/tools/)에서 아미노산 배열을 번역한 후, NCBI의 Genbank를 통하여 검색하였다. 검색된 클론의 아미노산 배열이 현재까지 Genbank에 수록된 단백질 구조와 유사성을 검색하기 위하여 ExPASy site뿐만 아니라 PDB(protein data bank) site를 이용하여 Sybyl 6.
- 얻은 단백질 용액은 SDS-PAGE를 통하여 분리하였으며, Coomassie blue 염색과 toluidin blue 및 aniline blue 염색들을 통하여 단백질의 특성을 관찰하였다. 한편, 꼼치의 피부와 근육조직을 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후, 두께의 파라핀 절편을 만들어서 헤마톡실린과 에오진 중염색을하였으며 단백질의 특성을 관찰하기 위하여 PAS (periodic acid-Schiff), toluidin blue 및 Masson trichrome 염색을 한 후, 현미경 관찰하였다(Hibiya, 1982).
성능/효과
- 1) C90-77; 상피조직과 점액조직에서 강한 양성반응을 나타내고 있으며, 섬유조직뿐만 아니라 교원질 조직에서 도 강한 양성반응을 나타냈다. 특히, 기저막을 이루고 있는 섬유성 세포에서 매우 강한 양성반응을 보였으며, 이러한 양성반응은 상피층에서도 계속되었다.
- 1) c 말단 67개의 예상되는 아미노산 배열의 단백질 구조를 시뮬레이션하여 관찰한 결과, C 말단 부분에 산만한 단백질 구조를 보였는데, 그곳에는 다발성의 인산화 부위 (CK2, PKC, CAMP, Tiy)가 관찰되었으며, 일부 ASN 글리코사이드 부위도 나타났다. C 말단 단백질 구조는일정한 형태를 만드는 구조라기보다는 외부로 널리 노출되어 있는 형태였으며, 비교적 친수성이고 여러 종류의 인산화 부위가 분산되어 있음을 확인하였다.
- 2) C 말단 116개의 예상되는 아미노산 배열의 단백질 구조를 시뮬레이션하여 관찰한 결과, C 말단 구조가 뭉쳐진 형태의 구조를 보였고, 이 뭉쳐진 부위에는 serine, threonine이 풍부하게 존재하였으며, 다양한 인산화 부 위 (CK2, PKC, CAMP)들이 집중되어 있었고 일부 ASN 글리코사이드 부위도 나타났다. N 말단 부위로 갈수록 단백질구조가 선상의 구조를 이루었다.
- 2) C90-116; 섬유조직과 상피조직 그리고 점액조직에서 약한 양성반응을 보인 반면, 근육조직에서 특이하게 근육 다발 주변 부위 세포에서 매우 강한 양성반응을 나타냈다.
- 3) C 말단 79개의 예상되는 아미노산 배열의 단백질 구조를 시뮬레이션하여 관찰한 결과, 매우 복잡하게 엉켜진 구조를 보였는데, 전체적으로는 leucine이 풍부한 단백질로 소수성이었으며, 일부 PKC 인산화 부위와 ASN 글리코사이드 부위가 관찰되었다. 복잡하게 엉켜진 부분에서는 cysteine에 의한 결합력이 증가되어서 전체적인 단백질 구조가 중앙으로 밀집되어 있는 형태로 나타났다.
- 3) C90-130; 상피조직, 근육조직 그리고 점액조직에서 양성반응을 나타내고 있는데, 특히 상피조직에서 강한 양성반응을 나타냈다. 상피세포에서도 전 세포층에 고르게 강한 양성반응을 보였으며 점액조직 내에 일부의 섬유성 세포에서도 강한 양성반응을 보였다.
- 4) C 말단 62개의 예상되는 아미노산 배열의 단백질 구조를 시뮬레이션하여 관찰한 결과, 단백질 구조는 C 말단 부분에 코일 구조를 보이며, leucine, isoleucine의 소수성인 아미노산이 밀집되어 있었고, N 말단으로 갈수록 serine, threonine이 풍부한 친수성인 구조를 이루었다. 특히, 이 부분에서는 다양한 종류의 인산화 부위 (PKC, CK2)가 관찰되었다.
- 4) C90-161; 상피조직과 근육조직 그리고 점액성 섬유조직에서 약한 양성반응을 보였으며, 상피세포에서 특이하게 강한 양성반응을 보이고, 근육다발을 둘러싸는 섬유성 세포에서도 강한 양성반응을 보였다.
- 5) C 말단 118개의 추정되는 아미노산 배열의 단백질 구조를 가상하여 관찰한 결과, 4부분의 코일형 구조를 관찰하였는데 특히 한 부분은 CXXC-H의 zinc finger motif 를 갖고 있었으며(Bolivar et al., 1999), 4개의 코일 구조가 중심을 향하여 둘러싸여 있는 구조를 보였다. 특히 N 말단 염기서열이 serine, threonine이 풍부하며 친수성인 아미노산으로 구성되어 있으며, 4부분의 코일된 구조는 leucine, alanine, tryptophan 등의 소수성인 아미노산으로 이루어져 있었다.
- 5) C90-171; 상피조직, 근육조직 그리고 섬유기질 조직에 널리 강한 양성반응을 나타냈으며 교원띠 조직에서도 양성반응을 나타냈다. 특히, 상피세포에서 매우 강한 양성반응이 관찰되었는데 기저막 부위에 있는 섬유성 세포에서는 뚜렷한 양성반응이 관찰되었다.
- 1) c 말단 67개의 예상되는 아미노산 배열의 단백질 구조를 시뮬레이션하여 관찰한 결과, C 말단 부분에 산만한 단백질 구조를 보였는데, 그곳에는 다발성의 인산화 부위 (CK2, PKC, CAMP, Tiy)가 관찰되었으며, 일부 ASN 글리코사이드 부위도 나타났다. C 말단 단백질 구조는일정한 형태를 만드는 구조라기보다는 외부로 널리 노출되어 있는 형태였으며, 비교적 친수성이고 여러 종류의 인산화 부위가 분산되어 있음을 확인하였다.
- RNA를 이용해서 Northern blot을 시행한 결과, C90-77 클론의 mRNA는 약 5000bp 크기의 mRNA가 발견되었고 C90-116, 130, 161 클론들의 mRNA 크기는 각각 1500bp, 1200bp, 2000bp로 나타났으며 C90-171 클론은 약 1000 bp 크기의 mRNA가 예상되었는데 비교적 그 발현양이 많았다 (Fig. 5).
- 넷째로 C90-161은 상피조직과 근육조직 그리고 점액성 섬유조직에서 약한 양성반응을 보였지만, 상피조직 기저부분에서 특히 강한 양성반응을 보였는데, Northern blot에서 mRNA의 크기가 약 2000bp로 나타났다. 가상 단백질 구조에서 주로 C 말단 부분에 소수성인 아미노산이 밀집되어 있고, 코일 구조를 보였으며 N 말단 부분으로 갈수록 소수성인 아미노산에 의해 다양한 구조의 인산화 부위가 나타났다. 그래서 이 유전물질은 특히, 상피세포와 기저막세포 에 흔하게 발현되는 물질로 주로 세포막에 부착되어 세포의 기질과 반응하여 세포 신호전달에 영향을 미치는 특이한 유전물질일 것으로 추측되었다(Blom et al.
- 본 연구에서는 이러한 가설에 의해서 꼼치의 생존 또는 진화에 관여하는 중요한 유전인자들을 발견하기 위하여 주출된 cDNA library를 이용해서 cloning과 sequencing을 수행하였다. 결과적으로 C90-77, C90-130, C90-161은 아마도 세포 외 기질단백질일 것으로 추측되고 C90-116은 C 말단에 다양한 인산화 부위들이 몰려 있고 N 말단으로 갈수록 소수성 인 구조가 2개의 상구조를 나타내므로 막투과성 단백질로써 신호 전달에 관여하는 단백질일 것으로 추측하였으며, C90-1 기은 꼼치의 몸통조직에서 풍부하게 발현되는 전자유전자로 추측 되었다. 결국 꼼치의 추출된 cDNA libraiy를 통하여 효과적으로 주요 mRNA를 동정하였는데, 꼼치가 저인망에 의해 잡혀 RNA 분리시까지 신선한 상태를 유지하기 어려워 적절한 전체 mRNA를 얻을 수 없었지만 세밀한 클로닝과 시퀜싱을 통하여 C 말단 부분의 아미노산배열을 얻을 수 있었다.
- 결과적으로 이러한 연구를 통하여 C 말단의 특징적인 유전물질을 검색할 수 있었는데, 모두 60아미노산 배열보다 많은 아미노산 배열을 DNA 염기서열을 통하여 얻을 수 있었다. 그리고 비교적 C 말단 부분의 아미노산은 유전물질의 특이한 기능과 관련되는 부분이 많았으며, 대략 50 아미노산 이상의 아미노산 배열만 가지면 전체 단백질 구조의 주요 motif를 파악할 수 있기 때문에 본 연구에서 나타난 실험연구 결과는 매우 의의가 있다.
- 결과적으로 C90-77, C90-130, C90-161은 아마도 세포 외 기질단백질일 것으로 추측되고 C90-116은 C 말단에 다양한 인산화 부위들이 몰려 있고 N 말단으로 갈수록 소수성 인 구조가 2개의 상구조를 나타내므로 막투과성 단백질로써 신호 전달에 관여하는 단백질일 것으로 추측하였으며, C90-1 기은 꼼치의 몸통조직에서 풍부하게 발현되는 전자유전자로 추측 되었다. 결국 꼼치의 추출된 cDNA libraiy를 통하여 효과적으로 주요 mRNA를 동정하였는데, 꼼치가 저인망에 의해 잡혀 RNA 분리시까지 신선한 상태를 유지하기 어려워 적절한 전체 mRNA를 얻을 수 없었지만 세밀한 클로닝과 시퀜싱을 통하여 C 말단 부분의 아미노산배열을 얻을 수 있었다.
- 꼼치의 몸통에서는 ribosomal protein, histatin, cystatin, lectin, statherin, secretory carrier membrane protein, keratin, desmin 등의 특수한 단백질 등이 다수 발현되어서 꼼치는 해 양동물에서도 간질조직의 성분이 매우 잘 발달되어 있는 동물임을 알 수 있었다. 그런데, 본 연구에서는 추출된 cDNA 클로닝이 꼼치에서 특이하게 발현되는 cDNA 클로닝을 얻기 위한 것이므로 전체의 69%(138례)가 Genbank search에서 비반복성로 나타났다. 이들 138례는 모두 꼼치에서 특이하게 발현되는 유전인자로 지목할 수 있는데 본 연구에서는 이들 클론을 이용하여 in situ hybridization을 실시한 결과, 이 중에서 5례가 특정 조직세포에 강한 양성반응을 보였다.
- 꼼치의 몸통에서 제작한 추출된 cDNA library를 통하여 얻은 200례 cDNA 클론의 염기서열 분석을 시행한 후 Genbank 검색을 하였고 그 결과, thioesterase 9례, myosin 8례, creatine kinase 7례, skeletal alpha-actin 6례로 가장 많이 나타났고, 그 다음으로 parvalbumin b와 ribosomal protein이 각각 5례씩 나타났다. 그리고 type I collagen과 muscle troponin0] 각각 3례, dopamine receptor, histatin, heat shock proteine 각각 2례씩 나 타났으며, cystatin, lectin, statherin, secretory carrier membrane protein, keratin type I, desmin, chloroplast, muscle tropomyosin, reticulum calcium ATPase, ribonucleoprotein°l 각각 1 례씩으로 총 62례에서 homology가 비교적 높게 나타났으며, 나머지 138례는 Genbank 검색에서 유사성이 낮거나 비반복성 유전인자으로 확인되었다 (Table 1). 이 138례의 cDNA 클론 중에서 in situ hybrkiization를 통하여 꼼치의 조직세포 내에서 뚜렷한 양성반응을 보이는 5례의 cDNA 클론을 선택하여 C 말단 펩타이드로 추정되는 단백질 서열을 얻었으며 이들은 다음 그림과 같다.
- 결과적으로 이러한 연구를 통하여 C 말단의 특징적인 유전물질을 검색할 수 있었는데, 모두 60아미노산 배열보다 많은 아미노산 배열을 DNA 염기서열을 통하여 얻을 수 있었다. 그리고 비교적 C 말단 부분의 아미노산은 유전물질의 특이한 기능과 관련되는 부분이 많았으며, 대략 50 아미노산 이상의 아미노산 배열만 가지면 전체 단백질 구조의 주요 motif를 파악할 수 있기 때문에 본 연구에서 나타난 실험연구 결과는 매우 의의가 있다. 하겠다.
- 특히 상피와 간질사이에 존재하는 기저막은 대략 150~200“m로 매우 비대되어 있었는데 이 기저막 부위에서 PAS, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 등에 강하게 염색되므로 매우 풍부한 당단백질이 존재함을 관찰하였다. 그리고 일반적으로 근육조직은 굵은 다발을 형성하지 않고, 작은 소근육질이 산재되어 나타났는데 근육사이의 간질과 근육을 둘러싸는 피막조직에서도 PAS, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 등에 미만성 의 양성 반응이 보이므로 충분한 당단백질이 분포함을 알 수 있었다 (Fig. 1).
- 꼼치의 몸통에서 제작한 추출된 cDNA library를 통하여 얻은 200례 cDNA 클론의 염기서열 분석을 시행한 후 Genbank 검색을 하였고 그 결과, thioesterase 9례, myosin 8례, creatine kinase 7례, skeletal alpha-actin 6례로 가장 많이 나타났고, 그 다음으로 parvalbumin b와 ribosomal protein이 각각 5례씩 나타났다. 그리고 type I collagen과 muscle troponin0] 각각 3례, dopamine receptor, histatin, heat shock proteine 각각 2례씩 나 타났으며, cystatin, lectin, statherin, secretory carrier membrane protein, keratin type I, desmin, chloroplast, muscle tropomyosin, reticulum calcium ATPase, ribonucleoprotein°l 각각 1 례씩으로 총 62례에서 homology가 비교적 높게 나타났으며, 나머지 138례는 Genbank 검색에서 유사성이 낮거나 비반복성 유전인자으로 확인되었다 (Table 1).
- 본 연구에서는 꼼치의 피부조직, 간질 조직 그리고 근육조직 등에서 특이하게 발현되는 cDNA 클론들을 얻기 위하여 추출된 cDNA library를 제작하였는데 이들에서 밝혀진 클론의 예는 이러한 꼼치의 특성을 잘 보여주었다. 꼼치의 몸통에서는 ribosomal protein, histatin, cystatin, lectin, statherin, secretory carrier membrane protein, keratin, desmin 등의 특수한 단백질 등이 다수 발현되어서 꼼치는 해 양동물에서도 간질조직의 성분이 매우 잘 발달되어 있는 동물임을 알 수 있었다. 그런데, 본 연구에서는 추출된 cDNA 클로닝이 꼼치에서 특이하게 발현되는 cDNA 클로닝을 얻기 위한 것이므로 전체의 69%(138례)가 Genbank search에서 비반복성로 나타났다.
- 꼼치의 몸통조직에서 추출한 단백질을 전기영동을 통하여 분리한 후, aniline 비ue와 toluidin 비ue등의 화학적 염색을 한 결과 양성반응을 보이는 밴드가 150 kDa 부위에서 집중되어 관찰되었으며 (Fig. 4), 여러 부위의 몸통조직을 통하여 얻은 조직표본을 조직화학적인 방법으로 현미경 관찰한 결과 PAS 염색과 von Gieson 염색, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 염색에서 상피세포, 간질세포 등에 모두 강한 양성 반응을 보였다. 특히 상피와 간질사이에 존재하는 기저막은 대략 150~200“m로 매우 비대되어 있었는데 이 기저막 부위에서 PAS, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 등에 강하게 염색되므로 매우 풍부한 당단백질이 존재함을 관찰하였다.
- 따라서 C90-130의 유전인자는 주로 상피세포에 흔하게 발현되는 유전인자로서 상피세포에서 세포분화 중에 세포질 내에서 사용되어지는 유전물질로 생각되었다. 넷째로 C90-161은 상피조직과 근육조직 그리고 점액성 섬유조직에서 약한 양성반응을 보였지만, 상피조직 기저부분에서 특히 강한 양성반응을 보였는데, Northern blot에서 mRNA의 크기가 약 2000bp로 나타났다. 가상 단백질 구조에서 주로 C 말단 부분에 소수성인 아미노산이 밀집되어 있고, 코일 구조를 보였으며 N 말단 부분으로 갈수록 소수성인 아미노산에 의해 다양한 구조의 인산화 부위가 나타났다.
- , 1999). 다섯째로 C90-1 기은 상피조직, 근육조직 그리고 섬유기질 조직에 널리 강한 양성반응을 보였으며, Northern blot에서 mRNA의 크기가 약 lOOObp로 나타났다. 이 유전물질의 가상 단백질 구조에서 4개의 코일형의 구조를 이루었는데 이 코일형 구조 일부가 zinc finger motif를 가지고 있었으며 4개의 코일 형태가 중앙부위를 관상으로 둘러싸는 형태를 이루고 있었다.
- 따라서 가상의 단백질 구조는 주로 C 말단 부분만 관찰할 수 있었는데 다양한 인산화 부위가 산만하게 흩어져서 외부로 널리 노출되어 있는 구조를 나타내고 있으므로 아마도 이 단백질은 세포의 기질로서 다른 기질 단백질들과 쉽게 반응하여 결합체를 이루거나 어떤 종류의 다른 단백질과 결합하여 기질구조를 이루는 유전인자일 것으로 추측된다. 둘째로 C90-116은 상피조직과 섬유조직에서 약한 양성 반응을 보였지 만 근육다 발 주위세포에서는 매우 강한 양성반응을 보였으며 Northern blot에서 mRNA의 크기가 약 1500bp로 나타났다. 가상의 단백질 구조에서 주로 C 말단의 단백질 구조를 관찰할 수 있는데 둥근 부채모양의 단백질 구조에 다양한 인산화 부위가 있고, N 말단 부위로 갈수록 버섯모양으로 펼쳐져 있는 부분이 소수성인 아미노산으로 이루어져 있었으며, 이들 사이에는 선상의 구조가 길게 연결되어 있었다.
- 이 유전물질의 가상 단백질 구조에서 4개의 코일형의 구조를 이루었는데 이 코일형 구조 일부가 zinc finger motif를 가지고 있었으며 4개의 코일 형태가 중앙부위를 관상으로 둘러싸는 형태를 이루고 있었다. 따라서, 본 유전물질은 아마도 zinc finger 단백질의한 종류로서 여러 조직에 흔하게 발현되는데 (Blancafort et al, 1999), 그 중에서 특히 세포의 증식이나 분화성이 높은 세포들에 강한 발현을 보이고 있고, 4개의 코일된 구조물인 zinc finger 구조 가 중심을 향하여 관상으로 맴돌고 있는 것으로 보아, DNA 결합을 통하여 세포의 분화를 조절하는 특징적인 전사와 관련된 유전자의 일종일 것으로 추측되었다. 따라서, 본 연구에서는 꼼치에서 특이하고 풍부하게 발현되는 새로운 유전인자 5클론을 얻었는데, 앞으로 5, -말단의 확장을 통하여, 염기서열 전체 길이를 얻기 위한 실험을 계속해 나가야 할 것이다.
- 본 연구를 통하여 꼼치의 몸통조직에는 조직화학적인 방법으로 당단백질이 풍부하게 존재하는 것을 관찰하였으며 특히 조직학적으로 꼼치 몸통조직의 피부기저막, 간질조직 그리고 근육기적막 부위에 매우 풍부한 당단백질이 관찰되었다. 이들 당단백질은 주로 세포 외 기질로 존재하면서 인접하는 세포들을 부착시키고 세포의 이동, 증식 및 분화 등을 조절하는 중요한 기능을 하고 있으므로 이들 당단백질이 꼼치가 깊은 해저에서 생존하는데 반드시 필요한 유전물질로 추측된다.
- 특히 C 말단 쪽의 phenylalanine, alanine 등의 소수성인 아미노산의 존재로 보아서 이 유전인자는 근육조 직에 신호전달을 매개하는 유전 단백질일 것으로 추측된다. 셋째로 C90-130은 상피조직, 근육조직 그리고 점액조직에서 고르게 양성반응을 보였고, 특히 상피조직에 강한 양성반응을 보였는데, Northern blot에서 mRNA의 크기가 약 1200bp로 나타났다. 따라서 주로 C 말단의 가상의 단백질 구조를 관찰하였는데 전체적으로 서로 엉켜진 복잡한 구조로 여러 부분이 cysteine에 의한 결합구조를 가지고 있으며, 전체적으로는 소수성인 구조를 보이고 있었다.
- 위에서 얻은 5례의 클론의 정확한 염기서열을 확인한 후 예상되는 아미노산 배열을 관찰하였는데 이들 5개의 클론은 비록 N 말단 펩타이드 일부가 없고 C 말단에 존재하는 62- 118개의 아미노산을 포함하므로 단백질의 특성을 이루는 구조를 연구하기에는 충분하였다. 이들의 단백질 구조는 다음과 같았다 (Fig.
- 그런데, 본 연구에서는 추출된 cDNA 클로닝이 꼼치에서 특이하게 발현되는 cDNA 클로닝을 얻기 위한 것이므로 전체의 69%(138례)가 Genbank search에서 비반복성로 나타났다. 이들 138례는 모두 꼼치에서 특이하게 발현되는 유전인자로 지목할 수 있는데 본 연구에서는 이들 클론을 이용하여 in situ hybridization을 실시한 결과, 이 중에서 5례가 특정 조직세포에 강한 양성반응을 보였다. 이렇게 꼼치에서 그 발현양이 매우 커서 in situ hybridization에서도 어느 특정한 세포에 강한 양성반응을 보이는 것은 아마도 이 유전인자가 그 특정세포에 매우 중요하게 작용하고 있다는 것을 의미한다.
- 특히, 이 부분에서는 다양한 종류의 인산화 부위 (PKC, CK2)가 관찰되었다. 전체적인 단백질 구조는 산만한 형태를 이루었는데, cysteine이 1개만 관찰되어서 이황화 구조를 만들지는 않았지만, glutamine0] 4개 arginine 이 7개 phenylalanine 이 3개 등으로 친수성인 부분에 밀집되어 나타나므로 다른 단백질과 밀접한 관계가 있는 것으로 추측되었다.
- 첫째로 C90-77은 in situ hybridization에서 상피조직과 점액 조직에서 강한 양성반응을 보였는데, 특히 기저막을 이루고 있는 섬유성세포에서 매우 강한 양성반응을 보였으며 Nothem blot에서 약 5000bp의 큰 mRNA로 예상된다. 따라서 가상의 단백질 구조는 주로 C 말단 부분만 관찰할 수 있었는데 다양한 인산화 부위가 산만하게 흩어져서 외부로 널리 노출되어 있는 구조를 나타내고 있으므로 아마도 이 단백질은 세포의 기질로서 다른 기질 단백질들과 쉽게 반응하여 결합체를 이루거나 어떤 종류의 다른 단백질과 결합하여 기질구조를 이루는 유전인자일 것으로 추측된다.
- 추출된 cDNA libraiy에서 얻은 비 반복성 유전인자의 클론들을 꼼치의 몸통 조직에 in situ hybridization을 한 결과 5례의 클론이 특이한 세포군에 매우 강한 양성반응을 보였다(Fig. 2).
- 4), 여러 부위의 몸통조직을 통하여 얻은 조직표본을 조직화학적인 방법으로 현미경 관찰한 결과 PAS 염색과 von Gieson 염색, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 염색에서 상피세포, 간질세포 등에 모두 강한 양성 반응을 보였다. 특히 상피와 간질사이에 존재하는 기저막은 대략 150~200“m로 매우 비대되어 있었는데 이 기저막 부위에서 PAS, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 등에 강하게 염색되므로 매우 풍부한 당단백질이 존재함을 관찰하였다. 그리고 일반적으로 근육조직은 굵은 다발을 형성하지 않고, 작은 소근육질이 산재되어 나타났는데 근육사이의 간질과 근육을 둘러싸는 피막조직에서도 PAS, toluidin blue, 그리고 Masson trichrome 등에 미만성 의 양성 반응이 보이므로 충분한 당단백질이 분포함을 알 수 있었다 (Fig.
- -77; 상피조직과 점액조직에서 강한 양성반응을 나타내고 있으며, 섬유조직뿐만 아니라 교원질 조직에서 도 강한 양성반응을 나타냈다. 특히, 기저막을 이루고 있는 섬유성 세포에서 매우 강한 양성반응을 보였으며, 이러한 양성반응은 상피층에서도 계속되었다.
- -171; 상피조직, 근육조직 그리고 섬유기질 조직에 널리 강한 양성반응을 나타냈으며 교원띠 조직에서도 양성반응을 나타냈다. 특히, 상피세포에서 매우 강한 양성반응이 관찰되었는데 기저막 부위에 있는 섬유성 세포에서는 뚜렷한 양성반응이 관찰되었다. 한편, 근육 다발 내부에서도 흔하게 강한 양성반응이 관찰되었다.
후속연구
- 하겠다. 따라서 앞으로 전체 cDNA 염기서열을 얻기 위한 실험을 계속하여야 하며, 가상 단백질 구조에서 특이한 기능이 예상되는 아미노산 배열 부위에서 얻은 재조합 단백질이나, 합성단백질을 이용해서 항체를 만든 후 그 항체의 특이한 반응을 관찰하는 연구가 계속되어져야 할 것이다.
- 따라서, 본 유전물질은 아마도 zinc finger 단백질의한 종류로서 여러 조직에 흔하게 발현되는데 (Blancafort et al, 1999), 그 중에서 특히 세포의 증식이나 분화성이 높은 세포들에 강한 발현을 보이고 있고, 4개의 코일된 구조물인 zinc finger 구조 가 중심을 향하여 관상으로 맴돌고 있는 것으로 보아, DNA 결합을 통하여 세포의 분화를 조절하는 특징적인 전사와 관련된 유전자의 일종일 것으로 추측되었다. 따라서, 본 연구에서는 꼼치에서 특이하고 풍부하게 발현되는 새로운 유전인자 5클론을 얻었는데, 앞으로 5, -말단의 확장을 통하여, 염기서열 전체 길이를 얻기 위한 실험을 계속해 나가야 할 것이다.
- 아가미 형태, 지느러미 구조, 머리와 몸통의 뼈대구조는 퇴행성 변형이 깊은 바다 속 환경에 알맞게 새로운 형태의 어류로 진화하였다는 점에 착안하여 꼼치 살코기 내에 풍부하게 존재하는 물질이 생물학적으로 중요한 역할을 할 것으로 추측되어서 꼼치에서 발현되는 유전인자를 검색하고자 하였다. 특이한 성질의 꼼치 몸통 조직을 생화학 및 조직화학적으로 조사한 결과 당단백질 성분이 많이 존재하는 것을 관찰하였는데, 이렇게 꼼치의 살코기에 풍부하게 들어있는 당단백질은 꼼치가 매우 열악한 자연환경에서 견디어낼 수 있고, 한정된 먹이사슬 관계에서 생물학적인 번식을 유지하기 위하여 특수하게 사용될 것으로 생각된다. 이러한 당단백질은 신체구조를 유지하고 외부의 자극에 대하여 신체를 보호하면서, 원활한 근육, 신경, 뼈대계통 의 기능을 유지하기 위한 역할을 할 것으로 추측된다.
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