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문제 정의
- 그러나 생식도관에서의 발달 단계에 따른 영향과 혈청 대체 효과에 대해서는 규명되지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 생쥐의 체외 배양액에 GAGs를 첨가하여 배양함으로써 자궁과 난관액에서의 GAGs의 역할 규명과 수정란 발달 단계에 따른 영향을 조사하고자 하였으며, 궁극적으로는 GAGs의 혈청 대체물질로서의 가능성을 제시하고자 하였다.
- 무혈청 배양체계는 각 배양환경의 변이를 줄이는 데 있어 중요한 부분을 차지한다. 따라서 본 연구는 난포, 난관, 자궁에 존재하는 GAGs를 체외 배 양액에 첨가함으로써 수정란의 체외 발달율과 혈청 대체 효과를 조사하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
- 무혈청 배양액에 hyaluronic acid를 첨가한 결과 는 Table 2와 같다. 0.1, 0.5, L0mg/ml의 hyaluronic acid를 각각 무혈청 배양액에 첨가하였을 때, 배반 포기로의 발달이 0.1, 0.5, 1.0mg/ml의 첨가 수준(각 각 63%, 64%, 63%)에서 대조군 중 혈청을 첨가하여 배양한 대조군(71%)과 비교하여 유의적 차이를 나타내지 않았다. 따라서 hyaluronic acid의 첨가는 0.
- 대조군은 크게 두 가지로 나누었다. Ham's F-10 으로만 배양한 대조군과 Ham's F-10에 10% FBS 를 첨가한 배양액으로 배양한 대조군의 수정란을 배반포까지 배양하였다.
- 0 mg/ml을 첨가하였다. Hyaluronic acid 와 chondroitin sulfate의 조합 첨가는 각각 0.25, 0.5 mg/ml을 조합하여 첨가하였다.
- 난자의 채취를 위하여 PMSG 5 IU를 암컷 쥐의 복강에 주사하고, 48시간 이후 hCG 5 IU를 주사하여 암컷의 과배란을 유기하였다. hCG를 주사한 후 14〜16 시간 후 경추 탈골법으로 희생시킨 후 배측(dorsal)을 절개하여 양측 난관만을 절단하였다. 난자회 수용 접시에 난관을 넣고 26 gauge 주사침을 이용하여 난관팽 대부를 터트려 난자-난구세포층 복합체 (oocyte-cumulus complex, OCC)를 회수하였다.
- 난자의 채취를 위하여 PMSG 5 IU를 암컷 쥐의 복강에 주사하고, 48시간 이후 hCG 5 IU를 주사하여 암컷의 과배란을 유기하였다. hCG를 주사한 후 14〜16 시간 후 경추 탈골법으로 희생시킨 후 배측(dorsal)을 절개하여 양측 난관만을 절단하였다.
- 난자회 수용 배양액과 난자 세척배양액은 Ham's F-10 (Gibco BRL, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, USA)< 첨가하여 30 mm2 배양 접시(Falcon, US A) 에서 2시간 이상 전 배 양(prein cubation) 하였다.
- hCG를 주사한 후 14〜16 시간 후 경추 탈골법으로 희생시킨 후 배측(dorsal)을 절개하여 양측 난관만을 절단하였다. 난자회 수용 접시에 난관을 넣고 26 gauge 주사침을 이용하여 난관팽 대부를 터트려 난자-난구세포층 복합체 (oocyte-cumulus complex, OCC)를 회수하였다. 회수된 난자를 Ham's F-10에 10% FBS 가 첨가된 세척배양액에서 3번의 세척 과정을 거친 후 Ham's F-10에 10% FBS를 첨가한 수정용 배 양 액이 담긴 배양접시로 옮긴 후 수정 시기까지 배 양 접시에 넣고 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하 였다.
- 대조군은 크게 두 가지로 나누었다. Ham's F-10 으로만 배양한 대조군과 Ham's F-10에 10% FBS 를 첨가한 배양액으로 배양한 대조군의 수정란을 배반포까지 배양하였다.
- 수정능력획득 이 유도 된 정자를 30〜40개의 난자가 들어있는 수정용 배양접시에 운동성정자의 농도가 lxl0%nl이 되도록 주입한 후 6〜7 시간 동안 체외수정시켰다. 수정 후 수정란의 형태나 세포질에 이상이 없는 수정란만을 선별한 후 체외 배 양용 배양액에 옮겨 37°C, 5% CO2 배양기에서 배 양하였다.
- 수정능력획득 이 유도 된 정자를 30〜40개의 난자가 들어있는 수정용 배양접시에 운동성정자의 농도가 lxl0%nl이 되도록 주입한 후 6〜7 시간 동안 체외수정시켰다. 수정 후 수정란의 형태나 세포질에 이상이 없는 수정란만을 선별한 후 체외 배 양용 배양액에 옮겨 37°C, 5% CO2 배양기에서 배 양하였다.
- 절개한 정소상체 미부는 정 자처리용 배양접시에 옮겨 소적이 깨지지 않게 mineral oil 부분에 침지하였다. 실체현미경 하에서 한쪽은 해부용 집게로 잡고 다른 한 부분은 26 gauge 주사침으로 절개하여 누출된 정자 괴를 배양소적으로 유도하여 정자의 부유를 확인하고, 37°C, 5% C02 배양기에서 1-1.5시간 동안 배양하여 정자의 수정 능 획득을 유기하였다.
- 실험군에 첨가제로 사용한 GAGs는 hyaluronic acid, chondroitin sulfate 그리고 dermatan sulfate (Sigma, USA)를 사용하였으며, Ham's F-10에 각각 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml을 첨가하였다. Hyaluronic acid 와 chondroitin sulfate의 조합 첨가는 각각 0.
- 정자는 7주령 이상의 CBA 쥐를 이용하여, 경추탈골법으로 도살하여 복부를 절개한 후, 정소상체 미부를 절개하였다. 절개한 정소상체 미부는 정 자처리용 배양접시에 옮겨 소적이 깨지지 않게 mineral oil 부분에 침지하였다.
- 체외수정 후 48시간 간격으로 신선한 배양액으로 교환해주면서, 수정 후 5일째까지 배양을 계속하였다. 체외수정 후 2, 3, 4, 5일째에 2세포기에서, 배반포(blastocyst), 부화(hatching) 배반포, 발생율, 배양접시에의 부착율을 매일 관찰하 였다.
대상 데이터
- 광량(명: 암= 12 : 12) 및 온도(22°C) 조절과 환풍시설이 갖추어진 사육실에서 사육된 생쥐를 사용하였다. 암컷은 C57BLXCBA에서 태어난 제1 대 잡종(Fl hybrid)으로 4주령 이상의 성성숙이 이루어진 쥐를 사용하였다.
- 본 실험에서는 GAGs 물질 중 hyaluronic acid, chondroitin sulfate와 dermatan sulfate를 실험에 사용하였다. 이 물질들은 수정란의 공배양(CO-CU1- Oture)에 사용하는 난구세포층과 체액과 난포액에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 (Eriksen 등, 1994), 또한 본 실험 결과에서도 세포체외발달에 있어 중요한 영향을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
- 암컷은 C57BLXCBA에서 태어난 제1 대 잡종(Fl hybrid)으로 4주령 이상의 성성숙이 이루어진 쥐를 사용하였다. 수컷은 7주령 이상의 성성숙이 이루어진 CBA 쥐를 사용하였다.
- 광량(명: 암= 12 : 12) 및 온도(22°C) 조절과 환풍시설이 갖추어진 사육실에서 사육된 생쥐를 사용하였다. 암컷은 C57BLXCBA에서 태어난 제1 대 잡종(Fl hybrid)으로 4주령 이상의 성성숙이 이루어진 쥐를 사용하였다. 수컷은 7주령 이상의 성성숙이 이루어진 CBA 쥐를 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리는 Statistical Analysis System 통계 프로그램을 이용하였으며, GAGs를 첨가한 그룹과 첨가하지 않은 그룹 간의 수정란 발 달율은 one way ANOVA 방법에 의한 Duncan 검정 방법에 의해 분 석하였다.
성능/효과
- 체외 배양액에 chondroitin sulfate 첨가결과는 Table 3과 같다. 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml의 chondroitin sulfate를 혈청이 있는 체외 배양액에 첨가하여 체외 배양 하였을 때, 01mg/ml의 첨가수준에서(73%)대 조군(66%)과 비교하여 배반포 형성에 있어 유의적인 발달 차이를 나타냄으로써 배반 포 형성을 촉진시키는 결과를 가져왔다(PC0.05). 그러나 0.
- 체외배양액(Hamk F-10)에 hyaluronic acid 첨가 결과는 Table 1과 같다. 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml의 hyaluronic acid를 혈청이 있는 체외 배양액에 첨가하였을 때, 0.1과 0.5 mg/ml 첨가 수준에서 대조군과 비교하여 각각 87%, 84%로 상실배로의 발달이 유의적(PC0.05)으로 증가되었다. 그러나 배반 포 형성에 영향을 미치지는 않았다.
- 무혈청 배양액에 chondroitin sulfate를 첨가한 결과는 Table 4와 같다. 0.1, 0.5, 1.0mg/ml의 chon droitin sulfate를 각각 첨가하였을 때, 배반 포 형성에 있어 0.5mg/ml의 첨가수준에서 (64%) 혈청을 첨가하여 배양한 대조군(68%)과 비교하여 통계적 유의성을 나타내지 않았으며, 동시에 무혈청 배양액에 체외 배양한 대조군(48%)과 비교하였을 때 유의적으로 높은 배반 포 형성율(64%)을 나타냄으로써 chondroitin sulfate는 0.5mg/ml에서 혈청 대체 효과 가 있음을 결과를 통해 알 수 있었다 (PV0.05). 그러나 0.
- Dermatan sulfate를 혈청이 있는 배양액에 첨가한 결과 0.1, 1.0 mg/ml 수준에서 상실배와 배반포 발달이 대조군에 비해 유의적으로 낮은 발달 차이를 보여주었다. 이 결과는 dermatan sulfate가 수 정 란의 발달을 저해하였음을 시사해주고 있으며, Koichiro 등(1998)이 보고한 돼지체외배양액에 dermatan sulfate를 첨가하였을 때 수정란의 발달상에 차이가 없었던 것과는 다른 양상을 보여주었 다.
- Hyaluronic acid는 첨가 GAGs 물질 중 가장 좋은 혈청 대체 효과를 나타내었는데, 이러한 결과가 나타나게 된 것은 합성 과정을 살펴볼 때 hyalur onic acid 의 합성만 이루어지는 것이 아니라 chondroitin sulfate를 포함하여 다른 GAGs 사슬들과 core protein이라는 단백질이 결합하여 복합적으로 완성된 proteoglycans의 형태를 가지고 세포 외기질로 분출되기 때문에 다른 GAGs들보다 세포외 물질들의 신호전달에 많이 관여할 것으로 사료된다. 또한 혈청이 있는 상태와 없는 상태에서 첨 가수준에 따라 발달율이 차이를 보인 이유는 혈청이 있는 상태에서 첨가된 hyaluronic acid는 ionic strength에 의해 배양액 내에 존재하는 혈청에 있 는 알 부민을 포함한 여러 성장인자들과 결합함으로써 세포의 발달에 관여하는 신호전달에 장애가 생김으로 인해 혈청이 없는 상태와 다른 발달상의 차이를 보인 것으로 사료된다
- 이 물질들은 수정란의 공배양(CO-CU1- Oture)에 사용하는 난구세포층과 체액과 난포액에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 (Eriksen 등, 1994), 또한 본 실험 결과에서도 세포체외발달에 있어 중요한 영향을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. Hyaluronic acid를 혈청이 있는 배양액에 첨가한 결과 0.1 mg/ml 수준에서 상실배 발달에 있어 유의적으로 높은 발달 차이를 보여주었으며, 혈청이 없는 배양액에 hyaluronic acid를 첨가한 결과 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 모든 수준에서 배반포로의 발달이 유의적으로 증가하였다. 이 결과 는 hyaluronic acid가 수정란의 발달을 촉진시켰을 뿐 아니라 혈청 대체물질로써의 가능성이 있음을 시사해주고 있으며, Koichiro 등(1998)이 보고한 돼지체외배양액에 hyaluronic acid 첨가가 돼지 수정란의 배반 포 형성에 효과적이었던 결과와 비슷한 양상을 보여주고 있다.
- 5 mg/ml 수준을 조합한 결과는 Table 7과 같다. Hy aluronic acid와 chondroitin sulfate를 각각 0.5 mg/ ml의 첨가 수준으로 조합하였을 때 대조군(65%)에 비해 유의적으로 낮은 4-세포기, 상실배, 배반 포 형성율을 나타내었으며 (PV0.05), 0.25 mg/ml 첨가 수준에서도 4서] 포기, 상실배, 배반 포 형성에 있어 각각 56%, 54%, 35%를 보임으로써 대조군과 비교하여 유의적으로 낮은 발달 차이를 보였다(PV0.05). 따라서 hyaluronic acid 와 chondroitin sulfate 조합 첨가는 수정란의 발달을 저해함을 알 수 있었다.
- 5와 l.Omg/ml 첨가수준에서 상실배 형성(각각 59%, 60%)에 있어 대조군(79%)과 비교하였을 때 유의적인 발달 차이를 나타내었다 (P<0.05). 한편, 0.
- 그러나 배반 포 형성 시기에서 0.1, 0.5, 1.0mg/ml의 모든 첨가 수준에서 각각 51%, 59%, 53%를 보여 대조군(66%)보다 유의적으로 낮은 배반 포 형성율을 나타냄으로써 (P<Q05) dermatan sulfate는 수정란의 발달을 저해하는 결과를 가져왔다.
- 현재까지 보고된 연구에 의하면 chondroitin sulfhte는 폐쇄난포의 주요 물질이며(Beilin 등, 1984), 생식세포의 수정율을 저하시킨다고 보고되었다(Gitte 등, 1994). 그러나 이번 결과에서의 chondroitin sulfate는 배반포 발달을 촉진시킨다는 결과를 종합해 보았을 때 chondroitin sulfhte는 생식세포 발달에 있어 각 시기별로 다양한 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 05). 따라서 hyaluronic acid 와 chondroitin sulfate 조합 첨가는 수정란의 발달을 저해함을 알 수 있었다.
- 0mg/ml의 첨가 수준(각 각 63%, 64%, 63%)에서 대조군 중 혈청을 첨가하여 배양한 대조군(71%)과 비교하여 유의적 차이를 나타내지 않았다. 따라서 hyaluronic acid의 첨가는 0.1, 0.5, 1.0mg/ml의 농도 수준에서 혈청대체 효과 가 있었으며, 혈청이 없는 배양액에 배양한 대조군(51%)과 비교하였을 때 배반포발달에 유의적으로 대조군보다 높은 발달 차이를 나타냄으로써 hyaluronic acid의 첨가가 수정란의 발달에 좋은 효과가 있음을 나타내었다 (P<0.05).
- 05). 배반 포 형성율에 있어서는 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 모든 첨가 수준에서 혈청을 첨가한 대조군(70%)보다 낮은 발달 차이를 보였으며 (P< 0.05), 혈청이 없는 배양액에서 배양한 대조군(52 %) 과는 유의적인 차이를 나타내지 않음으로 dermatan sulfate는 첨가효과가 없었다.
- 혈청이 없는 배양액에 dermatan sulfate를 첨가한 결과는 Table 6과 같다. 배양액에 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml의 dermatan sulfate를 첨가하였을 때, 0.1 mg/ml 첨가수준에서 4-세포기 형성(71%)에 있어 대조군(각각 86%)과 다른 첨가 수준에서 보다 유의적으로 낮은 4-세포 기 형성율을 나타내었으며 (PC0.05), 상실배 형성율은 0.1, 1.0 mg/ml의 첨가 수준에서 각각 59%, 62%로써 대조군(84%)과 다른 첨가 수준보다 유의적으로 낮은 발달 차이를 나타내었다<P<0.05). 배반 포 형성율에 있어서는 0.
- 세포 발달에 가장 효과적인 영향을 준 hyaluronic acid와 chondroitin sulfate를 0.25 mg/ml과 0.5 mg/ ml 수준에서 각각 혼합첨가한 결과, 첨가하지 않은 대조군과 비교하였을 때 유의적으로 낮은 발달 차이를 보여 주었다{Table 7). 이 결과는 hyalur onic acid와 chondroitin sulfate의 조합이 수정란의 발달을 저해하였음을 나타냈는데, 가능한 작용기전은 다음과 같이 생각할 수 있다.
- 본 실험에서는 GAGs 물질 중 hyaluronic acid, chondroitin sulfate와 dermatan sulfate를 실험에 사용하였다. 이 물질들은 수정란의 공배양(CO-CU1- Oture)에 사용하는 난구세포층과 체액과 난포액에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 (Eriksen 등, 1994), 또한 본 실험 결과에서도 세포체외발달에 있어 중요한 영향을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. Hyaluronic acid를 혈청이 있는 배양액에 첨가한 결과 0.
- 최근 많은 연구자들에 의해 무혈청 배양체계에 대한 관심이 증가해 가고 있다. 이러한 연구 동향에 대한 접근의 일환으로 GAGs의 첨가는 무혈청 배 양 체계 확립의 가능성을 제시해 주었을 뿐만 아니라 수정란이식에 있어서도 동질의 수정란을 공급할 수 있는 배양체계 확립으로의 접근이 가능해졌다. 특히, 배양액에 혈청인자의 대체물질로 hyaluronic acid 0.
- 이상의 결과들을 종합하면, 여러 종류의 GAGs 중 hyaluronic acid와 chondroitin sulfate는 생쥐 수정란의 체외 배양에 있어 혈청 대체 효과를 나타냄으로써 궁극적으로 단순 배양액 배양체계를 확립하 는데 있어 기초자료로서의의가 있다. 그러나, 더 나아가 다른 종류의 GAGs를 첨가하였을 때 수정란 발달에 미치는 영향 그리고 GAGs를 농도별로 다양한 조합을 하였을 때 수정란 발달에 미치는 영향 등을 다각도로 조사함으로써, GAGs에 의한 혈청의 대체 효과를 극대화하여 무혈청 배양체계 확립과 단순 배양액 배양체계를 구축하는 방향으로 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 결과들을 종합하면, 여러 종류의 GAGs 중 hyaluronic acid와 chondroitin sulfate는 생쥐 수정란의 체외 배양에 있어 혈청 대체 효과를 나타냄으로써 궁극적으로 단순 배양액 배양체계를 확립하 는데 있어 기초자료로서의의가 있다. 그러나, 더 나아가 다른 종류의 GAGs를 첨가하였을 때 수정란 발달에 미치는 영향 그리고 GAGs를 농도별로 다양한 조합을 하였을 때 수정란 발달에 미치는 영향 등을 다각도로 조사함으로써, GAGs에 의한 혈청의 대체 효과를 극대화하여 무혈청 배양체계 확립과 단순 배양액 배양체계를 구축하는 방향으로 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 5mg/ml을 첨가하였을 때 혈청의 대체 효과가 나타났는데, 이러한 결과를 통해 혈청인자 대신 GAGs를 첨가함으로써 기존의 포유동물의 체외 배양에 있어 혈청첨가에 의해 발생되는 세포 이상과 기형을 줄이고, 각 혈청 인자간에서 생기는 조성분의 차이를 줄이므로 생명공학 연구의 기초적인 연구자료가 될 뿐 아니라 수정란 이 식에 있어 더욱 체계적이고 보편적인 배양 효과를 가져올 것으로 사료된다. 그러므로 더 나아가 GAGs 의 다양한 조합을 통한 배양액 첨가와 시기별로 다른 순차적(sequencial) 첨가에 의한 수정란의 발달에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
- 이러한 연구 동향에 대한 접근의 일환으로 GAGs의 첨가는 무혈청 배 양 체계 확립의 가능성을 제시해 주었을 뿐만 아니라 수정란이식에 있어서도 동질의 수정란을 공급할 수 있는 배양체계 확립으로의 접근이 가능해졌다. 특히, 배양액에 혈청인자의 대체물질로 hyaluronic acid 0.1, 0.5, 1.0mg/ml의 첨가와 chondroitin sulfate 0.5mg/ml을 첨가하였을 때 혈청의 대체 효과가 나타났는데, 이러한 결과를 통해 혈청인자 대신 GAGs를 첨가함으로써 기존의 포유동물의 체외 배양에 있어 혈청첨가에 의해 발생되는 세포 이상과 기형을 줄이고, 각 혈청 인자간에서 생기는 조성분의 차이를 줄이므로 생명공학 연구의 기초적인 연구자료가 될 뿐 아니라 수정란 이 식에 있어 더욱 체계적이고 보편적인 배양 효과를 가져올 것으로 사료된다. 그러므로 더 나아가 GAGs 의 다양한 조합을 통한 배양액 첨가와 시기별로 다른 순차적(sequencial) 첨가에 의한 수정란의 발달에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
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