During the recent epidemic period ($1995{\sim}1996$), seven strains of rubella virus were isolated in Korea. To analyze phylogenetic relationship between seven Korean strains and rubella virus strains from other different geographical areas, structural genes (E1, E2 and C) of Korean strai...
During the recent epidemic period ($1995{\sim}1996$), seven strains of rubella virus were isolated in Korea. To analyze phylogenetic relationship between seven Korean strains and rubella virus strains from other different geographical areas, structural genes (E1, E2 and C) of Korean strains were enzymatically amplified and automatically sequenced. The sequence similarities of the E1, E2 and C genes of the cosmopolitan types were $95.8{\sim}98.1%$, $92.6{\sim}99.2%$ and $96.4{\sim}99.3%$ based on 1,441, 122 and 139 nucleotides and $96.9{\sim}98.5%$, $90{\sim}100%$ and $97.8{\sim}100%$ based on 480, 40 and 46 amino acids compared to the sequences of strain RA27/3, respectively. In contrast, the sequence similarities of the E1, E2 and C genes of the Asian types were $91.5{\sim}92.1%$, $83.6{\sim}88.5%$ and 91.4% based on nucleotides and $96.9{\sim}97.7%$, 85.5% and 97.8% based on amino acids compared to the sequences of strain RA27/3, respectively. However, immunodominent epitopes of the E1 gene of the cosmopolitan and Asian types were well conserved, and the growth patterns in cell culture and immunofluorescent antibody titers in cross-reaction test showed no differences between two different types. In phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of each gene regions, the cosmopolitan and Asian types formed two distinct phylogenetic lineages. These data showed two distinct genotypes of rubella viruses cocirculated in Korea, but no significant differences in the antigenicity of two different rubella virus strains were found.
During the recent epidemic period ($1995{\sim}1996$), seven strains of rubella virus were isolated in Korea. To analyze phylogenetic relationship between seven Korean strains and rubella virus strains from other different geographical areas, structural genes (E1, E2 and C) of Korean strains were enzymatically amplified and automatically sequenced. The sequence similarities of the E1, E2 and C genes of the cosmopolitan types were $95.8{\sim}98.1%$, $92.6{\sim}99.2%$ and $96.4{\sim}99.3%$ based on 1,441, 122 and 139 nucleotides and $96.9{\sim}98.5%$, $90{\sim}100%$ and $97.8{\sim}100%$ based on 480, 40 and 46 amino acids compared to the sequences of strain RA27/3, respectively. In contrast, the sequence similarities of the E1, E2 and C genes of the Asian types were $91.5{\sim}92.1%$, $83.6{\sim}88.5%$ and 91.4% based on nucleotides and $96.9{\sim}97.7%$, 85.5% and 97.8% based on amino acids compared to the sequences of strain RA27/3, respectively. However, immunodominent epitopes of the E1 gene of the cosmopolitan and Asian types were well conserved, and the growth patterns in cell culture and immunofluorescent antibody titers in cross-reaction test showed no differences between two different types. In phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of each gene regions, the cosmopolitan and Asian types formed two distinct phylogenetic lineages. These data showed two distinct genotypes of rubella viruses cocirculated in Korea, but no significant differences in the antigenicity of two different rubella virus strains were found.
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제안 방법
El gene sequence에서 1787~3225 위치의 유전자 부위 를 각각 EcoRI, Notl 제 한효소 인식부위가 있는 1쌍의 primer를 사용하여 증폭한 후, T4 DNA ligase (Promega, Madison, WI)를 사용하여 pT7 blue T vector (Novagen, Madison, WI)에 연결하고 DH5a (Promega, Madison, WI) 대장균주에 형질전환 시킨 후, EcoRI, Notl 제한효소로 E1 유전자의 삽입 을 확인하였다. 이 확인된 colony에서 E1 유전자를 다량으로 얻은 후, 발현 벡터 pGEX-5X-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 다시 연결하고, DH5a에 형질전환하였다.
LaserGene program (DNASTAR, Madison, WI)을 사용하여 풍진 봐이 러 스주들의 cDNA 염 기 서 열과 deduced 아미노산서열을 기 존에 알려진 백신주 및 외국에서 분리된 바이러스주들의 (Table 2) 염기서열 및 deduced 아미노산서 열과 비교분석하고 계통분석을 시행하였다.
PCR 반응액 50 pl에 cDNA 산물 5 pl, 50 nM 1차 primer 한쌍, 10 mM Tris-HQ (pH 8.8), 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCh, 200 pM dNTPs, 0.02 unit DynaZyme (Finnzyme OY, Finland)를 넣 고 mineral oil을 첨가한 후 SingleBlock thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)에서 35회 주기로 증폭하였다. 증폭에 사용한 주기는 첫번째 주기는 9*0 5 5분, 55 ℃ 1분 30초, 72V 3분이 며, 증폭에는 95 V 1분 3。초, 55 V 1분 30초, 72 ℃ 2분으로 35회 반복하고, 마지막 주기로는 951! 1분, 551분, 72*0 10분을 이용하였다.
7% 정도의 염기 서열상의 차이를 보이는 Asian type의 2가지 유전형으로 구분되었다. 따라서 본 연구에서는 2가지 유전형으로 구분되는 국내 분리 주들의 배 양양상 및 혈청 학적 차이를 조사하고 병 원성 및 항원성에 중요한 epitope을 포함하고 있는 풍진바이 러 스 E1 유전자 및 바이 러스 구조단백을 coding 하는 E2, C 유전자 부위의 분석과 발현을 통하여 국내 분리 풍진바이러스주의 유전학적 특성 규명과 현재사용하고 있는 백신주와의 비교분석을 시행하였다.
바이 러스 유전형에 따른 증식 양상의 비교실험에 는 104 PFU/ml로 조정 한 각 바이 러 스 상층액을 사용하였으며 간접형 광항체법 을 이용하여 표준 균주 및 분리주간의 반응양상의 차이를 분석하였다. 항혈청은 표준균주 및 분리주의 배 양상층액을 ICRmice에 접 종하여 제조하였으며 아래 와 같이 간접형 광항체법을 시 행하였다.
Louis, MO) 1:10000 희석용액으로 30 분간 반응시 켰다. 반응의 확인은 ECL kit (Amers- ham, Cleveland, Ohio)을 사용하였으며, 기질인 ECL 용액 1과 2를 동량 섞 은 후, NC membrane을 골고루 적셔서 cassette에 넣어 CP-blue film (AGFA, Be-Igium)에 적당시간 노출시킨 후, 현상하여 판독 하였다.
정 방향으로 삽입 이 확인된 재조합 DNA는 발현 숙주인 BL21(DE3)pLysS로 다시 형질전환시키고, IPTG를 최 종농도 1 mM이 되도록 첨가하여 3시간 동안 단백질의 발현을 유도하였다. 발현된 단백질은 gluthathione-sepharose 4B (Sigma, ST. Louis, MO) affinity column 으로 부분 정제한 후 10% SDS-PAGE gel에서 발현을 확인하였다. 이 10% SDS-PAGE gel상의 단백질을 XceU IITM Mini-Cell (Novex, San Diego, CA) transfer mo- dule에서 150 mA로 3시간 동안 nitrocellulose (NC) membrane (Schleicher & Schuell, Keene, NH) 에 옮긴 후, 5% skim milk (DIFCO, Detroit, MI)로 밤새 blocking 하였다.
우리 나라에서 분리 된 풍진바이 러 스 El, E2 및 C 유전자의 염기서열을 토대로 deduced 아미노산 서 열을 분석하였다. E1 단백 은 전부를 포함하는 481 amino acid를 E2 단백은 amino-termial 부위 40 amino acid를, C 유전자는 carboxy-terminal 부위 45 amino acid를 분석정열하였다 (Figure 1).
4)로 2배 계단희석된 혈청을 각 well에 가하고 37P 에서 30분간 반응시켰다. 인산완충식 염수로 3회 세 척 건조한 후 이 차항체 인 FITC-conju- gated anti-mouse IgG을 슬라이 드 각 well에 25 )11 씩을 가하고 37P 에서 30분간 반응시 킨 후 다시인산완충식 염수와 증류수로 세척, 건조 후 형광현미경 (Axioscop, Zeiss, Germemy) 하에서 400배의 배율로 특이형광점을 관찰하였다.
이 확인된 colony에서 E1 유전자를 다량으로 얻은 후, 발현 벡터 pGEX-5X-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 다시 연결하고, DH5a에 형질전환하였다. 정 방향으로 삽입 이 확인된 재조합 DNA는 발현 숙주인 BL21(DE3)pLysS로 다시 형질전환시키고, IPTG를 최 종농도 1 mM이 되도록 첨가하여 3시간 동안 단백질의 발현을 유도하였다. 발현된 단백질은 gluthathione-sepharose 4B (Sigma, ST.
2 μ1와 30~100 ng template을 첨 가하고 mineral oil을 가하여 them시 cyclei■로 25회 주기 로 증폭했다. 증폭에 사용한 주기 는 96 ℃ 30초, 5013 15초, 60Q 4분이며 첫번째 주기는 9612 5분이었으며 4% polyacrylamide sequencing gel에서 3000 V로 전기 영동하고 ABI PRISM™377 DNA Sequencer로 염기서열 결과를 판독하였다.
풍진바이러스 계통분석에서 Asian type에 속하는 국내 풍진 바이 러 스의 E1 부위 를 GST fusion 단백질 발현 벡터 pGEX5X-3에 cloning 하였고, 숙주 BL21(DE3)pLysS에서 GST-E1 fusion 단백질을 발현시켰다. 발현 단백질을 GST-affinity chromatogra- phy로 정제하여 SDS-PAGE상에서 단백질의 정제 도와 예상되는 81 kDa의 분자량을 확인하였으며 발현 단백질의 antigen으로서의 생물학적 기능을 확인함에 있어서 western blotting을 시행한 결과 anti-rubella Ab와 특이 적 으로 반응함을 확인하였다 (Figure 3).
대상 데이터
RA27/3주 (ATCC VR1359)를 표준균주로 사용하였으며 국내 분리주로는 1995년 및 1996년 풍진 대유행 기 에 분리 된 7주의 분리주 (Anam95, Anam96-1, Anam96-2, Anam96-3, Anam96-4, Anam96-5 및 Anam96-6)를 사용하였다.
성능/효과
Asian type과 cosmopolitan type간에 차이를 보이는 특이 한 변이 들은 각 유전자 부위 에서 23개, 11개 및 10개가 관찰되 었으며 동일한 Asian type과 cosmopolitan type 내에서도 국내 분리 주와 외국 분리 주간에 차이를 보이는 변이가 Asian type간에는 분석 가능하였던 E1 유전자 부위 에서 13개가, cosmopolitan type간에는 각 유전자 부위 에서 각각 4개 씩 이 관찰되었다. Asian type 및 cosmopolitan type 의 구분에 관계없이 국내 분리주에서만 관찰되는 고유한 변이가 E1 및 C 유전자 부위 에서 각각 1개 씩 특이하게 관찰되었다.
국내 분리주에서 관찰되는 변이는 대부분이 transition이었고 codon 위치상에서 세번째의 변이가 주로 발생하였으며 deletion이나 insertion 등의 frame-shift 변이는 관찰되지 않았다. Asian type과 cosmopolitan type간에 차이를 보이는 특이 한 변이 들은 각 유전자 부위 에서 23개, 11개 및 10개가 관찰되 었으며 동일한 Asian type과 cosmopolitan type 내에서도 국내 분리 주와 외국 분리 주간에 차이를 보이는 변이가 Asian type간에는 분석 가능하였던 E1 유전자 부위 에서 13개가, cosmopolitan type간에는 각 유전자 부위 에서 각각 4개 씩 이 관찰되었다. Asian type 및 cosmopolitan type 의 구분에 관계없이 국내 분리주에서만 관찰되는 고유한 변이가 E1 및 C 유전자 부위 에서 각각 1개 씩 특이하게 관찰되었다.
8%의 상동성을 나타내 었다. Asian type과 cosmopolitan type간에 차이를 보이는 특이한 변이들은 각 단백 부위에서 1개, 4개 및 1개가 관찰되었으며 동일한 Asian type과 cosmopolitan type 내에서도 국내 분리 주와 외국 분리주간에 차이를 보이는 변이가 Asian type간에는 분석 가능하였던 E1 단백 부위에서 5개 가, cosmopolitan type간에 는 El 및 E2 단백 에서 는 1개 및 2개가 관찰된 반면 C 단백 부위 에서는 이러한 변이가 관찰되지 않았다.
이와 같이 동일한 지역 내에서 두 종류의 풍진바이 러스가 공존하는 양상은 홍콩지역 에서 분리 된 두 풍진바이 러 스주에서 도 관찰되었으며 이 홍콩 분리주들은 국내 분리주 와 계통분석상에서 가장 밀접한 연관성을 나타내었다. El, E2 및 C 단백의 아미 노산서열을 토대로 시행한 계통분석에서는 E2 단백에서만 Asian type 과 cosmopolitan type 두 계통군의 구분이 관찰되 었으며 E1 및 C 단백에서는 Asian type과 cosmopolitan type이 혼재하는 양상으로 분포하였다.
않았다. 각기 계통학적 으로 차이를 보이는 두 군의 풍진바이러스가 동시에 유행한 사실이 규명되기는 하였으나 본 연구 결과에서 확인된 바와 같이 혈청형 이 다른 풍진 바이러스는 분리되지 않았다. 항원성에 중요한 E1 유전자의 염기서열 분석에서 Asian type과 cosmopolitan type간에 약 8%의 변이율이 관찰되었으나 아미노산 서열상에서는 약 2% 내외의 차이만이 관찰되었고, 면역 학적으로 중요한 epitope들이 잘 보전되 어있었으며, E1 단백의 3차원 구조분석에서도 의미 있는 차이는 발견되지 않았다.
2 X 106 PFU/ml이 었다. 따라서 국내 분리주인 Anam 96-1 주와 Anam96-5주는 각기 다른 유전형 에 속하나 증식정도에 차이를 나타내지 않았던 반면 표준 균주인 RA27/3주는 같은 유전형 의 국내 분리 주에 비해 낮은 증식정도를 나타내었다. 간접형광항체법을 이용한 바이 러스 동정시험에서 국내 분리 주들은 유전형에 관계없이 표준균주와 비교하여 항체가의 차이를 보이지 않았다.
발현 단백질을 GST-affinity chromatogra- phy로 정제하여 SDS-PAGE상에서 단백질의 정제 도와 예상되는 81 kDa의 분자량을 확인하였으며 발현 단백질의 antigen으로서의 생물학적 기능을 확인함에 있어서 western blotting을 시행한 결과 anti-rubella Ab와 특이 적 으로 반응함을 확인하였다 (Figure 3).
우리나라에 분포하는 풍진바이러스 아미노산서열의 유형은 E1 및 E2 외피단백의 경우에는 Asian type 및 cosmopolitan type의 구분이 가능하였으나 capsid 단백인 C 단백의 경우에는 의미 있는 차이가 관찰되지 않았다. 아미노산서열상에서 국내 분리주 상호 간의 El, E2 및 C 단백 부위의 상동성은 97.9- 99.8%, 85.0-100% 및 97.8~100%이었으며, 표준 균주인 RA27/3주와 비 교시 국내 분리 주 중 cosmopolitan type주는 각 단백 부위 에서 97.9—98.1%, 90.0% 및 100%의 상동성을 보인 반면 Asian type 주는 각각 96.9%, 85.0% 및 97.8%의 상동성을 나타내 었다. Asian type과 cosmopolitan type간에 차이를 보이는 특이한 변이들은 각 단백 부위에서 1개, 4개 및 1개가 관찰되었으며 동일한 Asian type과 cosmopolitan type 내에서도 국내 분리 주와 외국 분리주간에 차이를 보이는 변이가 Asian type간에는 분석 가능하였던 E1 단백 부위에서 5개 가, cosmopolitan type간에 는 El 및 E2 단백 에서 는 1개 및 2개가 관찰된 반면 C 단백 부위 에서는 이러한 변이가 관찰되지 않았다.
2~100%의 상동성을 나타내었다. 우리나라 에서 풍진예방백신으로 가장 많이 사용되고 있는 cosmopolitan type의 RA27/3주와 비 교시 국내 분 리주 중 cosmopolitan type으로 분석 된 Anam96-2, Anam96-3, Anam96-5 및 Anam96-6주는 각 유전자 부위에서 95.9~96.3%, 92.6% 및 96.4~97.1%의 상동성을 보인 반면 Asian type으로 분석된 Anam 95-1, Anam96-1 및 Anam96M주는 각각 915-91.7%, 88.5-87.7% 및 91.4%의 상대적으로 낮은 상동성 을 나타내었다. 국내 분리주에서 관찰되는 변이는 대부분이 transition이었고 codon 위치상에서 세번째의 변이가 주로 발생하였으며 deletion이나 insertion 등의 frame-shift 변이는 관찰되지 않았다.
E1 단백 은 전부를 포함하는 481 amino acid를 E2 단백은 amino-termial 부위 40 amino acid를, C 유전자는 carboxy-terminal 부위 45 amino acid를 분석정열하였다 (Figure 1). 우리나라에 분포하는 풍진바이러스 아미노산서열의 유형은 E1 및 E2 외피단백의 경우에는 Asian type 및 cosmopolitan type의 구분이 가능하였으나 capsid 단백인 C 단백의 경우에는 의미 있는 차이가 관찰되지 않았다. 아미노산서열상에서 국내 분리주 상호 간의 El, E2 및 C 단백 부위의 상동성은 97.
E1 유전자는 coding 부위 전체인 1443 bp를, E2 유전자는 5' 시 작부위 122 bp를, C 유전자는 3' 말 단부위 140 bp를 분석하였다. 우리나라에 분포하는 풍진바이러스 염기서열의 유형은 각 유전자 부 위에 관계없이 cosmopolitan 및 Asian type의 2군으 로 구분되 었으며 국내 분리주 상호간에는 E1,E2 및 C 유전자 부위에서 91.5-99.6%, 83.6-100% 및 89.2~100%의 상동성을 나타내었다. 우리나라 에서 풍진예방백신으로 가장 많이 사용되고 있는 cosmopolitan type의 RA27/3주와 비 교시 국내 분 리주 중 cosmopolitan type으로 분석 된 Anam96-2, Anam96-3, Anam96-5 및 Anam96-6주는 각 유전자 부위에서 95.
E2 단백은 풍진바이러스의 strain-specific 항원을 지니고 있는 것으로 알려져 있으며 본 연구에서도 가장 높은 변이율을 나타내 었으며 아미 노산서 열을 토대 로한 계통수에 서도 유일하게 두 유전형이 각기 다른 계통군을 형성하였다. 일반적인 바이러스들에서도 그 항원성이 잘 보전되어 있는 C 단백의 경우에는 본 연구에서도 가장 낮은 변이율을 나타내 었으며 따라서 풍진 바이러스의 변이율은 E2, El, C 유전자 부위 순으로 분석되었다.
본 연구에서도 E2 및 C 유전자 부위의 분석에는 많은 문제점들이 있었다. 증폭 뿐만 아니라 증폭된 산물의 염기서열 결정에 이르기까지 높은 G+C content에 따른 여러 어려운 점으로 인해 C와 E2 유전자의 경계부위 258 bp의 염기서열분석만이 가능하였다. E2 단백은 풍진바이러스의 strain-specific 항원을 지니고 있는 것으로 알려져 있으며 본 연구에서도 가장 높은 변이율을 나타내 었으며 아미 노산서 열을 토대 로한 계통수에 서도 유일하게 두 유전형이 각기 다른 계통군을 형성하였다.
바이러스 배양실험에서 두 군간에 배양특성에 차이가 없었으며 형광 항체검사에서도 항체가의 차이를 발견할 수 없었던 점도 두 군간에 항원성에 별 차이가 없음을 증명하고 있다. 특히 Katow 등이 [7] Asian type 에 속하는 중국 분리 주인 BDR2주를 이용한 중화항체 검사에서 cosmopolitan type에 속하는 분리 주들과 비교시 중화항체가에 차이를 발견하지 못한 점과 본 연구에서 발현한 Asian type El gene 산물이 cosmopolitan type에 속하는 표준균주 및 국내 분리 주를 이용한 항혈청과의 반응성이 동일 균주를 이용한 항혈청과의 반응성과 차이를 나타내지 않은 결과는 풍진바이러스의 변이정도가 아직까지는 새로운 변이주의 줄현에까지는 이르지는 못하고 있음을 보여주고 있다고 하겠다.
풍진바이 러 스 증식 배 양 비 교실험에서 IO, PFU/ ml의 동일한 바이 러스 양을 접종하고 동일 조건에서 4일간 배 양한 후 관찰한 바이 러스 증식정도는 cosmopolitan type에 속하는 RA27/3주와 Anam 9&5주는 각각 2 X104 PFU/ml 및 0.9 X106 PFU/ml 이 었으며 Asian type에 속하는 Anam96-1 주는 1.2 X 106 PFU/ml이 었다. 따라서 국내 분리주인 Anam 96-1 주와 Anam96-5주는 각기 다른 유전형 에 속하나 증식정도에 차이를 나타내지 않았던 반면 표준 균주인 RA27/3주는 같은 유전형 의 국내 분리 주에 비해 낮은 증식정도를 나타내었다.
풍진바이러스 El, E2 및 C 유전자의 염기서열을 토대로 계통분석을 시행한 결과 (Figure 2) 1995- 1996년에 우리 나라에서 유행 한 풍진 바이 러 스는 Asian type과 cosmopolitan type의 두 계통군으로 명확하게 구분되었다. 이와 같이 동일한 지역 내에서 두 종류의 풍진바이 러스가 공존하는 양상은 홍콩지역 에서 분리 된 두 풍진바이 러 스주에서 도 관찰되었으며 이 홍콩 분리주들은 국내 분리주 와 계통분석상에서 가장 밀접한 연관성을 나타내었다.
항원성 에 중요한 E1 단백의 아미 노산서 열 중 4개 의 규명 된 epitope 부위 는 Asian type과 cosmopolitan types] 구분없이 모두 잘 보전되어 있었으며 E1 단백의 3차원 구조분석에서도 alpha-helix와 beta-sheet의 미세한 변화만이 관찰되었으며 전반적인 항원성이나 친수성 등 단백질 구조 및 특성에 영향을 주는 중요한 변화는 관찰되지 않았다(data not shown).
각기 계통학적 으로 차이를 보이는 두 군의 풍진바이러스가 동시에 유행한 사실이 규명되기는 하였으나 본 연구 결과에서 확인된 바와 같이 혈청형 이 다른 풍진 바이러스는 분리되지 않았다. 항원성에 중요한 E1 유전자의 염기서열 분석에서 Asian type과 cosmopolitan type간에 약 8%의 변이율이 관찰되었으나 아미노산 서열상에서는 약 2% 내외의 차이만이 관찰되었고, 면역 학적으로 중요한 epitope들이 잘 보전되 어있었으며, E1 단백의 3차원 구조분석에서도 의미 있는 차이는 발견되지 않았다. 바이러스 배양실험에서 두 군간에 배양특성에 차이가 없었으며 형광 항체검사에서도 항체가의 차이를 발견할 수 없었던 점도 두 군간에 항원성에 별 차이가 없음을 증명하고 있다.
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