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제안 방법
- 국내 분리주인 C. albicans KNIH10주로부터 enolase를 순수 분리하기 위하여 배양된 세포를 회수하고 French pressure로 파쇄 후 60—80% ammonium sulfate로 침전시켜서 일차적으로 enolase의 유무를 확인하였다. 그리고 기존에 보고되어 있는 enolase의 아미노산 서열에 대한 pl값을 계산해본 결과 약 5.
- 국내 칸디다증 환자로부터 분리된 C. albicans를 이용하여 Ollert 등14)의 방법에 의한 acid proteinase 측정법과 IO, cells/ml의 균체를 마우스 꼬리정맥에 접종한 후 치사율 및 침습된 조직의 CFU(colony forming unit)를 측정하였다. 그 결과 C.
- 3에서 보는 바와 같이 동일조건에서 실험을 실시할 경우 세포를 파쇄후 freeze-dryer로 전체 단 백질을 농축한 경우가(lane 1) ammonium sulfate를 이용하여 0~80%로 침 전후 농축할 경우 (lane 2)보다는 단백질 회수율이 높았다. 그러나 FPLC를 위하여 column을 사용할 경우 여러 종류의 단백질이 혼합되어 있으면 enolase의 분리율 및 회수율이 감소하기 때문에 ammonium sulfate를 이용하여 실험을 진행하였다. Fig.
- 0pt">℃에서 투석을 실시하였다. 그리고 FPLC(fast performance liquid chromatography)를 이용하여 효소를 분리하였다. FPLC에 이용된 columne DEAE-Sepharose로 충전한 후 이용하였고, 완충용액 은 0.
- 본 실험에 사용된 dextrose, peptone, yeast extract, Sabouraud dextrose agar 등 배지 성분은 Difco사로 부터, ammonium sulfate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate(BCIP), 4-nitro blue tetrazolium chloride(NBT) 및 phosphate buffered saline(PBS)은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 그리고 균주의 배양에 이용된 YEPD 배지는 증류수 1L에 dextrose, peptone, yeast extract를 각각 2%, 2% 및 1%씩 첨가하여 사용하였다.
- albicans KNIH10주로부터 enolase를 순수 분리하기 위하여 배양된 세포를 회수하고 French pressure로 파쇄 후 60—80% ammonium sulfate로 침전시켜서 일차적으로 enolase의 유무를 확인하였다. 그리고 기존에 보고되어 있는 enolase의 아미노산 서열에 대한 pl값을 계산해본 결과 약 5.25 정도를 나타냄으로4,11) anion exchange chromatography인 DEAE-sepharose column에 충전시킨 후 FPLC를 이용하였다18). Column으로부터 enolase의 분리는 1M NaCl까지 농도구배를 주어 분리하였으며 각각의 firaction별로 시료를 채취하였다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 국내 임상 환자로부터 분리된 칸디다 균주중 생체외 검사에서 acid proteinase 분석과 생체 내 동물독성실험을 통해 가장 독력이 강한 Candida albicans KNIH10을 우수 균주로 선정하고 이 균주로부터 enolase를 분리하였다. 그리고 분리된 항원을 이용하여 정상인과 침습성 칸디다증이 의심되는 칸디다혈증 및 백혈구 감소증 환자의 혈청내 항체 유무를 immunoblotting을 실시하여 enolase의 면역학적 측정용 항원으로서의 감수성과 특이성을 연구하였다.
- 1에서 보는 바와 같이 비결합 단백질은 완충용액으로 유출시키고 NaCl을 이용하여 column에 결합되어 있는 단백질을 분리한 결과 FPLC로부터 유출되는 단백질은 3종류로 나타남을 확인하였다. 따라서 3종류의 peak를 중심으로 획득한 시료들을 농축하고 SDS-PAGE를 이용하여 47kDa의 단백질 양상을 확인하였다. 그 결과 31번째의 fraction tube에서 단일밴드가 나타남을 알 수 있었으며, 그 위치가 47kDa의 단백질 위치임을 알 수 있었다[Fig.
- 따라서 본 연구에서는 국내 임상 환자로부터 분리된 칸디다 균주중 생체외 검사에서 acid proteinase 분석과 생체 내 동물독성실험을 통해 가장 독력이 강한 Candida albicans KNIH10을 우수 균주로 선정하고 이 균주로부터 enolase를 분리하였다. 그리고 분리된 항원을 이용하여 정상인과 침습성 칸디다증이 의심되는 칸디다혈증 및 백혈구 감소증 환자의 혈청내 항체 유무를 immunoblotting을 실시하여 enolase의 면역학적 측정용 항원으로서의 감수성과 특이성을 연구하였다.
- 2, (A)]. 따라서 이 단일밴드가 enolase임을 확인하기 위해서 Saccharo- myces cerevisiae의 enolase를 기준으로 확인하였고, candidemia 환자의 혈청을 이용하여 immunoblot- ting을 실시하였다. 그 결과 lane 2에서 가장 강력한 항체가 감지됨을 확인할 수 있었으며[Fig.
- 배양액으로부터 세포를 회수하고 PBS로 3회 세척 후 French pressure(SLM-AMINCO)를 이용하여 20, 000 PSI 상태에서 세포를 3회 파쇄하였다. 파쇄된 세포액은 원심분리하여 상층액을 회수하고 freeze-dryer를 이용하여 농축하거나 ammonium sulfate를 이용하여 60~80% 침전물을 회수하였다.
- albicans KNIH10 균주로부터 분리된 enolase 항원을 이용하여 환자 혈청 내 항체의 존재 유무를 검사하였는데, 임상검체로는 전남대학교병원에서 수집된 40명의 정상인, 24명의 백혈구 감소증 환자 및 15명의 칸디다혈증 환자로부터의 혈청 총 79예를 이용하였다. 칸디다혈증 환자에 대한 enolase 항체 검사 결과는 환자군을 칸디다혈증의 원인에 따라 혈관 카테터 연관 칸디다혈증(catheter related candidemia, CRC)과 비 카테타 연관 칸디다혈증으로 다시 세분하여 분석하였다. 카테터 연관 칸디다혈증은 제거된 혈관 카테터 tip 배양에서 15개 이상의 집락이 배양된 경우로서 카테터 제거 후 24시간 이후 더 이상 칸디다균이 분리되지 않은 예로 하였다.
대상 데이터
- C. albicans KNIH10 균주로부터 분리된 enolase 항원을 이용하여 환자 혈청 내 항체의 존재 유무를 검사하였는데, 임상검체로는 전남대학교병원에서 수집된 40명의 정상인, 24명의 백혈구 감소증 환자 및 15명의 칸디다혈증 환자로부터의 혈청 총 79예를 이용하였다. 칸디다혈증 환자에 대한 enolase 항체 검사 결과는 환자군을 칸디다혈증의 원인에 따라 혈관 카테터 연관 칸디다혈증(catheter related candidemia, CRC)과 비 카테타 연관 칸디다혈증으로 다시 세분하여 분석하였다.
- 25 정도를 나타냄으로4,11) anion exchange chromatography인 DEAE-sepharose column에 충전시킨 후 FPLC를 이용하였다18). Column으로부터 enolase의 분리는 1M NaCl까지 농도구배를 주어 분리하였으며 각각의 firaction별로 시료를 채취하였다(Fig. 1). Fig.
- 5x105 CFU/g로 가장 높게 나타났다(data not shown). 따라서 동물독성이 강하며 침습성이 높은 C. albicans KNIH10주를 최종 표준항원 대표균주로 선발하였고 선발된 균주를 대상으로 실험을 진행하였다.
- 본 실험에 사용된 dextrose, peptone, yeast extract, Sabouraud dextrose agar 등 배지 성분은 Difco사로 부터, ammonium sulfate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate(BCIP), 4-nitro blue tetrazolium chloride(NBT) 및 phosphate buffered saline(PBS)은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 그리고 균주의 배양에 이용된 YEPD 배지는 증류수 1L에 dextrose, peptone, yeast extract를 각각 2%, 2% 및 1%씩 첨가하여 사용하였다.
- 본 실험에서 enolase 항원분리에 사용한 균주는 국내 칸디다증 환자로부터 분리한 C. albicans 균주들로부터 동물실험과 acid proteinase 활성도 시험 을 통하여 독력이 가장 강한 C. albicans KNIH10을 선발하여 이용하였다.
이론/모형
- Laemmli 방법8)에 따라 12% sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE)에 전기영 동을 실시 후 Towbin 등17)의 방법에 따라 nitrocellulose membrane으로 단백질을 옮겼다. 그리고 5% skim milk-PBS(pH 7.
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