Bacillus anthracis, the etiological agent of anthrax has been classified into the Bacillus subgroup I with B. cereus, B. mycoides and B. thuringiensis based on morphological and DNA similarity. DNA studies have further indicated that these species have very AT-rich genomes and high homology, indeed ...
Bacillus anthracis, the etiological agent of anthrax has been classified into the Bacillus subgroup I with B. cereus, B. mycoides and B. thuringiensis based on morphological and DNA similarity. DNA studies have further indicated that these species have very AT-rich genomes and high homology, indeed it has been proposed that these four sub-species be recognized as members of the one species. Several methods have been developed to obtain good differentiation between these species. However, none of these methods provides the means for an absolutely correct differntiation. The analysis of fatty acid methyl esters (FAMEs) was employed as a quick, simple and reliable method for the identification of 21 B. anthracis strains and closley related strains. The most significant differences were found between B. anthracis and B. anthracis closely related strains in FAMEs profiles. All tested strains of B. anthracis had a branched fatty acid C17:1 Anteiso A, whereas the fraction of unsaturated fatty acid Iso C17:1 w10c was found in B. anthracis closely related strains. By UPGMA clustering analysis of FAMEs profiles, all of the tested strains were classified into two clusters defined at Euclidian distance value of 24.5. The tested strains of B. anthracis were clustered together including Bacillus sp. Kyungjoo 3. However, the isolates of B. anthracis closely related spp. Rho, S10A, 11R1, CAU9910, CAU9911, CAU9912 and CAU9913 were clustered with the other group. On the basis of these results, isolates of B. anthracis Bongchon, Kyungjoo 1, 2 and Bacillus sp. Kyungjoo 3 were reclassified as a B. anthracis. It is concluded that FAMEs analysis provides a sensitive and reliable method for the identification of B. anthracis from closely related taxa.
Bacillus anthracis, the etiological agent of anthrax has been classified into the Bacillus subgroup I with B. cereus, B. mycoides and B. thuringiensis based on morphological and DNA similarity. DNA studies have further indicated that these species have very AT-rich genomes and high homology, indeed it has been proposed that these four sub-species be recognized as members of the one species. Several methods have been developed to obtain good differentiation between these species. However, none of these methods provides the means for an absolutely correct differntiation. The analysis of fatty acid methyl esters (FAMEs) was employed as a quick, simple and reliable method for the identification of 21 B. anthracis strains and closley related strains. The most significant differences were found between B. anthracis and B. anthracis closely related strains in FAMEs profiles. All tested strains of B. anthracis had a branched fatty acid C17:1 Anteiso A, whereas the fraction of unsaturated fatty acid Iso C17:1 w10c was found in B. anthracis closely related strains. By UPGMA clustering analysis of FAMEs profiles, all of the tested strains were classified into two clusters defined at Euclidian distance value of 24.5. The tested strains of B. anthracis were clustered together including Bacillus sp. Kyungjoo 3. However, the isolates of B. anthracis closely related spp. Rho, S10A, 11R1, CAU9910, CAU9911, CAU9912 and CAU9913 were clustered with the other group. On the basis of these results, isolates of B. anthracis Bongchon, Kyungjoo 1, 2 and Bacillus sp. Kyungjoo 3 were reclassified as a B. anthracis. It is concluded that FAMEs analysis provides a sensitive and reliable method for the identification of B. anthracis from closely related taxa.
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문제 정의
이 연구에서는 B. anthracise: 포함하는 Bacillus subgroup I 대세포 그룹균들 대상으로 균체의 세포벽 에 존재하는 FAMEs 조성 을 분석하여 B. anthracis의 동정법 으로서 의 이 용 가능성을 조사하고자 하였다.
이 연구에서는 국내에서 분리된 B. anthracise- Bacillus subgroup I에 속하는 유사균주들을 대 상으로 FAMEs 조성 을 분석하여 새로운 B. anthracis 동정 법 으로서 의 이 용 가능성을 조사하였다.
제안 방법
5주의 B. anthracise Bacillus subgroup I에 속한 표준 균주들을 대상으로 Nutrient agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, U.S.A.)에서 37*0 로 각각 24시간과 48시간 배 양한 후 FAMEs 조성 을 비교하였다. 실험 결과 48시간 배양 후의 FAMEs 조성에서 24시간 배양 결과보다 높은 재현성을 보여주었다.
GC 분석 조건은 carrier로서 H2 gas를 사용하고 검출기는 FID detector, 초기 온도 17013, 최종 270*0, 검출기 30012 그리고 Injecter 25010 등으로 하였다. FAMEs profilee MIS Software (Microbial ID, Inc., Newark, DE, U.S.A.)를 이용하였으며 표준용액과의 비교에 의한 peak의 동정, 저류시간, peak의 면적 및 면적 비율 등을 구하였다. Gas chromatography 조건은 다음과 같다 (canier gas, hydrogen; column head pressure, 10 psi; split ratio, 100:1; split vent, 50 ml/min; septum purge, 5 ml/min; FID hydrogen, 30 ml/niin; FID nitrogen, 30 ml/min; FID air, 400 ml/min; initial temperature,170*0; program rate, 510/min; final temp, 270*0; FID tempurature, 30012; injection port, 250*0; injection volume, 2 μl).
결과 분석 은 Microbial Identification System Aerobe Library (version 3.5, Microbial ID, Inc, Newark,DE, U.S.A.)를 이용하였으며, 모든 실험균주를 대상으로 FAMES 양상의 정 량적 분석 에 의한 수상 도를 구하였다. Clustering 방법은 UPGMA를 이용하였으며 FAMES 양상간의 유사성은 Euclidean distance를 사용하여 계 산하였다.
실험 결과 48시간 배양 후의 FAMEs 조성에서 24시간 배양 결과보다 높은 재현성을 보여주었다. 따라서 본 실험에서는 모든 균주를 48시간 배양하고 FAMEs 조성 을 비 교하였다.
대상 데이터
anthracis 균주 중 사람 유래주인 Kyungjoo 1 및 2는 1994년 경북 경주시에서 발생한 환자의 혈액으로부터 분리한 균주를 본 교실에서 동정한 것이며, 동물 유래주인 Bongchon주는 국립수의과학검 역원으로부터 분양받았다. B. anthracis 유사균주로는 1994년 경 북 경주시 에서 발생한 환자의 혈 액으로부터 분리 되어 B. anthracis와 유사한 생물학적 성상을 보였으나 동정 되지 않았던 Kyungjoo 3주, 서 울대 학교 보건대학원으로부터 분양받은 Rho, S10A, 11-R1 주와 본 교실에서 충남 예산의 토양으로부터 분리 한CAU9910, CAU9911, CAU9912 및 CAU9913주를사용하였다. 이외에 Bacillus subgroup I에 속하는 B.
anthracis 유사균주는 총 21 주로서 Table 1 과 같다. B. anthracis 표준균주로는 미국 ATCC와 국립 수의과학 검 역원에서 분양받아 본 교실에서 보존중인 5주를 사용하였다. 국내 분리 B.
33 m methyl phenyl silicone fused silica capillary column (HP 19091B- 102)을 사용하였다. GC 분석 조건은 carrier로서 H2 gas를 사용하고 검출기는 FID detector, 초기 온도 17013, 최종 270*0, 검출기 30012 그리고 Injecter 25010 등으로 하였다. FAMEs profilee MIS Software (Microbial ID, Inc.
anthracis 표준균주로는 미국 ATCC와 국립 수의과학 검 역원에서 분양받아 본 교실에서 보존중인 5주를 사용하였다. 국내 분리 B. anthracis 균주 중 사람 유래주인 Kyungjoo 1 및 2는 1994년 경북 경주시에서 발생한 환자의 혈액으로부터 분리한 균주를 본 교실에서 동정한 것이며, 동물 유래주인 Bongchon주는 국립수의과학검 역원으로부터 분양받았다. B.
anthracis와 유사한 생물학적 성상을 보였으나 동정 되지 않았던 Kyungjoo 3주, 서 울대 학교 보건대학원으로부터 분양받은 Rho, S10A, 11-R1 주와 본 교실에서 충남 예산의 토양으로부터 분리 한CAU9910, CAU9911, CAU9912 및 CAU9913주를사용하였다. 이외에 Bacillus subgroup I에 속하는 B. subtilis, B. mycoides, B. coagulans, B. cereus 및 B. tharingieasis는 생명공학연구소 유전자은행 (KCTC)으로부터 분양받았다.
이론/모형
)를 이용하였으며, 모든 실험균주를 대상으로 FAMES 양상의 정 량적 분석 에 의한 수상 도를 구하였다. Clustering 방법은 UPGMA를 이용하였으며 FAMES 양상간의 유사성은 Euclidean distance를 사용하여 계 산하였다. Euclidean distance (d)는 d2 = Σ (aj-bj)2에 의해 구하였다 (aj,bj)는첫번째 charactei의 값).
FAMEs의 분석은 Hewlett Packard series II Gas chromatograph model 5890 GC (Microbial ID, Inc., Newark, DE, U.S A) 를 이용하였으며, separation columne 25 m X 0.22 mm X 0.33 m methyl phenyl silicone fused silica capillary column (HP 19091B- 102)을 사용하였다. GC 분석 조건은 carrier로서 H2 gas를 사용하고 검출기는 FID detector, 초기 온도 17013, 최종 270*0, 검출기 30012 그리고 Injecter 25010 등으로 하였다.
Microbial Identification System (MIS, HP 5890 GC, Microbial ID, Newark, DE, U.S.A.)를 이 용한이 용한 FAMEs 분석 은 Miller27)의 방법에 따랐다. Nutrient agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, U.
성능/효과
1. 각 균주에 따른 FAMEs 조성을 분석한 결과 총 21 종류의 지방산이 검출되 었으며 branched fatty acid인 C15:0 Iso가 주요 성분으로 나타났다. B.
2. 각 그룹간에서 특징 적 으로 나타난 지 방산은 B. 에서는 C17:l Anteiso A, B. anthracis 유사균주에서는 Iso C17:l wlOc로 나타났다.
3. FAMEs 조성 을 UPGMA clustering 방법에 의하여 분석한 결과 Euclidean distance 24.5에서 B. anthracis와 B. anthracise; 제외한 Bacillus subgroup I 대세포군의 2개의 cluster를 형성 하였다. 국내 분리 B.
각 균주에 따른 FAMEs 조성을 분석한 결과 총 21 종류의 지방산이 검출되 었으며 branched fatty acid인 C15:0 Iso가 주요 성분으로 나타났다. B. anthracis에서는 총 13종의 지방산이 검출되었으며 B. anthracis 유사균주에서는 총 19종류의 지방산이 검출되었다.
FAMEs 조성과 평균 백분율은 Table 2에서와 같았다. B. anthracis에서는 총 13종의 지방산이 검출되었으며 모든 시험균주에서 saturated fatty acid인 C14:0, C16:0, unsaturated fatty acid인 Isol7:l w5c, branched fatty acid인 C13:0 Iso, C14:0 Iso, C15:0 Iso, C15:0 Anteiso, C16:0 Iso, C17:0 Iso, C17:0 Anteiso, C17:l Anteiso A, summed feature 3 및 4가 검 출되었다. 반면 C13:0 An- teisoe Bongchon주에서 , C18:0은 Kyungjoo 2주에서 만 검 출되었다.
FAMEs 조성 을 UPGMA로 분석하여 수상도를 작성한 결과 모든 시험균주들은 B. anthracis cluster 와 B. anthracis를 제 외 한 Bacillus subgroup I 대 세포 cluster로 분류되 었으며 대조균으로 사용한 Bz- cillus subgroup I 소세 포 그룹에 속하는 B. subtilis KCTC 1691는 독립적인 그룹을 형성하여 실험의 신뢰성이 있음을 알 수 있었다. B.
각 균주에 따른 FAMEs 조성 을 분석한 결과 모든 시 험균주에서 총 21종류의 지 방산 성분이 검출되 었으며 branched fatty acid인 C15:0 Iso가 주요성분으로 나타났다. FAMEs 조성과 평균 백분율은 Table 2에서와 같았다.
시험균주 전체에서 검출된 각 성 분은 saturated fatty acid로서 C14:0, C16:0, unsaturated fatty acid로서 Isol7:l w5c, Isol7:l wlOc, branched fatty acid로서 C13:0 Iso, C14:0 Iso, C15:0 Iso, C15:0 Anteiso, C16:0 Iso, C17:0 Iso, summed feature 3 및 4이 었다. 각 그룹간에서 특징적으로 나타난 지 방산은 B. anthracis에서는 C17:l Anteiso A, B. anthracis 유사균주에서는 Iso C17:l wlOc로 나타났다 (Fig. 1).
Rho, S10A, 11R-1, CAU9910, CAU9911,CAU9912 및 CAU9913이 여기에 속하였다. 대조군으로 사용한 Bacillus subgroup I의 소세포군에 속하는 B. subtilis KCTC 1691는 독립 cluster를 형성하여 실험의 신뢰성을 보여주었다.
)에서 37*0 로 각각 24시간과 48시간 배 양한 후 FAMEs 조성 을 비교하였다. 실험 결과 48시간 배양 후의 FAMEs 조성에서 24시간 배양 결과보다 높은 재현성을 보여주었다. 따라서 본 실험에서는 모든 균주를 48시간 배양하고 FAMEs 조성 을 비 교하였다.
anthracis에서 보다 cerus에서 2배 이상 높게 나타나 두 균주의 구별이 가능함을 보고한 바 있다. 이 연구에서는 모든 시험균주에서 나타난 주요 지방산은 C15:0 Iso로서 34.3% 이상의 높은 비율을 보였다. 그러나 Lawrence 등의 보고와는 다르게 특이 지 방산으로 B.
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