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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 Avidin-Biotin complex를 이용한 연어 GTH Ⅱ의 Sandwich EIA계의 확립과 측정계의 간소화, 감도 및 안정도의 향상을 도모하여 시설이 불충분한 연구기관에서도 실용화하는 것을 목적으로 하였다.
- 본 연구에서는 뇌하수체내 및 뇌하수체 세포배양액에 존재하는 GTH Ⅱ 농도를 측정할 수 있는 EIA계 개발에 주력하였다. 추후에 혈중 GTH Ⅱ 농도를 측정할 수 있는 EIA계 개발이 요구된다.
제안 방법
- 5 ml씩 나누었다. Biotin 표지 rabbit IgG의 제조는 Dimethyl sul- foxide(DMSO)에 녹인 Biotin (long arm)-N-hydroxysuccini mide ester (BNHS; Vector Lab. USA)로 표지 시켰다. Biotin으로 표지된 GTH Ⅱ의 rabbit IgG를 각각 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, glycin으로 반응 정지시켜 4℃에서 24시간 동안 PBS (pH 7.
- USA)로 표지 시켰다. Biotin으로 표지된 GTH Ⅱ의 rabbit IgG를 각각 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, glycin으로 반응 정지시켜 4℃에서 24시간 동안 PBS (pH 7.2)완충액으로 투석하여 Biotin 표지 GTH Ⅱ rabbit IgG를 얻었다. 또한 Non-Biotin rabbit IgG로 이용된 GTH Ⅱ 항체는 단지 Protein A sepharose affinity chromatography co-lumn을 통해서 얻어진 rabbit IgG를 사용하였다.
- T의 경구투여는 시판중인 송어용 펠렛 1kg에 대하여 25mg의 T을 녹인 ethanol용액 100ml을 뿌려서, 18시간 실온에서 건조시켜 제조한 펠렛을 투여하였다. 펠렛은 매일 체중의 1.
- 그 후 rabbit IgG 농도를 2~10mg/ml로 조정하기 위해서 Ultrafiltration (Amicon, USA) 방법 으로 농축하였다. 농축된 IgG(2.9 mg/ml) 5ml를 Biotin 표지 및 Non-Biotin rabbit IgG로 제조하기 위하여 2.5 ml씩 나누었다. Biotin 표지 rabbit IgG의 제조는 Dimethyl sul- foxide(DMSO)에 녹인 Biotin (long arm)-N-hydroxysuccini mide ester (BNHS; Vector Lab.
- 또한 본 연구에서는 표지후 미반응의 BNHS와 salmon GTH Ⅱ rabbit IgG를 투석방법에 의해서 이루어졌다. 이 방법에서는 투석 후 Biotin 표지 salmon GTH Ⅱ rabbit IgG 용액중에 유리 (free) 상태의 BNHS가 공존할 가능성이 있으며, 이러한 유리상태의 BNHS 공존은 blank (background) leveV을 높여 감도를 저하시키는 것이 보고되어져 있다 (Chang et al.
- (1992)의 방법으로 뇌하수체 추출물을 제조하였다. 또한 적출한 뇌하수체를 세포 분리 및 세포배양을 하기 위하여 방냉상태의 Hank's balanced salt solution [HBSS (Gibco Lab., New York, USA); 25 mM HEPES, 4 mM NaHCO3 and 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco Lab.) pH 7.5]에 침적시켰다. 그 후 HBSS 완충액으로 씻은 뒤, 멸균시킨 면도날로 잘게 단편으로 만들었다.
- 무지개 송어의 뇌하수체 및 배양액에 존재하는 GTH Ⅱ 농도를 측정하기 위해 Avidin-Biotin complex를 이용한 sandwich EIA 계을 개발했다.
- 한편 항체에 Biotinylation시키는 표지법이 개발되어 EIA계에 이용되어져 왔으며, 이러한 Biotin 표지법은 특이성과 감도가 높아서 hormone과 같은 미량으로 분비되는 측정계에 이용 되고 있다 (Tijssan, 1985). 본 연구에 있어서 salmon GTH Ⅱ rab bit IgG 농도와 Biotin-N-hydroxysuccinimide ester(BNHS)농도 를 1 : 25로 조정하여 표지하였다. 항체와 BNHS의 결합비는 EIA계의 감도에 큰 영향을 미치는 것이 알려져 있다 (Tijssan, 1985).
- Louis, USA) 배양액에 현탁했다. 세포수는 hemocytometer로 계산하였고, 세포생존율은 0.1% trypan blue로 계산하였으며 이때 세포 생존율은 90% 이상 이었다.
- 1% BSA가 포함된 배양액을 500ul씩 분주하여 씻은 뒤, FBS가 없는 새로운 RPMI-1640 배양액으로 교환하였다. 이때 well에 각 농도(10-11~10-6)의 salmon type gonadotropin-releasing hormone (sGnRH; Peninsula Lab., Belmont, CA, USA)를 제각기 투여하여 18℃에서 24시간 동안 방출된 GTH Ⅱ 농도를 측정하였다. 실험종료후, 세포생존율은 90% 이상이었다.
- T의 경구투여는 시판중인 송어용 펠렛 1kg에 대하여 25mg의 T을 녹인 ethanol용액 100ml을 뿌려서, 18시간 실온에서 건조시켜 제조한 펠렛을 투여하였다. 펠렛은 매일 체중의 1.5%의 사료공급률이 되도록 1일에 2회로 나누어서 30일간 투여하였다.
- 그 후, 2 M HzSQ를 25ul씩 넣어 반응 정지 시켜 autometic microplate reader (Bio-Red, CA, USA)로 450nm에서 홉광도를 측정했다. 흡광도는 microplate reader standard curve program (Bio-Rad)에서 계산하여 농도로 환산하였다.
대상 데이터
- Biotin 표지에 이용된 연어 GTH Ⅱ 항체와 standard hor-mone는 日本 東京大學 水族生理學研究室에서 제작한 것을 이용 했다. Protein A sepharose (Phamacia, Sweden) affinity chro matography column을 280 nm의 UV-monitor (ATTO, Japan) 에 연결하여 rabbit IgG의 peak을 얻었다.
- GTHⅡ EIA계의 특이성을 조사하기 위하여 연어 (OncorAyn- chus keta) GTHⅠ, growth hormone(GH), prolactin을 日本 北里大學의 Kawauchi 교수로 부터 제공받았다.
- Protein A sepharose affinity chromatography을 통해서 얻어진 연어 GTH Ⅱ의 rabbit IgG에 biotinylation시킨 것 (Biotin-salmon GTH Ⅱ rabbit IgG)을 제2 항체로 사용하였고, Non-Biotin salmon GTH Ⅱ rabbit IgG는 단지 protein A sepharose affinity chromatography에서 얻어진 IgG를 제 1 항체로 사용하였다. EIA는 sandwich법에 의해서 이루어졌으며, 효소반응 기질로는 TMB(3,3 '5,5-tetramethylbenzidine)를 이용했으며, 반응후 450nm의 흡광도에서 automatic microplate reader로 측정하였다.
- 1에 나타냈다. 그 결과 2개의 peak가 얻어졌으며, 그 중 peak B를 모아서 Biotin 및 non-Biotin rabbit IgG로 이용하였다.
- 2)완충액으로 투석하여 Biotin 표지 GTH Ⅱ rabbit IgG를 얻었다. 또한 Non-Biotin rabbit IgG로 이용된 GTH Ⅱ 항체는 단지 Protein A sepharose affinity chromatography co-lumn을 통해서 얻어진 rabbit IgG를 사용하였다.
- 미성숙한 암 · 수 무지개 송어 (체중: 약 100g)를 14℃에 순치하여 실험어로 사용했다.
데이터처리
- 각 농도의 sGnRH처리에 의한 GTH Ⅱ 농도 변화의 통계처리는 분산분석후, Duncan's new multiple range test를 사용하여 분석 하였다. 또한 RIA와 sandwich EIA에 의해서 측정된 각 GTH Ⅱ 농도는 Student's t test를 사용하여 분석 하였다.
- 각 농도의 sGnRH처리에 의한 GTH Ⅱ 농도 변화의 통계처리는 분산분석후, Duncan's new multiple range test를 사용하여 분석 하였다. 또한 RIA와 sandwich EIA에 의해서 측정된 각 GTH Ⅱ 농도는 Student's t test를 사용하여 분석 하였다.
이론/모형
- 125Ⅰ 표지 GTH Ⅱ의 제작 및 assay 방법은 Kim (1997)의 방법에 따랐다. GTH Ⅱ의 RIA계에 있어서 GTHⅠ의 교차율은 2.
- Protein A sepharose affinity chromatography을 통해서 얻어진 연어 GTH Ⅱ의 rabbit IgG에 biotinylation시킨 것 (Biotin-salmon GTH Ⅱ rabbit IgG)을 제2 항체로 사용하였고, Non-Biotin salmon GTH Ⅱ rabbit IgG는 단지 protein A sepharose affinity chromatography에서 얻어진 IgG를 제 1 항체로 사용하였다. EIA는 sandwich법에 의해서 이루어졌으며, 효소반응 기질로는 TMB(3,3 '5,5-tetramethylbenzidine)를 이용했으며, 반응후 450nm의 흡광도에서 automatic microplate reader로 측정하였다. 그 결과, 0.
- Protein A sepharose (Phamacia, Sweden) affinity chro matography column을 280 nm의 UV-monitor (ATTO, Japan) 에 연결하여 rabbit IgG의 peak을 얻었다. 그 후 rabbit IgG 농도를 2~10mg/ml로 조정하기 위해서 Ultrafiltration (Amicon, USA) 방법 으로 농축하였다. 농축된 IgG(2.
- 그 후 HBSS 완충액으로 씻은 뒤, 멸균시킨 면도날로 잘게 단편으로 만들었다. 뇌하수체 단편들은 Kim et al. (1999)등의 방법에 따라 collagenase-DNase로 처리하여 뇌하수체 세포를 분리시켰다. 분리된 세포는 25 mM HEPES, 4 mM NaHCO3 10% fetal bovin serum(FBS; Gibco Lab.
- 실험어는 2-phenoxyethanol(200 ppm)을 이용해서 마취시킨 후, 뇌하수체를 빠르게 적출해서 Amano et al. (1992)의 방법으로 뇌하수체 추출물을 제조하였다. 또한 적출한 뇌하수체를 세포 분리 및 세포배양을 하기 위하여 방냉상태의 Hank's balanced salt solution [HBSS (Gibco Lab.
성능/효과
- Avidin-Biotin complex를 이용한 연어 GTH Ⅱ의 sandwich법 EIA계 에서 standard hormone농도가 0.12~125 ng/ml 농도범위 에 서 용량반응곡선이 얻어져, 본 sandwich법 EIA계에서 무지개 송 어의 뇌하수체 세포배양액 및 뇌하수체내 GTH Ⅱ의 농도측정이 가능하게 되었다.
- GTH Ⅱ 표준곡선과 뇌하수체 세포배양액 및 뇌하수체 추출물중 GTH Ⅱ 측정 가능성을 검토하기 위하여 세포배양액와 뇌하수체 추출액을 흡광도 50% 부근에서 GTH Ⅱ의 표준곡선과 각 시료들 의 회석곡선을 평행성 검정(2×2 점법, #)을 통하여 검토한 결과, 뇌하수체 세포배양액과 뇌하수체 추출액의 희석곡선은 제각기 GTH Ⅱ 표준곡선과 일치하였다. 이러한 결과로부터 본 연어 GTH Ⅱ sandwich법 EIA계는 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양 액과 뇌하수체 추출액중, GTH Ⅱ 농도의 측정이 가능하였다.
- Non-Biotin rabbit IgG는 800배, Biotin rabbit IgG는 400배로 희석하여 사용했을 때 항원-항체 반응의 특이성이 가장 높았다 (data n이 shown). Sandwich법 EIA계의 연어 GTH Ⅱ 표준곡선과 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양액 및 뇌하수체 추출물중 GTH Ⅱ 측정 가능성을 조사하여 Fig.
- Non-Biotin rabbit IgG는 800배, Biotin rabbit IgG는 400배로 희석하여 사용했을 때 항원-항체 반응의 특이성이 가장 높았다 (data n이 shown). Sandwich법 EIA계의 연어 GTH Ⅱ 표준곡선과 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양액 및 뇌하수체 추출물중 GTH Ⅱ 측정 가능성을 조사하여 Fig. 2에 나타냈다, GTH Ⅱ standard hormone은 0.12 ng/mlml에서 125 ng/mlml까지 농도반응 관계를 나타 내는 표준곡선을 얻었으며, 흡광도 50%의 농도인 약 15.6 ng/mlml 부근에서 intraassay (assay 内)와 interassay (assay 間)의 변동계 수를 조사한 결과 변동계수율은 각각 8.2%, 12.5%였다.
- 또한 이러한 GTH Ⅱ의 표준곡선는 뇌하수체내 다른 peptide hormone 와는 교차반응을 거의 나타내지 않았다. Testosterone을 처리한 미성숙 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양계를 이용하여 sGnRH에 의한 GTH Ⅱ 분비량을 본 sandwich EIA계와 RIA계를 비교 조사한 결과, 거의 같은 분비량을 나타냈을 뿐만아니라 같은 분비 pattern을 나타냈다. 이러한 결과로부터 본 sandwich법 EIA계에 의해서 연어과 어류의 뇌하수체 추출물 및 뇌하수체 배양액 중의 GTH Ⅱ 함량 및 분비량을 측정하는데 있어서 안정된 assay계라고 생각되어진다.
- Testosterone처리군의 미성숙 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양 계에 있어서 sGnRH 투여에 의한 GTH Ⅱ 분비량의 변화를 sand wich EIA와 RIA로 비교 검토한 결과, 양 측정계는 저농도 sG- nRH(10-11~10-9 M) 투여에 의해서 GTH Ⅱ 분비량은 농도구배적으로 증가 하였으나, 고농도 sGnRH (10-8~10-6 M) 투여에 의해서는 GTH Ⅱ 분비량이 더 이상 증가하지 않는 유사한 분비 양상을 나타내었다. 이러한 이유는 고농도의 peptide성질의 hor-tnone에 의해 receptor의 down regulation 현상이 일어나 receptor가 가수분해에 의해 분해되어 버리기 때문에 일정 농도 이상의 고농도에서는 더 이상 반응하지 않는다고 하였으며 (Hazum and Conn, 1988; Huckie and Conn, 1988), 이러한 현상들은 무지개 송어와 금붕어의 뇌하수체 세포배양계에서도 관찰되어진다고 보고하였다 (Peter et.
- 3에 나타냈다. 그 결과 EIA와 RIA의 양 측정계는 저농도 sGnRH (10-11~10-9 M) 투여에 의해서 GTH Ⅱ 분비량은 농도구배적으로 증가하였으나, 고농도 sGnRH (10-8~10-6M) 투여에 의해서는 GTH Ⅱ 분비량이 더 이상 증가하지 않는 유사한 분비 양상을 나타내었다. 또한 각 농도의 sGnRH의 자극에 의해 분비된 GTH Ⅱ 농도를 sand wich EIA와 RIA로 비교 검토한 결과 유의한 차이를 나타내지 않았으나, sandwich EIA에 의해서 측정된 GTH Ⅱ 농도가 RIA에 의해서 측정된 GTH Ⅱ 농도보다 4~7%정도 높았다.
- Sandwich법 GTH Ⅱ EIA계의 특이성을 조사하기 위하여 뇌하 수체내 다른 hormone과의 교차반응을 Table 1에 나타냈다. 그 결과 GTH Ⅱ의 EIA계에 있어서 GTHⅠ는 2.9%의 교차반응률을 나타내었지만, GH와 Prolactin에 대해서는 0.5% 이하의 교차반응률을 나타내었다.
- EIA는 sandwich법에 의해서 이루어졌으며, 효소반응 기질로는 TMB(3,3 '5,5-tetramethylbenzidine)를 이용했으며, 반응후 450nm의 흡광도에서 automatic microplate reader로 측정하였다. 그 결과, 0.12~125 ng/ml의 범위에서 용량반응곡선을 얻었으며, 측정감도 (최소 검출량)는 거의 0.58 ng/ml 정도 였다. 그리고 뇌하수체 추출물 및 배양액 각각의 희석곡선은 GTH Ⅱ 표존곡선과 일치 하였다.
- 9%에 비교해서 약간 높았다. 그러나 일반적으로는 intraassay의 변동계수률은 10%이내, interassay의 변동계수률은 20%이내를 요구하기 때문에 본 연구의 양 변동계수률의 결과를 토대로 본 EIA계는 안정적인 측정계라 판단된다.
- 그 결과 EIA와 RIA의 양 측정계는 저농도 sGnRH (10-11~10-9 M) 투여에 의해서 GTH Ⅱ 분비량은 농도구배적으로 증가하였으나, 고농도 sGnRH (10-8~10-6M) 투여에 의해서는 GTH Ⅱ 분비량이 더 이상 증가하지 않는 유사한 분비 양상을 나타내었다. 또한 각 농도의 sGnRH의 자극에 의해 분비된 GTH Ⅱ 농도를 sand wich EIA와 RIA로 비교 검토한 결과 유의한 차이를 나타내지 않았으나, sandwich EIA에 의해서 측정된 GTH Ⅱ 농도가 RIA에 의해서 측정된 GTH Ⅱ 농도보다 4~7%정도 높았다.
- 본 sandwich법 GTH Ⅱ EIA계의 특이성을 검토한 결과 GTHⅠ와의 교차반응률은 2.9%을 나타냈지만, GH와 prolactin과의 교차반응률은 0.5% 이하로 나타났다. 이러한 결과는 동일한 GTH Ⅱ항체를 이용한 RIA 결과에서는 GTHⅠ와의 교차반응률이 2.
- , Belmont, CA, USA)를 제각기 투여하여 18℃에서 24시간 동안 방출된 GTH Ⅱ 농도를 측정하였다. 실험종료후, 세포생존율은 90% 이상이었다.
- Testosterone을 처리한 미성숙 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양계를 이용하여 sGnRH에 의한 GTH Ⅱ 분비량을 본 sandwich EIA계와 RIA계를 비교 조사한 결과, 거의 같은 분비량을 나타냈을 뿐만아니라 같은 분비 pattern을 나타냈다. 이러한 결과로부터 본 sandwich법 EIA계에 의해서 연어과 어류의 뇌하수체 추출물 및 뇌하수체 배양액 중의 GTH Ⅱ 함량 및 분비량을 측정하는데 있어서 안정된 assay계라고 생각되어진다.
- )을 통하여 검토한 결과, 뇌하수체 세포배양액과 뇌하수체 추출액의 희석곡선은 제각기 GTH Ⅱ 표준곡선과 일치하였다. 이러한 결과로부터 본 연어 GTH Ⅱ sandwich법 EIA계는 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양 액과 뇌하수체 추출액중, GTH Ⅱ 농도의 측정이 가능하였다.
- 차후에 유리상태의 BNHS 제거방법에 여러 가지 검토가 필요하다고 추측되어진다. 측정치의 오차정도를 알아보기 위하여 변동계수률을 조사한 결과 intraas say (assay 内)의 변동계수률은 8.2%, interassay (assay 間)의 변동계수률은 12.5%로 나타났다. 현재까지 GTH Ⅱ EIA계에 있어서 변동계수률을 조사한 보고가 없어 직접적으로 비교 고찰할 수는 없지만, Kobayashi et al.
- 5%로 나타났다. 현재까지 GTH Ⅱ EIA계에 있어서 변동계수률을 조사한 보고가 없어 직접적으로 비교 고찰할 수는 없지만, Kobayashi et al. (1987)가 동일 GTH Ⅱ 항체를 가지고 실시한 RIA 결과에서 intraassay의 변동계수률 6%, interassay의 변동계수률 7.9%에 비교해서 약간 높았다. 그러나 일반적으로는 intraassay의 변동계수률은 10%이내, interassay의 변동계수률은 20%이내를 요구하기 때문에 본 연구의 양 변동계수률의 결과를 토대로 본 EIA계는 안정적인 측정계라 판단된다.
후속연구
- 그러나 GH와 prolactin에 관한 RIA 결과가 없어 본 EIA계와의 직접적인 비교는 할 수 없지만, 본 EIA계에서 GH와 prolactin에 대해서 거의 교차반응을 나타내지 않았다. 따라서 본 sandwich법 GTH Ⅱ EIA계는 무지개 송어의 뇌하수체 세포배양액 및 뇌하수체내의 GTH Ⅱ만을 인식하는 것으로 판단되며, 추후에 다른 hormone과의 교차반응도 검토가 요구된다. 한편 본 연어 GTH Ⅱ EIA계에서 GTH Ⅱ 표준곡선과 testosterone을 경구투여한 미성숙 무지개 송어 뇌하수체 추출물의 희석곡선이 일치하였다.
- 항체와 BNHS의 결합비는 EIA계의 감도에 큰 영향을 미치는 것이 알려져 있다 (Tijssan, 1985). 본 연구에서 얻어진 결합비가 적절한지에 관해서는 차후에 검토가 필요하다고 추측되어진다.
- 본 연구에서는 뇌하수체내 및 뇌하수체 세포배양액에 존재하는 GTH Ⅱ 농도를 측정할 수 있는 EIA계 개발에 주력하였다. 추후에 혈중 GTH Ⅱ 농도를 측정할 수 있는 EIA계 개발이 요구된다.
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