[논문]18s 리보좀 DNA 서열 분석에 의한 한국산 가시고기속 (genus Pungitius, Gasterosteidae: Pisces) 어류의 계통학적 연구

서보근; 채병수

18s 리보좀 DNA 서열 분석에 의한 한국산 가시고기속 (genus Pungitius, Gasterosteidae: Pisces) 어류의 계통학적 연구
Phylogenetic Study of the Genus Pungitius (Gasterosteidae: Pisces) from Korea by the Sequence Analysis of 18s Ribosomal DNA 원문보기

한국산 가시고기 (Pungitius sinensis)와 잔가시고기 (P. kaibarae) 사이의 관계를 밝히기 위하여 18s 리보좀 DNA 두 단편의 염기서열을 분석하였다. G+C pair의 비율은 잔가시고기의 개체군에서 54.85~55.15%, 가시고기에서 52.76%로 나타났다. 잔가시고기 개체군들 사이의 염기치환수는 10~18개, 가시고기와 잔가시고기 사이의 염기치환수는 165개였다. 거리지수의 값은 잔가시고기의 개체군들 사이는 0.0118~0.0195, 가시고기와 잔가시고기 개체군 사이는 0.2136~0.2306으로 나타났다. 이를 개체군간 염기서열의 분석 결과는 잔가시고기와 가시고기가 종수준으로 분화한 것을 보여주었다.

The sequences of two fragments of 18s ribosomal DNA were determined to elucidate relationship between Pungitius sinensis and P. kaibarae. The proportion of G+C pair is 54.85% to 55.15% in P. kaibarae populations and 52.76% in P. sinensis. Number of substitutions ranges from 10~18 among the populations of P. kaibarae and up to 165 between P. sinensis and P. kaibarae. The value of sequence divergence were 0.0118~0.0195 among the populations of P. kaibarae and 0.2136~0.2306 between P. sinensis and P. kaibarae. The result of pairwise comparison of the sequences indicate that phylogenetic relationship between P. sinensis and P. kaibarae was differentiated to specific level.

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문제 정의

따라서 저자들은 가시고기 (P. s弟ens伝)와 잔가시고기 (P. A函况irae)를 별종으로 분류하는데는 동의하나, 잔가시고기 내의 개체군들에 대한 결과는 Yang and Min (1990)의 경우와 현저히 다르므로, 일단 재고의 여지가 있다고 보고 판단을 유보하고자 한다.
본 연구에서는 최근에 계퉁학적 연구에 많이 이용되고 있는 18s 리보좀 DNA 염기서열분석을 시도하여 한반도 이남에 서식하고 있는 가시고기속 어류인 가시고기와 잔가시고기 사이의 유연관계 및 계통학적 문제를 밝혀보고자 하였다.

제안 방법

PCR산물은 GenElute Agarose Spin Column (Supelco, Bellefonte, PA)으로 정제한 후 기초과학지원센타에 sequencing을 의뢰하였다.
합성하여 증폭에 사용하였다. PCR의 증폭은 먼저 optimization kit (stratagene)으로 최적의 PCR buffer와 adjunct를 찾은 다음 멸균 처리한 PCRtube롤 얼음 위에 두고 각 tube당 PCR lOXbuffer 2.5 以, 0.05 mM dNTP, forward, reverse primer 각 0.1 pg씩, template DNA 38 ng, 1 unit의 Taq DNA polymerase, 15 mM (NHQ2SO4를 가하고 멸균 증류수률 첨가하여 총 25(x1 가 되 게 한다. 증폭 조건은 전체 35 cycle 중 1st cycle-g-94℃ 3분, 57℃ 2분, 72℃ 2분으로 하고, 이후 cyclee 94℃ 1분, 57℃ 2분, 72℃ 2분, 35th cyclee 94℃ 1분, 57℃ 2분, 72℃ 8분으로 처리한 후 4℃를 계속 유지토록 하였다.
채집하였다. 각 채집지의 어류는 산채로 실험실로 운반한 후 냉동하여 간조직을 적출하였다. DNA는 Palumbi(1996)의 방법에 의하여 분리되었는데, 간조직 50 ~ 90 mg을 잘게 자른 후 400 以의 STE (100 mM EDTA, 10 mM Tris, lOOmMNaCl, pH 7.
침전된 DNA는 70% ethanol로 세척, 건조 후 증류수에 현탁하여 실험에 사용하였다. 미국산 bird spider (Eurypelma californica)^ 18s rDNA에 서부터 design된 primer (forward primer 5'-AAACGGCTACCACATCCAAG-3', reverse primer 5'-GTACAAAGGGCAGGGACGTA-3)를 제노택(주)에 의뢰 . 합성하여 증폭에 사용하였다.
1 pg씩, template DNA 38 ng, 1 unit의 Taq DNA polymerase, 15 mM (NHQ2SO4를 가하고 멸균 증류수률 첨가하여 총 25(x1 가 되 게 한다. 증폭 조건은 전체 35 cycle 중 1st cycle-g-94℃ 3분, 57℃ 2분, 72℃ 2분으로 하고, 이후 cyclee 94℃ 1분, 57℃ 2분, 72℃ 2분, 35th cyclee 94℃ 1분, 57℃ 2분, 72℃ 8분으로 처리한 후 4℃를 계속 유지토록 하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 가시고기와 잔가시고기의 재료는 Table 1에 제시된 바와 같으며, 망목 3×3mm의 족대를 이용하여 채집하였다. 각 채집지의 어류는 산채로 실험실로 운반한 후 냉동하여 간조직을 적출하였다.

이론/모형

각 채집지의 어류는 산채로 실험실로 운반한 후 냉동하여 간조직을 적출하였다. DNA는 Palumbi(1996)의 방법에 의하여 분리되었는데, 간조직 50 ~ 90 mg을 잘게 자른 후 400 以의 STE (100 mM EDTA, 10 mM Tris, lOOmMNaCl, pH 7.5)에 넣고 마쇄하였다. homogenate는 1,000 rpm (Hettich Mikro 24 ~ 48R, Angle rotor; radius 92 mm)에서 5분간 원심 분리 후 상둥액을 취하였고, 다시 14, 000 rpm에서 3분간 원심분리하여 pellet을 취하였다.
5c (Felsenstein, 1993) program의 DNADIST로 distance matria를 얻었다. Dendrograme UPGMA 분석법에 의해 만들어졌다.

성능/효과

76%로서 약간 낮았다. 개체군간의 염기 변이를 보면 잔가시고기 내의 개체군간에는 10~18개의 치환이 있는데 비하여 잔가시고기와 가시고기의 개체군간에는 165~177개의 치환이 일어나 매우 큰 차이를 나타내었다. 또한 distance matix 에 나타난 거 리지수값 역시 동일한 결과를 보여주며, 잔가시고기의 개체군들 사이는 0.
개체군간의 염기 변이를 보면 잔가시고기 내의 개체군간에는 10~18개의 치환이 있는데 비하여 잔가시고기와 가시고기의 개체군간에는 165~177개의 치환이 일어나 매우 큰 차이를 나타내었다. 또한 distance matix 에 나타난 거 리지수값 역시 동일한 결과를 보여주며, 잔가시고기의 개체군들 사이는 0.0118~0.0195, 가시고기와 잔가시고기 개체군 사이는 0.2136~0.2306으로 나타났다(Table 2).
본 연구에서 실시한 염기서열의 분석 결과는 sequence divergence의 정도가 distance ①)로 계산되어 있는데 (Table 2), 잔가시고기 개체군들 사이는 0.0118-0.0195, 가시고기와 잔가시고기 개체군 사이는 0.2136-0.2306으로 나타났다. 이 결과를 연어속(Oncor/sicTizis) 의 계통연구룔 위하여 mtDNA의 D 늬oop sequence를 분석 한 Kitano et al.
염기의 조성에 있어서는 4집단 모두 G+Cpair의 비율이 A+Tpair의 비율보다 약간 더 높았는데 잔가시고기의 개체군들은 54.85 ~ 55.15%이었으며 가시고기 개체군은 52.76%로서 약간 낮았다. 개체군간의 염기 변이를 보면 잔가시고기 내의 개체군간에는 10~18개의 치환이 있는데 비하여 잔가시고기와 가시고기의 개체군간에는 165~177개의 치환이 일어나 매우 큰 차이를 나타내었다.
2와 같다. 염기의 치환율과 거리지수에서 본 것과같이 잔가시고기의 간성 북천, 사천천, 경주 형산강의 개체군들은 초기에 하나의 집단으로 묶여지는 경향을 나타내었으며, 이들 집단과 옥계 주수천의 가시고기 개체군은 유전적으로 관계가 먼 것으로 나타났다.
3기이 된다. 이들과 본 연구의 결과를 비교하여도 잔가시고기 개체군들 사이는 동일종, 가시고기와 잔가시고기 개체군 사이는 아종 이상의 분화를 보여준다.

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