선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이러한 경우가 실험의 결과에 미치는 영향에 대하여는 아직 상세히 알려진 바가 없다. 따라서 보다 객관적인 실험결과를 얻기 위해서는 실험전 배양조건의 변화가 실험결과에 어떤 영향을 미치는 지에 대한 지식이 필요하다는 점에 착안하여 본 저자들은 해마조직절편을 이용한 실험에서 배양기간 동안의 조건변화가 실험결과에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 계획하였다.
- 해마조직절편을 이용한 실험에서 적절한 모델을 찾고 준비과정 중에 발생하는 변수들에 의해 실험결과가 어떻게 영향을 받을 수 있는지를 알아보기 위하여 본 실험을 시행하였다. 준비된 조직절편을 21℃의 배양조에서 90분간 배양후 34℃의 기록조로 옮겨 150분간 0.
제안 방법
- 체중 100∼150g의 흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 암수 구분없이 실험동물로 사용하였으며 할로텐으로 마취한 뒤 두부를 신속절개하여 두뇌를 적출하였다. 적출된 두뇌를 섭씨 4도의 생리식염수에 옮긴 뒤 해마부위를 적출, 중간 1/3부위를 tissue chopper(Electron Microscopy Sciences, USA) 를 사용하여 450μm 두께로 횡절단하여 4∼5개의 해마조직 절편을 얻었다. 얻어진 조직절편은 인공뇌척수액(NaCl 130, KCl 3.
- 적출된 두뇌를 섭씨 4도의 생리식염수에 옮긴 뒤 해마부위를 적출, 중간 1/3부위를 tissue chopper(Electron Microscopy Sciences, USA) 를 사용하여 450μm 두께로 횡절단하여 4∼5개의 해마조직 절편을 얻었다. 얻어진 조직절편은 인공뇌척수액(NaCl 130, KCl 3.5, NaHPO4 1.25, NaHCO3 2.4, CaCl2 1.2, MgSO4 1.2, glucose 10mM, pH 7.4)이 들어있는 배양조(incubation chamber)에 넣고 실온상태(21℃)에서 95% 산소와 5% 이산화탄소로 구성된 혼합가스를 환기하면서 절편으로 만들 때 발생한 손상에서 회복하도록 하였다.
- 배양조에서 일정시간(대조군；90분) 동안 회복된 해마절편을 기록조(recording chamber)에 옮겨 고정하고 혼합가스(95% O2＋5% CO2)를 환기시킨 34℃의 표준 인공뇌척수액을 2∼3ml/min의 속도로 계속해서 관류시키면서 미세 전기침과 미세 유리전극을 설치하고 전 실험과정 동안 일정 하게 전기자극을 주면서 발생하는 PS(Population spike)를 측정하였다. 저산소손상을 주기전 일정기간(대조군；150분) 동안 측정된 PS를 기저측정(baseline recording)으로 하였다.
- )를 환기시킨 34℃의 표준 인공뇌척수액을 2∼3ml/min의 속도로 계속해서 관류시키면서 미세 전기침과 미세 유리전극을 설치하고 전 실험과정 동안 일정 하게 전기자극을 주면서 발생하는 PS(Population spike)를 측정하였다. 저산소손상을 주기전 일정기간(대조군；150분) 동안 측정된 PS를 기저측정(baseline recording)으로 하였다. 기저측정 기간이 끝나면 10분 동안 N2 95%＋CO2 5%의 혼합가스가 환기된 인공뇌척수액을 관류시켜 저산소 손상을 주고 다시 정상의 인공 뇌척수액으로 전환하였다.
- 기저측정 기간이 끝나면 10분 동안 N2 95%＋CO2 5%의 혼합가스가 환기된 인공뇌척수액을 관류시켜 저산소 손상을 주고 다시 정상의 인공 뇌척수액으로 전환하였다. 저산소 손상 후 120분 동안 PS를 측정하여 손상후의 변화를 기록하였다.
- 기록조에 고정된 조직절편의 CA2와 CA3 사이를 미세한 나이프를 이용하여 분리시키고 Schaffer collateral-commissural bundle을 전기적으로 자극하기 위하여 말단이 50μm 노출된 양극성 미세전기침(bipolar stimulating electrode)을 stratum radiatum에 위치시키고, 저항이 5∼15Mω이 유지되게 150mM의 NaCl 용액을 채운 미세유리 전극을 해마의 CA1부위의 stratum pyramidale에 약 100 μm 깊이로 삽입하였다. 미세전기침을 통하여 전기자극(test input, 100∼200mA, 150μsec, 0.1Hz)을 지속적으로 가하면서 미세유리전극을 통하여 PS를 측정하였다(Fig. 1). PS는 high input impedance amplifier를 이용하여 증폭시킨 다음 oscilloscope을 통해 관찰하였고 그 곡선을 개인컴퓨터에 수치화하여 디스크에 저장하였다.
- 1). PS는 high input impedance amplifier를 이용하여 증폭시킨 다음 oscilloscope을 통해 관찰하였고 그 곡선을 개인컴퓨터에 수치화하여 디스크에 저장하였다. PS의 진폭은 Fig.
- 2에서와 같이 PS상단의 두 극점을 연결한 선의 중간에서 PS의 하단까지의 거리로 측정하였다. 저산소 손상을 주기 직전의 안정화된 기저측정의 진폭을 기준으로 하고 각각의 측정된 PS의 진폭을 기준이 된 안정화된 진폭에 대한 백분율로 표시하여 데이터 값으로 하였다. 단, 실험초기에 PS의 크기가 2mV 이하인 경우는 실험에서 제외하였다.
- 실험 1∼4군은 배양기간 내의 전기자극 시간이 저산소 손상후 나타나는 실험 결과에 미치는 영향을 관찰하기 위해 고안하였다. 즉 1군(n＝8)은 60분간 배양조에서 회복시킨 뒤 180분 동안 기록조에서 전기자극을 주었고 2군(n＝15)은 배양조에서 90분간 머무른 뒤 150분간 기록조에서 전기자극을 주었으며 3군(n＝8)은 배양조에서 180분, 기록조에서 90분간 전기자극을 주었다.
- 실험 1∼4군은 배양기간 내의 전기자극 시간이 저산소 손상후 나타나는 실험 결과에 미치는 영향을 관찰하기 위해 고안하였다. 즉 1군(n＝8)은 60분간 배양조에서 회복시킨 뒤 180분 동안 기록조에서 전기자극을 주었고 2군(n＝15)은 배양조에서 90분간 머무른 뒤 150분간 기록조에서 전기자극을 주었으며 3군(n＝8)은 배양조에서 180분, 기록조에서 90분간 전기자극을 주었다. 4군은 2군과 같이 90분간 배양 조에 머무르고 180분간 기록조에서 전기자극을 주었으나 기록조의 초기 90분간을 21℃로 함으로써(3군의 온도변화와 같음) 온도의 변화가 실험결과에 미치는 영향을 관찰하였다 (Table 1).
- 즉 1군(n＝8)은 60분간 배양조에서 회복시킨 뒤 180분 동안 기록조에서 전기자극을 주었고 2군(n＝15)은 배양조에서 90분간 머무른 뒤 150분간 기록조에서 전기자극을 주었으며 3군(n＝8)은 배양조에서 180분, 기록조에서 90분간 전기자극을 주었다. 4군은 2군과 같이 90분간 배양 조에 머무르고 180분간 기록조에서 전기자극을 주었으나 기록조의 초기 90분간을 21℃로 함으로써(3군의 온도변화와 같음) 온도의 변화가 실험결과에 미치는 영향을 관찰하였다 (Table 1).
- 이온 및 약물 실험군은 2군과 시간배정 및 온도변화를 동일하게(배양조, 21℃, 90분；기록조, 34℃, 150분) 적용하였다. 용액내 이온의 변화는 저칼슘군(n＝6), 저마그네슘군(n ＝7) 및 고마그네슘군(n＝8)으로 하였으며 약물 투여군은 L-glutamate(100μM)(n＝6), AP-5(D,L-2 amino-5- phosphonovaleric acid, 50μM)(n＝7), CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione, 10μM)(n＝6)를 실험하였다.
- 용액내 이온의 변화는 저칼슘군(n＝6), 저마그네슘군(n ＝7) 및 고마그네슘군(n＝8)으로 하였으며 약물 투여군은 L-glutamate(100μM)(n＝6), AP-5(D,L-2 amino-5- phosphonovaleric acid, 50μM)(n＝7), CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione, 10μM)(n＝6)를 실험하였다. 이온의 변화와 약물적용은 기록조로 이동한 뒤 30분 후부터 2∼3ml/min의 속도로 관류되는 정상의 인공뇌척수액을 이온의 변화가 있거나 약물이 함유된 인공뇌척수액으로 변환시켜 60분간 적용하였으며 저산소 손상을 주기 60분전에 정상의 인공뇌척수액으로 다시 변환, 유지시켰다.
- 본문, Table 및 Figure에 나타낸 측정치는 저산소 손상을 주기 직전의 안정화된 PS의 진폭을 기준으로 하여 각각의 측정된 PS의 진폭을 백분율로 변환시켜 평균과 표준 편차로 표시하였다. 통계 처리는 Sigma stat 1.
- 이온변화 실험군은 2군과 같은 시간 및 온도변화를 주면서 기록조에서 저산소 손상을 주기 120분전에 이온변화인공뇌척수액을 60분간 관류시키면서 결과를 관찰하였다.
- 약물 처치는 신경전달물질인 L-glutamate(100μM)와 N-MDA 수용체 억제제인 AP-5(50μM), AMPA 수용체 억제제인 CNQX(10μM)를 실험하였다. 신경전달물질인 L-gultamate를 투여하였을 때는 대조군인 2군과 차이가 없었으며(Fig.
- 기록조에 고정된 조직절편의 CA2와 CA3 사이를 미세한 나이프를 이용하여 분리시키고 Schaffer collateral-commissural bundle을 전기적으로 자극하기 위하여 말단이 50μm 노출된 양극성 미세전기침(bipolar stimulating electrode)을 stratum radiatum에 위치시키고, 저항이 5∼15Mω이 유지되게 150mM의 NaCl 용액을 채운 미세유리 전극을 해마의 CA1부위의 stratum pyramidale에 약 100 μm 깊이로 삽입하였다. 미세전기침을 통하여 전기자극(test input, 100∼200mA, 150μsec, 0.
- 이온 및 약물 실험군은 2군과 시간배정 및 온도변화를 동일하게(배양조, 21℃, 90분；기록조, 34℃, 150분) 적용하였다. 용액내 이온의 변화는 저칼슘군(n＝6), 저마그네슘군(n ＝7) 및 고마그네슘군(n＝8)으로 하였으며 약물 투여군은 L-glutamate(100μM)(n＝6), AP-5(D,L-2 amino-5- phosphonovaleric acid, 50μM)(n＝7), CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione, 10μM)(n＝6)를 실험하였다. 이온의 변화와 약물적용은 기록조로 이동한 뒤 30분 후부터 2∼3ml/min의 속도로 관류되는 정상의 인공뇌척수액을 이온의 변화가 있거나 약물이 함유된 인공뇌척수액으로 변환시켜 60분간 적용하였으며 저산소 손상을 주기 60분전에 정상의 인공뇌척수액으로 다시 변환, 유지시켰다.
대상 데이터
- 체중 100∼150g의 흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 암수 구분없이 실험동물로 사용하였으며 할로텐으로 마취한 뒤 두부를 신속절개하여 두뇌를 적출하였다. 적출된 두뇌를 섭씨 4도의 생리식염수에 옮긴 뒤 해마부위를 적출, 중간 1/3부위를 tissue chopper(Electron Microscopy Sciences, USA) 를 사용하여 450μm 두께로 횡절단하여 4∼5개의 해마조직 절편을 얻었다.
데이터처리
- 본문, Table 및 Figure에 나타낸 측정치는 저산소 손상을 주기 직전의 안정화된 PS의 진폭을 기준으로 하여 각각의 측정된 PS의 진폭을 백분율로 변환시켜 평균과 표준 편차로 표시하였다. 통계 처리는 Sigma stat 1.0(Jandel Scientific Co.)을 사용, paired t-test를 통해 검증하였고 p값이 0.05 이하인 경우를 유의 수준으로 하였다.
성능/효과
- 2와 같다. 인공 뇌척수액에서 PS의 진폭은 Fig. 2에서와 같이 저산소 상태에서 모두 소실되었다가 산소를 재공급한 후 서서히 회복됨을볼 수 있었다. Fig.
- 2에서와 같이 저산소 상태에서 모두 소실되었다가 산소를 재공급한 후 서서히 회복됨을볼 수 있었다. Fig. 3에서와 같이 대조군으로 삼은 2군에서의 저산소 손상후 PS의 진폭은 산소 재공급 후 약 1시간 안에 회복 가능한 부분은 거의 다 회복됨을 볼 수 있었으며 그 회복정도는 2시간까지 반응의 감소 없이 잘 유지되었다.
- 05). 즉 저산소증의 유발 전에 최장 180분간 자극을 받은 1군의 해마 조직절편에서의 PS의 회복이 2군, 3군과 비교하여 현저히 증가되었음을 알 수 있었으며, 가장 짧게 60분 동안만 자극을 받은 3군은 2군과 비교하여 PS의 회복이 적게 이루어짐을 알 수 있었다.
- 위의 결과에서 2군과 3군의 차이가 배양조와 기록조 사이의 온도차에 의한 것인지를 알아보기 위하여 2군과 동일한 시간에 기록조에 옮겼으나 첫 90분간 온도를 실온(21℃)으로 유지하여 3군과 같은 온도변화를 주었던 4군의 PS의 회복은 그림 5에서와 같이 2군보다는 약간 감소되었지만 통계 적인 의의는 없었다.
- 저칼슘군에서는 배양기간 중에 저칼슘 상태가 되면 PS는 빠르게 소실되었고 다시 정상 인공뇌척수액을 관류시키면 PS가 정상으로 회복하는 것을 알 수 있었으며 일과성 저산소 손상후 PS의 회복은 대조군인 2군에 비해 의미있게 감소 함을 관찰할 수 있었다(Fig. 6). 저마그네슘군에서는 저마그 네슘 상태에서 PS의 뚜렸한 변화는 관찰되지 않았으나 저산소 손상후 대조군에 비하여 PS의 의미있는 증가를 관찰할수 있었다(Fig.
- 6). 저마그네슘군에서는 저마그 네슘 상태에서 PS의 뚜렸한 변화는 관찰되지 않았으나 저산소 손상후 대조군에 비하여 PS의 의미있는 증가를 관찰할수 있었다(Fig. 7). 반대로 고마그네슘군에서는 고마그네슘 인공척수액을 관류시키는 동안 PS의 증가가 관찰되었고 저산소 손상후에는 PS의 회복이 대조군에 비해 의미있게 낮음을 알 수 있었다(Fig.
- 7). 반대로 고마그네슘군에서는 고마그네슘 인공척수액을 관류시키는 동안 PS의 증가가 관찰되었고 저산소 손상후에는 PS의 회복이 대조군에 비해 의미있게 낮음을 알 수 있었다(Fig. 8).
- Niesen등21)은 세포 투과성 칼슘이온 흡착제인 1,2-bis-(2-aminophenoxy)ethrane-N,N,N’,N’- tetra-acetic acid acetoxy methyl ester(BAPTA-AM) 를 해마 조직편에 투여하였을 때의 PS의 감소를 이런 기전으로 설명하였다. 칼슘 제거용액에서 다시 칼슘이 함유되어 있는 표준인공뇌척수액으로 대치한 경우 PS의 회복을 관찰할 수 있었고, 이 상태에서 일시적인 허혈을 유발하였을 경우에 PS의 회복은 대조군보다 감소된다는 것을 본 실험에서 알 수 있었다. 즉, 허혈손상전의 해마조직편의 준비시간동안에서의 세포외 칼슘이온의 감소는 다음에 발생하는 허혈에 대하여 신경보호작용을 갖지 못하고 오히려 PS회복의 감소를 일으킴을 알 수 있었다.
- 칼슘 제거용액에서 다시 칼슘이 함유되어 있는 표준인공뇌척수액으로 대치한 경우 PS의 회복을 관찰할 수 있었고, 이 상태에서 일시적인 허혈을 유발하였을 경우에 PS의 회복은 대조군보다 감소된다는 것을 본 실험에서 알 수 있었다. 즉, 허혈손상전의 해마조직편의 준비시간동안에서의 세포외 칼슘이온의 감소는 다음에 발생하는 허혈에 대하여 신경보호작용을 갖지 못하고 오히려 PS회복의 감소를 일으킴을 알 수 있었다.
- 해마조직편의 준비기간동안에 발생할 수 있는 여러 변수 (test input의 기간, 온도, 세포외 용액의 이온의변화, 약제) 들에 의해 허혈손상후의 회복은 영향을 받으며, 손상전에 시냅스의 활성화를 유도하는 조작을 하였을 경우에는 손상후 신경세포의 활력향상을 기대할 수 있었다. 따라서 in vitro상태에서 해마조직편을 이용한 실험의 결과를 판단하는 경우 실험준비과정에서의 변수를 고려하여야만 할 것이다.
- 해마조직절편을 이용한 실험에서 적절한 모델을 찾고 준비과정 중에 발생하는 변수들에 의해 실험결과가 어떻게 영향을 받을 수 있는지를 알아보기 위하여 본 실험을 시행하였다. 준비된 조직절편을 21℃의 배양조에서 90분간 배양후 34℃의 기록조로 옮겨 150분간 0.1Hz의 전기자극(test input)을 주면서 안정시킨 뒤 10분간의 저산소 손상을 유발하고 그 결과를 관찰한 2군(대조군)에서 PS는 산소 재공급후 약 1시간 안에 회복가능한 부분은 거의 회복되며 2시간까지그 상태가 잘 유지되어 해마조직절편을 이용한 실험의 한 모델로서 의의가 있다고 판단되었다.
- 배양기간 동안 전기자극을 길게 할수록 일과성 저산소손상후 PS의 회복이 증가됨을 관찰할 수 있었으며 이 때 극단적이지 않은 온도변화는 별다른 영향이 없다고 판단되었다.
- 시냅스의 활성을 저하시켰던 저칼슘군과 고마그네슘군에서 저산소손상후 PS의 회복이 저하되었으며 NMDA 수용체가 활성화되었던 저마그네슘군에서 PS의 회복이 증가되었음을볼 때 준비기간 동안 시냅스의 활성화 정도와 종류가 실험 결과에 영향을 줄 것이라고 판단되었다. 또한 L-glutamate 투여군과 AP-5 투여군에서는 대조군과 별다른 차이가 없는 반면 CNQX 투여군에서는 일과성 저산소 손상후 PS의 증가를 관찰할 수 있어 본 실험모델에서 배양기간 중에 전기자극에 의해 주로 활성화되는 수용체는 AMPA 수용체로 판단 된다.
후속연구
- 따라서 본 실험에서 제시한 모델은 하나의 실험방법으로 유용할 것으로 판단되며 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 엄격한 변수관리가 필요하리라 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.