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문제 정의
- 또한 본 실험에서 생성된 분해산물을 기존의 TNT 분해 산물로 추정된 물질과 비교 . 검토함으로서 탈질 미생물에 의한 TNT의 분해경로와 기존의 분해경로의 유사성을 판단하고자 한다. 따라서 본 연구결과는 TNT 분해공정의 차후 실제적 접근방법을 모색하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 실험에서는 TNT 분해에 탁월한 탈질 미생물을 배양하여 TNT를 첨가함으로서 탈질 미생물에 의한 TNT의 분해과정을 고찰하고자 한다. 그 방법으로 탈질 미생물 배양액의 조성을 달리함으로서 배지 조성에 따른 미생물의 성장과 에너지원의 변화를 살펴보고 TNT의 분해와 상관관계를 조사한다.
제안 방법
- chrysosponum. Pseudomonase- 같은 순수미생물 또는 혼합 미생물을 이용하였으며 미생물이 TNT를 탄소원이나 에너지원으로 사용할 수 있도록 환경을 조성하였다. 호기 조건에서 Composting을 적용하여 TNT를 분해하고자 하였을 때 TNT의 완전분해 (무기탄소화)는 이루어지지 않았고 TNT 분해산물로 monoaminodinitrotoluene (MADNT).
- TNT와 분해 산물을 분리하기 위한 GC 오븐의 온도 프로그램은 3CTC에서 10분간 머무른 후 1분에 10℃씩 증가하여 13CTC에 도달하게 하고 다시 1분에 5P씩 증가하여 220'C 에 도달하도록 하였고 추출용매 주입구와 검출기의 온도는 250℃를 유지하였다. TNT 와 분해산물의 측정을 위하여 10mℓ의 시료를 0.5 mℓ의 헥산으로 추출한 후 10µℓ 주사기를 이용하여 추출액의 2µℓ를 가스크로마토그래피의 주입구를 통하여 주입하였다. 미생물의 TNT 분해에 의해 나타날 수 있는 분해산물들의 체류시간은 Table 2에 나타낸 바와 같다.
- 인도페놀법을 각각 이용하였다. 각 농도측정을 위하여 시료 1mℓ를 사용하였으며 UV/VIS spectrophotorneter(SHiMMZU)로 각 시료의 흡광도를 측정하였다. Chemical Oxygen Demand(COD)는 Standard Methods의 Closed Flux를 이용한 적정법을 참조하였다.
- 1에서 사용된 배양액의 조성과 동일한 상태에서 미생물의 TNT의 제거률을 도식한 것이다. 각 배양액에서 TNT의 농도는 25mg/ t S. 동일하게 유지하였으며 시간에 따라 TNT의 농도를 측정하였다. 미생물 접종이 없는 경우 초기에 주입된 TNT의 약 20%의 손실이 있었으며 Fig.
- 분해과정을 고찰하고자 한다. 그 방법으로 탈질 미생물 배양액의 조성을 달리함으로서 배지 조성에 따른 미생물의 성장과 에너지원의 변화를 살펴보고 TNT의 분해와 상관관계를 조사한다. 또한 본 실험에서 생성된 분해산물을 기존의 TNT 분해 산물로 추정된 물질과 비교 .
- 4에 나타난 바와 같이 TNT가 TAT로 환원된 다음 탈아미노작용에 의해 톨루엔으로 변하는 것이다. 따라서 본 실험에서는 Fig. 4에 제시된 분해경 로상의 분해산물을 구매 하여 가스크로마토고래피로 그 체류시간을 비교·검토하였다. 본 실험에서 보여지는 분해산물의 유형은 사용된 모든 배양액에서 동일한 형태로 나타나는데 Fig.
- 그 방법으로 탈질 미생물 배양액의 조성을 달리함으로서 배지 조성에 따른 미생물의 성장과 에너지원의 변화를 살펴보고 TNT의 분해와 상관관계를 조사한다. 또한 본 실험에서 생성된 분해산물을 기존의 TNT 분해 산물로 추정된 물질과 비교 . 검토함으로서 탈질 미생물에 의한 TNT의 분해경로와 기존의 분해경로의 유사성을 판단하고자 한다.
- 흡광광도분석기 (SHIMAZU UV1601)를 이용하여 600nm에서 배양액의 홉광도를 측정함으로서 미생물의 성장을 측정하였다. 미생물에 의한 흡광 이외의 간섭작용을 보정해주기 위해 미생물 접종이 되지 않은 시료를 준비하여 접종된 시 료와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 보정하였다.
- 미생물의 성장과 TNT 분해의 상관관계를 살펴보기 위해 Table 4에 열거된 에너지원으로 구성된 배양액에 탈질 미생물을 접 종하고 광학적 관찰을 통해 미생물의 성 장을 시간에 따라 측정하였다. Fig.
- 배양액 제조에 쓰여진 모든 약품은 순도 99% 이상으로 배양액에서 화학적 조성을 다음 Table 1에 요약하였다. 배양액의 혐기조건을 맞추어 주기 위해 배양액은 10분 이상 질소폭기한 후 용존산소 분석기 (CORNING, CAT. 475657)를 통해 용존산소량이 없음을 확인한 다음 증기멸균 하였으며 실험에 사용된 세럼병과 주사기 등 모든 재료는 15분 동안 증기멸균과정을 거치었다. 염의 침진을 막기 위해 800mg/(! CaCR .
- 본 미생물 성장실험은 탈질 미생물 성장과 TNT 분해특성을 살펴보고자 세럼병을 이용하여 회분식 반응조를 설치한 후 여러 조합의 에너지원을 공급하고 각 조건에서 에너지원의 이용특성을 비교 . 분석하고자 하였다.
- 배양하였다. 흡광광도분석기 (SHIMAZU UV1601)를 이용하여 600nm에서 배양액의 홉광도를 측정함으로서 미생물의 성장을 측정하였다. 미생물에 의한 흡광 이외의 간섭작용을 보정해주기 위해 미생물 접종이 되지 않은 시료를 준비하여 접종된 시 료와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 보정하였다.
대상 데이터
- 2, 4~dinitrotoluene(24DNT). 2~nitrotoluene(2NT), 4enitrotoluene(4NT), 2-aminotoluene(2AT), 4-aminotoluene(4AT)는 Chem Service에서 구매하였으며 사용된 유기용내는 모두 HPLC급 이었다. 회분식 반응조에 사용된 배양액은 기본적으로 초산을 탄소원으로 하고 질산이온을 에너지원으로 구성하였으며 일정한 pH를 조성하기 위해 완충용액으로 인산을 사용하여 제조한 후 가성소다 또는 황산을 사용하여 pH를 7로 조정하였다.
- TNT와 분해산물의 측정을 위하여 RESTEK-5 칼럼과 불꽃이 온검출기가 장착된 가스크로마토그래피 (YOUNGLIN GC 600DX 이용하였다. TNT와 분해 산물을 분리하기 위한 GC 오븐의 온도 프로그램은 3CTC에서 10분간 머무른 후 1분에 10℃씩 증가하여 13CTC에 도달하게 하고 다시 1분에 5P씩 증가하여 220'C 에 도달하도록 하였고 추출용매 주입구와 검출기의 온도는 250℃를 유지하였다.
- 본 실험에서 사용된 TNT, 2-amino.4, 6-dinitrotoluene(2A46DNT), 4eamino, 2, 6- dinitrotoluene(4A26DNT), 2, 6-dinitrotoluene(26DNT). 2, 4~dinitrotoluene(24DNT).
- 탈질 미생물을 분리하기 위해 충청북도 세명대학교 인근 하수구에서 채취된 토양을 Table 1에 나타난 배양액에 접종한 후 혐기상태에서 배양하였다. 흡광광도분석기 (SHIMAZU UV1601)를 이용하여 600nm에서 배양액의 홉광도를 측정함으로서 미생물의 성장을 측정하였다.
이론/모형
- 각 농도측정을 위하여 시료 1mℓ를 사용하였으며 UV/VIS spectrophotorneter(SHiMMZU)로 각 시료의 흡광도를 측정하였다. Chemical Oxygen Demand(COD)는 Standard Methods의 Closed Flux를 이용한 적정법을 참조하였다. 본 연구에서 사용한 실험 방법을 Table 3에 요약하였다.
- 아질산이온. 그리고 암모니아의 농도측정을 위하여 수질공해 공정시험법의 부루신법. 디아조화법.
- 디아조화법. 인도페놀법을 각각 이용하였다. 각 농도측정을 위하여 시료 1mℓ를 사용하였으며 UV/VIS spectrophotorneter(SHiMMZU)로 각 시료의 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 1)회분식 반응조에서 탈질미생물의 성장률은 TNT가 배양액에 없을 때 가장 왕성하게 나타났으며 배양액에 TNT와 질산이온이 공존하는 경우 경쟁적으로 전자수용체로서 작용하여 탈질 미생물의 성장을 지연시키는 요인이 된다. 또한 TNT를 초기에너지원(primary electron acceptor) 또는 질소원으로 이용시 가장 빠른 TNT 제거률을 보여 주었다.
- 성 장을 시간에 따라 측정하였다. Fig. 1에서 보여지듯이 미생물의 성장은 바탕실험(배양액 F)을 제외한 모든 배양액에서 나타났는데 이는 본 실험에서 사용된 미생물은 질산이나 TNT를 초기 전자수용체 (Primary Electron Acceptor)로서 사용함과 동시에 질소원(Nitrogen Source)으로 사용하고 있음을 나타낸다. 배양액에 TNT가 없을 경우-(배양액 D) 미생물의 성장특성은 다른 배양액 (TNT가 함유된 경우)보다 지체기가 짧게 나다났는데 이는 TNT"} 함유된 배양액에서는 질산의 환원과 TNT의 니트로그룹의 환원이 경쟁적으로 진행되고 있으며 TNT의 환원보다 질산이온의 환원이 선호된다는 것을 보여준다.
- 이는 배양액에 TNT와 같은 경쟁적 물질이 존재할 경우 TNT를 제외한 에너지원에 의해 미생물의 성장은 지속하더라도 TI\T의 분해는 일어나지 않을 수 있다는 것을 나타나는 것이다. TNT가 질소원 또는 전자수용체로 작용할 수 있는 배양액 C에 변환률이 가장 높게 나타났으며 Yeast Extract가 없는 경우(배양액 E)는 미생물 성장실험 결과와 다르게 TNT의 제거률이 그 다윽으로 빠르게 나타났으며 TNT가 질산성 질소와 같이 있을 경우(배양액 D) TNT의 제거률은 Yeast Extract가 없는 겅우(배양액 E)보다 약간 더 늦거 나타났다. Osmon & Klausmeier'"의 실험결과에서는 배양액 중 Yeast Extract의 첨 가는 TNT의 분해를 촉진한다고 하였으며 Won(2)의 보고에 의하면 yeast exbract가 질소원을 함유한다고 하였다 따라서 본 실험과 같이 TNT가 질소원으로 사흥되는 경우 yeast extract의 첨가는 배지에 질소원을 공급하여 TNT의 분해 촉진에 긍정적인 영향을 주지 않는 것으로 사료된다.
- 이는 배양액 A에 주입된 초산이 미생물 성장에 미치는 영향은 매우 미미하다는 것을 의미하는데 이러한 결과는 초산 이외에 배양액에 존재하는 yeast extract가 탄소원으로 작용하고 있는 것으로 보여진다. 다시 말해서 배양액에 탄소원으로 초산과 yeast extract가 존재하고 질산이 전자수용체 로 미생물의 성장을 지원하나 질산의 농도가 부족되 어 제 한기질 (limiting substrate)로 작용하여 배양액에 주입된 초산의 농도에서 미생물의 성장은 초산이 주입되지 않은 배양액과 매우 유사하게 나타나는 것이다. 이는 배양액 E에서 (yeast extract가 없을 때) 성장의 지연이 확연히 나타나고 있는 것으로도 알 수 있다.
- 된다. 또한 TNT를 초기에너지원(primary electron acceptor) 또는 질소원으로 이용시 가장 빠른 TNT 제거률을 보여 주었다.
- 본 실험에서는 황산염환원균뿐만 아니라 탈질미생물에의한 TNT의 분해도 질소원 또는 초기 에너지원으로 사용된다는 것을 보여주었고 이 조건에서 TNT 의 분해력이 가장 빠르다는 것을 알 수 있었다. 배양액 에 Yeast Extract를 주입 함으로서 미 생물의 성장과 질산의 환원력을 높여 주었으나 질소원으로서 TNT가 사용될 때 Yeast Extract의 첨가는 배양액에 질소원이 공급됨으로서 TNT의 분해가 저해되는 현상을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 Won11,12)의 보고서에 나타나듯이 Yeast Extract 가 가지고 있는 질소의 영향으로 볼 수 있다.
- 본 실험에서 보여주는 TNT외에 다른 초기 전자수용체 와 질소원이 배제된 배 양액 에서의(배 양액 C) 미생물의 성장은 TNT가 초기에너지원과 질소원으로 사용되고 있음을 나타내는 것으로 TNT의 탈니드로기의 가능성을 제시한다고 볼 수 있다. Boopathy et al.
- 본 실험에서 초기전자주게(Primary Electron Donor)로 초산이 사용되었는데 Fig. 1에 도식된 초산이 배양객에 존재하는 경우(배양액 A) 와 초산이 존재하지 않는 경우(배양액 B)의 미생물 성장곡선을 비교해보면 미생물 성장의 차이가 매우 미미한 것을 알 수 있다. 이는 배양액 A에 주입된 초산이 미생물 성장에 미치는 영향은 매우 미미하다는 것을 의미하는데 이러한 결과는 초산 이외에 배양액에 존재하는 yeast extract가 탄소원으로 작용하고 있는 것으로 보여진다.
- Boopathy & Kulpa/'의 보고서에 나타났듯이 초기에너지원으로 사용된 TNT의 분해작용은 탈니트로기의 작용에 의해 질소가 함유되지 않은 톨루엔을 마지막 분해산물로 나타낸다. 본 실험에서는 황산염환원균뿐만 아니라 탈질미생물에의한 TNT의 분해도 질소원 또는 초기 에너지원으로 사용된다는 것을 보여주었고 이 조건에서 TNT 의 분해력이 가장 빠르다는 것을 알 수 있었다. 배양액 에 Yeast Extract를 주입 함으로서 미 생물의 성장과 질산의 환원력을 높여 주었으나 질소원으로서 TNT가 사용될 때 Yeast Extract의 첨가는 배양액에 질소원이 공급됨으로서 TNT의 분해가 저해되는 현상을 볼 수 있었다.
- 4)의 연구결과에 따르면 TNT는 탈질 미생물의 성장과정에서 공동대사작용에 의해 분해된다고 보고하였으며 또 다른 연구 결과에서는2,3) 황산염 환원균을 이용하였는데 이 때의 TNT는 질소원 및 초기에너지원으로 사용되었고 그 분해산물로 톨루엔이 검출되었다고 보고하였다. 본 실험의 결과는 TNT를 초기 에너지원 및 질소원으로의 활용한 Boopathy의 실험결과와 매우 유사한 것이나 황산염 환원균 뿐 아니라 탈질 미생물에 의해서도 TMT 가 초기에너지원 및 질소원으로 사용될 수 있음을 새롭게 보여 주었다.
- 세럼병을 이용한 회분식 실험에서 나타난 결과를 살펴보면 본 실험에서 사용된 탈질 미생물의 특성은 TNT를 초기에너지원 및 질소원으로 사용하고 있다는 것이다. Boopathy & Kulpa/'의 보고서에 나타났듯이 초기에너지원으로 사용된 TNT의 분해작용은 탈니트로기의 작용에 의해 질소가 함유되지 않은 톨루엔을 마지막 분해산물로 나타낸다.
- 미생물 접종이 없는 배양액어)서(배양액 F) 질산성 질소의 농도는 실험이 진행된 기간동안 변화가 없었는데 이는 미생물 접종이 없을 경우 질산성 질소의 비생물학적 (abiotic) 변화는 없다는 것을 의미한다. 초산과 질산성 질소가 존재하고 TNT가 없는 배양액에서(배양액 D) 질산성 질소의 농도는 다른 배양액에 비해 빠르게 줄어들었으며 질산성 질소의 감소와 더불어 아질산성 질소의 농도가 증가하다가 감소하는 전형적인 탈질 형태를 보여주었다. 이는 앞의 Fig.
후속연구
- 이러한 결과는 Won11,12)의 보고서에 나타나듯이 Yeast Extract 가 가지고 있는 질소의 영향으로 볼 수 있다. 가스크로마토그래프를 이용한 TNT 분해산물의 측정에서 기존에 보고된 경로상의 분해산물은 검출되지 않았으나 기존에 보고된 분해경로와 다른 형태의 분해과정이 존재한다는 것을 알 수 있었으며 차후 이에 대한 연구에 지속적인 관심이 요구되는 바이다. 본 실험에서 나타난 주요한 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 검토함으로서 탈질 미생물에 의한 TNT의 분해경로와 기존의 분해경로의 유사성을 판단하고자 한다. 따라서 본 연구결과는 TNT 분해공정의 차후 실제적 접근방법을 모색하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
- 이리한 아미노그룹을 가지는 중간 생성물은 반응성이 강한 관계로 TNT의 폭발성은 약화할 수 있으나 더욱 유해한 물질로의 전환이라는 관점에서 바람직하지 못하다. 본 실험에서는 TNT의 분해 산물을 완전히 파악하지 못하였으나 TNT의 니트로그룹이나 아미노그룹을 함유하지 않는 또 다른 분해산물을 생성하였음을 알 수 있는데 이러한 결과는 분해산물의 완전히 파악함으로서 차후 TNT의 무해화 공정 적용에 도움이 될 것으로 사료된다.
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