고환조직 동결-융해 후 회수된 고환 정자에 대한 Hypo-osmotic Swelling (HOS) Test의 효과 Effect of Hypo-osmotic Swelling (HOS) Test on Subsequent Post-thaw Testicular Spermatozoa원문보기
Objectives: We have previous reported that thawed testicular sperm and sperm extracted from seminiferous tubule could achieved optimal fertilization and pregnancy in azoospermic patients. However, thawed testicular sperm did not show motility in many cases. Therefore we studied viability of immotile...
Objectives: We have previous reported that thawed testicular sperm and sperm extracted from seminiferous tubule could achieved optimal fertilization and pregnancy in azoospermic patients. However, thawed testicular sperm did not show motility in many cases. Therefore we studied viability of immotile sperm extracted from frozen-thawed seminiferous tubule using hypo-osmotic swelling (HOS) test and eosin-Y test. Materials and Methods: After sperm extraction using for ICSI, the remained sections of seminiferous tubules were frozen with a computerized freezer. For thawing and preparation of testicular sperm, the seminiferous tubules were thawed by removing from $LN_2$ and letting them at room temperature for 10 min followed by %37^{\circ}C$ water bath for 10 min. The prepared samples were washed for free of preservation medium and sperm preparation method described previous. Sperm was suspended in 0.1 ml hypoosmotic solution. After 30 minutes, the type of distally coiled sperm were assessed. Results: In 44 cases of cryopreservation of seminiferous tubules in obstructive azoospennic patients, the fertilization rates with 2PN were 71.4% and pregnancy rates were 34.1%. The presence of motile spermatozoa on subsequent post-thaw testicular sperm remarked 15.1% and were increased to 77.3% just before ICSI. After sperm extracted from frozen-thawed seminiferous tubule, 3 hrs later in in vitro culture, the cases of presence of motile sperm, reaction of hypo-osmotic swelling test and viable sperm were 63.6% (28/44), 93.2% (41/44), and 77.3% (34/44), respectively. Conclusions: Just after post-thawed testicular sperm did not showed motility. Although motility was gained after in vitro culture, many cases showed non-motile sperm until optimal insemination time. However, HOS test showed positive reaction in non-motile sperm. Therefore, HOS test is an alternative method for the selection of viable sperm for ICSI.
Objectives: We have previous reported that thawed testicular sperm and sperm extracted from seminiferous tubule could achieved optimal fertilization and pregnancy in azoospermic patients. However, thawed testicular sperm did not show motility in many cases. Therefore we studied viability of immotile sperm extracted from frozen-thawed seminiferous tubule using hypo-osmotic swelling (HOS) test and eosin-Y test. Materials and Methods: After sperm extraction using for ICSI, the remained sections of seminiferous tubules were frozen with a computerized freezer. For thawing and preparation of testicular sperm, the seminiferous tubules were thawed by removing from $LN_2$ and letting them at room temperature for 10 min followed by %37^{\circ}C$ water bath for 10 min. The prepared samples were washed for free of preservation medium and sperm preparation method described previous. Sperm was suspended in 0.1 ml hypoosmotic solution. After 30 minutes, the type of distally coiled sperm were assessed. Results: In 44 cases of cryopreservation of seminiferous tubules in obstructive azoospennic patients, the fertilization rates with 2PN were 71.4% and pregnancy rates were 34.1%. The presence of motile spermatozoa on subsequent post-thaw testicular sperm remarked 15.1% and were increased to 77.3% just before ICSI. After sperm extracted from frozen-thawed seminiferous tubule, 3 hrs later in in vitro culture, the cases of presence of motile sperm, reaction of hypo-osmotic swelling test and viable sperm were 63.6% (28/44), 93.2% (41/44), and 77.3% (34/44), respectively. Conclusions: Just after post-thawed testicular sperm did not showed motility. Although motility was gained after in vitro culture, many cases showed non-motile sperm until optimal insemination time. However, HOS test showed positive reaction in non-motile sperm. Therefore, HOS test is an alternative method for the selection of viable sperm for ICSI.
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문제 정의
test 를.실시하여 이들의 이용 가능성을 조사하였다.
이에 본 연구에서는 정상적인 시험관 아기 시술 후 임신에 실패하였을 경우 다음 IVF-ET 주기에 사용하기 위하여 동결된 세정관 일부를 융해 후 회수된 비 활력 고환 정자를 대상으로 HOS test 를.실시하여 이들의 이용 가능성을 조사하였다.
제안 방법
같다."0 방법을 약술하면, 초막 (tunica vaginahs)과 백막 (tunica albuginea)을 절개하여 세정관 (seminiferous tubule)을 추출한 후 0.4% BSA가 첨가된 Ham's F-10 배 양액으로 옮겨 해부현미 경 하에서 조심스럽게 세정관을 미세겸자로 짜내어 (squeezing) 추출물을 얻은 후, 현미경하에서 정자의 존재 여부를 확인하였다. 정자가 확인된 경우 세정관을 몇 부분으로 나누어 동결 보존하였다.
ⅣF 시술을 시행한 환자 중 TESE 시행 시 정자생산 기능에 문제가 없는 것으로 확인된 폐쇄성 무정자증 환자 44례에서 601개의 난자를 회수하였으며, 507개의 난자에 동결된 고환조직 을 융해 후 회수된 정자를 이용하여 ICSI를 시행하였다. 총 수정률은 71.
ⅣF 전주기에서 임신에 실패하였을 경우, 반복적인 고환조직 생검을 피하기 위하여 동결 보존된 고환조직내 정자의 이용 가능성을 알아보기 위 하여 보관된 조직의 일부를 융해한 후 3시간째 정 자의 운동성 관찰, HOS test와 생존성 검사를 시행하였다(Table 3).
고환조직 의 일부에서 회수된 정자는 그 수가 극히 제한되어 있으므로 50마리의 정자를 세어 계산하였다. 저 장 용액 (hypo-osmotic solution)은 증류수 100 ml에 sodium citrate 0.
1 ml를 첨가하여 피펫으로 부드럽게 섞었다. 그 후 37P에서 30분이 경과하지 않도록 정치시킨 후 위상차 현미 경하에서 꼬리 모양의 변화로 정 자의 팽 창 여부를 확인하였다. 저장 용액에 반응한 정자수는 100마리 정자 총 마리 수에서 팽창 정자의 수를 두 번 반복해서 세어 평균수를 계산하였다.
난자 채취와 확인 및 세포질내 정자 주입 술은 이 미 보고된 바와 같다방법을 약술하면, FSH/ hMG와 GnRH agonist를 병 용하여 과배 란을 유도한 후, 채취한 난자-난구 복합체를 현미경 하에서 난자의 성숙 정도를 판정하여 제1극체가 방출된 제 2감수분열 중기 의 난자만을 ICSI에 사용하였다.
본 연구는 1998년 8월부터 1999년 5월까지 삼성 제일병원 불임크리닉을 내원하여 시험관 아기 시술을 시행한 환자 중 전 주기에서 TESE를 시행 시 정자 생산 기능에 문제가 없는 것으로 판명된 폐쇄성 무정자증 환자 44례에서 TESE 실시 후 세정관을 동결 보존하였으며, 다음 시험관 아기 시술 주기에 반복적인 고환조직 절개를 피하기 위하여 동결 보존된 세정관 일부를 회수하여 HOS test를 시행하였다. 이들의 평균 연령은 남편이 37.
융해는 ampule 을 액체질소에서 꺼내어 실온에서 10분간 정치시킨 후 37t 항온수조에서 10분간 정치시켜 실시하였다. 융해가 끝난 후 동해방지제를 제거하기 위하여 배양액으로 몇 차례 세척하고 회수된 세정관은 전술한 바와 같은 방법으로 정자 추출과정을 시행하였다.
그 후 37P에서 30분이 경과하지 않도록 정치시킨 후 위상차 현미 경하에서 꼬리 모양의 변화로 정 자의 팽 창 여부를 확인하였다. 저장 용액에 반응한 정자수는 100마리 정자 총 마리 수에서 팽창 정자의 수를 두 번 반복해서 세어 평균수를 계산하였다.
추출된 정자의 생존 여부를 확인하기 위하여 다시 신선한 배양액으로 몇 차례 세척한 후 eosin- Y 용액을 이용하여 생존성을 확인하였다. 고환조직 의 일부에서 회수된 정자는 그 수가 극히 제한되어 있으므로 50마리의 정자를 세어 계산하였다.
데이터처리
결과에 대한 통계 적 분석은 /-test를 이용하였고, p 값이 0.05 이하인 경우를 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
p data-page="1">고환조직 정자채취 술(testicular sperm extraction; TESE, 이하 TESE)과 세포질내 정자주입 술(intra- cytoplasmic sperm injection; ICSI, 이하 ICSI)은 무정자증으로 인한 남성불임 환자에서 수정률과 임신율을 높일 수 있는 유용한 방법으로 알려져 있으나, 임신에 실패하였을 경우 반복적인 고환조직 절개는 불가피하며 이를 피하기 위해 고환 정자를 동결 하거나, 세 정관을 몇 부분으로 나누어 보존, 이를 반복 융해하여 사용하는 방법이 많은 연구자들에 의해 보고되었다.9" 고환 정자 동결의 중요성이 높아지는 이유는 임신에 실패하였을경우, 반복적, 다중적 TESE없이 고환 정자를 이용할 수 있고, 고환조직의 손상을 줄일 수 있으므로 신체적, 경제적 부담을 줄일 수 있다. 그러나, 고환 정자의 경우 부고환 정자나 사정 정자에 비해 적은 농도와 낮은 운동성, 세정관내에 정자와 spermatid 외 에 발달 단계의 정자세포(sperma- togenic cell), Sertoli ceD, red blood ceD, white blood cell, interstitial cell 등의 혼지 등의 요인으로 고환 정자의 동결, 융해 후 생존율이 매우 낮은 것으로 보고되고 있다.
3%)와 비교하여 약간 낮은 비율을 보였으나, 이는 정자의 움직임을 확인하는 시간적 차이 때문으로 사료된다. 그리고 HOS test를 이 용하여 정자의 생존 여부를 확인한 결과 41례에서 반응을 나타냈으며 (93.2%), eosin-Y를 이용하여 생존성을 확인한 결과 34례 (77.3%) 생존이 확인되었다. 이와 같이 운동성 관찰에 비해 HOS test와 eosin-Y 검사 방법의 결과가 높은 것으로 관찰되어 비록 운동성은 나타내지 않았더라도 정자의 생존 가능성을 예측할 수 있으며, eosin-Y 방법 에비해 HOS test의 결과가 높은 이유는 두 방법 간의 반응에 대한 민감도의 차이에 기인하는 것으로 사료된다.
26 인간 정자의 membrane integrity를 확인하는 방법으로 McLaughlin 등27이 정자 꼬리의 팽 창을 확인하는 HOS test법과 손상된 원형질막을 갖고 있는 정자 두부의 핵에 H33258을 이용한 생존성 검사 방법을 비교하였는더}, 그들에 의하면 이 두 방법간에는 높은 상관관계가 있으며 따라서 HOS test는 인간 정자의 membrane integrity를 확인하는 유용한 방법이라 보고하였다. 본 연구에서 HOS test와 eosin- Y 검사 방법이 운동성 관찰에 비해 생존한 정자의 수가 유의하게(1x0.05) 많음을 알 수 겄으나, HOS test와 eosin-Y 검사 방법 간의 결과의 차이는 hypo-somotic solution0)] 처리 하는 시 간의 차이와 동일한 표본의 각기 다른 osmotic prossue에 기인한 원인으로 사료되나 이에 대한 연구는 더 수행되어야 겠다 Smikle과 Turek*은 비활력 고환 정자와 사정 정자를 저장 용액에 30분간 처리한 후 13개의 난자에 ICSI를 시행하여 9개의 난자에서 정 상적 인 수정 (69%)을 확인하였으며, 30분 이상 배양하였을 시 sensitivity는 증가하지만, HOS test 결과에 대한 specificity와 예측가는 감소한다고 보고하였다. Casper 등&은 완전한 무력정자증 (complete asthenozoospermia) 환자의 정액에서도 50% 이상의 생존 정자를 확인하였으나, HOS test 후 선별한 정자를 이용하여 ICSI를 시행한 결과 각각 43%와 39%의 수정률과 배발생율을 보고하여 ICSI를 위해 HOS test 후 정자를 선별하는 방법은 완전한 방법은 아니며, Tsai 등29에 의하면, WHO"에 서 제 시 한 ftuctose와 sodium citrste를 이용한 HOS test는 저장 용액에서 30분 이상 처리하였을 경우 생존 정자도 죽기 때문에 ICSI에 적용하기에 부적합하지만 150 mOsm, 0.
이와 같은 결과로 고환조직의 융해 후 회수된 정자의 생존성을 확인한 후 회수된 정자의 사용 여부 또는 TESE 재시도 여부를 결정하는 것이 바람직하며, HOS test는 이들 고환조직 동결-융해 후 회수된 정자의 생존율을 확인할 수 있는 유효한 방법으로, ICSI를 이용한 수정 률을 높일 수 있는 유효한 방법이 라 하겠다.
3%) 생존이 확인되었다. 이와 같이 운동성 관찰에 비해 HOS test와 eosin-Y 검사 방법의 결과가 높은 것으로 관찰되어 비록 운동성은 나타내지 않았더라도 정자의 생존 가능성을 예측할 수 있으며, eosin-Y 방법 에비해 HOS test의 결과가 높은 이유는 두 방법 간의 반응에 대한 민감도의 차이에 기인하는 것으로 사료된다.
정자 꼬리의 미약한 움직임도 ICSI에 이용하기 위한 살아 있는 정자의 기준으로 정하기 위하여 정자 꼬리의 움직 임을 관찰한 결과 TESE 후 움직임이 관찰된 정자는 7례 (15.9%)에서 34례 (77.3) 로 증가하여 TESE 후 일정 시간 체외배양은 정자의 운동성을 높이는 효과가 있었다.
시행하였다. 총 수정률은 71.4% (362/507)였으며 평균 4.0 ±1.2 개(msn土SD)의 수정란을 이식하여 15례 (34.1%) 와 13례 (29.5%)의 임신 및 임상적 임신율을 보였다 (Table 1).
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