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문제 정의
- 따라서 일반적으로 많이 실시하고 있는 이식 방법 인 난자채취 후 2일째에 배아이식을 실시한 경우 (Day 2 ET)와 2일과 5일째 에 연속으로 배아 이식을 실시한 경우 (SET)로 나누어 임상 결과를 비교 분석하여 체외수정시술에서 임신율을 향 상시킬 수 있는 방법을 모색하고자 본 연구를 실시하였다.
- 본 연구에서 난자의 수정과 배아 발달에 사용한 배양액인 DMEM과 배 양액에 첨가한 난포액은 저자들이 이전에 실시한 실험결과를 바탕으로 하였다. 인간 난자를 장기 간 배 양할 때 배 양액으 로 DMEM을 이용하여 배반포기 배아의 형성이 좋았는데 특히 BG1의 출현율이 높게 나타났다.
제안 방법
- 수정이 이루어진 난자를 5~7일간 배양하면 부적절한 배양환경으로 인하여 배반포기 배아의 형성이 저 조하게 나타나므로: human ampullary cells,18 bovine uterine fibroblasts29 또는 monkey vero cells'"''과 같은 feeder cell을 이용하여 공배 양을 실시하고 있는데, 본 연구에서는 저자들이 인간 난자를 배반포기까지 배양할 때 효과적으로 이 용 한 결과를 바탕으로 vero cell을 공배 양에 사용하였다.
- Mid-luteal phase에서 Buserelin (900 pg; Suprecur, Hoechst, Germany)를 투여 하기 시작하여, 혈청 estradiol로서 pituitary shutdown을 확인한 후 human menophosal gonadotropin (hMG, Pergonal, Serono, Italy 또는 IVF-M, LG, Korea)을 투여했다. Estradiol의 농도와 난포 수 및 난포의 크기를 기초로 한 난소 반응에 따라 hMG의 투여 량을 조절하였다. 난포의 직경이 17 mm 이상인 것이 2개 이상이 고 estradiol의 농도가 900 pg/ml 이상일 때 10,000 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, FVF-C, LG, Korea)을 투여 하여 배 란을 유도하였다.
- 과배 란은 gonadotropin releasing hormone agonist (GnRH-a)를 이용한 장기요법을 실시하여 유도하였다. Mid-luteal phase에서 Buserelin (900 pg; Suprecur, Hoechst, Germany)를 투여 하기 시작하여, 혈청 estradiol로서 pituitary shutdown을 확인한 후 human menophosal gonadotropin (hMG, Pergonal, Serono, Italy 또는 IVF-M, LG, Korea)을 투여했다. Estradiol의 농도와 난포 수 및 난포의 크기를 기초로 한 난소 반응에 따라 hMG의 투여 량을 조절하였다.
- Vero oeHe Olibi 등의 방법에 따라 동결되어 있는 cell을 융해하여 2~3x10$ cell을 체척한 후 culture flask (3013, Falcon, USA)에서 4일 동안 (6~8X10$ cell) 배양하고, 3 ml의 trypsin-EDTA (25300-054, Gibco, USA)를 10~20초간 처리하여 cell suspension을 유도하고, FBS를 주입 하여 tryp을 중화시킨 다음, cell scraper (3010, Costar,USA)로 cell을 dish 바닥에서 분리하였다. 분리된 celle 10 ml의 배양액으로 세척하고 (900 rpm, 30분) 나서 3개 정도로 나누었다.
- 난포의 직경이 17 mm 이상인 것이 2개 이상이 고 estradiol의 농도가 900 pg/ml 이상일 때 10,000 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, FVF-C, LG, Korea)을 투여 하여 배 란을 유도하였다. hCG 를 주사한 후 34시간에 질식초음파 (ultrasound Scanner, 1846; Probe, 8538, Briiel & Kjaer Medical, Denmark)를 보면서 난자채 취 바늘 (Double Lumen Follicle Hushing Ovum Pick-Up Needle Set, K-OPSD1735-LL, COOK, Australia)로 난포에서 난자를 채 취하였다.
- 각각의 실험 설계에 따라 수정율, 배아 발달율 및 임신율을 비교 • 조사하였다. 결과에 대한 분석은 통계프로그램 인 Microsoft Excel-97을 이용하였다.
- Estradiol의 농도와 난포 수 및 난포의 크기를 기초로 한 난소 반응에 따라 hMG의 투여 량을 조절하였다. 난포의 직경이 17 mm 이상인 것이 2개 이상이 고 estradiol의 농도가 900 pg/ml 이상일 때 10,000 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, FVF-C, LG, Korea)을 투여 하여 배 란을 유도하였다. hCG 를 주사한 후 34시간에 질식초음파 (ultrasound Scanner, 1846; Probe, 8538, Briiel & Kjaer Medical, Denmark)를 보면서 난자채 취 바늘 (Double Lumen Follicle Hushing Ovum Pick-Up Needle Set, K-OPSD1735-LL, COOK, Australia)로 난포에서 난자를 채 취하였다.
- 다음날 아침, 37와 5% C6로 조절된 조작기 내에 있는 해부현미경 하에서 syringe needle (320310, BD, USA)로 난구세포를 제거하고 나서 수정 여 부를 조사하였다. 자성 전핵과 웅성 전핵 이 형성되어 있고 두 개의 극체가 있는 것을 수정이 된 것으로 확인하였다.
- 첫 번 째는 난자채취 후 2일 (Day 2)에 14세포기의 배 아를 이식한 19주기를 대상으로 하였다. 두 번째는 난자채취 후 2일 (Day 2)에 2-4세포기의 배아 를 이식 하고 남은 여 분의 배 아를 5일 (Day 5)까지 배양하여 배반포기 단계에서 한번 더 배아를 이 식 한 18주기 를 대상으로 하였다.
- 배 아이 식 후 매일 50 mg의 황체호르몬 (progesterone in oii, Progest, Samil, Korea)을 근육 주사하였다. 배아이식 후 10~12일째 혈중 |3-hCG의 농도가 10 mIU/ml 이상일때 임신의 성공으로 확인 하였다.
- 2 의 여과기 (SLGV R25 LS, Millipore, France)로 제균 하면서 14 ml tube (2001, Falcon, USA)에 분주한 다음 41에서 보관하였다. 배 양액은 95% 이상의 습도, 371 및 5% C6를 유지하고 있는 배양기 (3154, Foma, USA)에서 6시간 이상 평형시킨 다음 이용하였다.
- 배아이식 후 10~12일째 혈중 |3-hCG의 농도가 10 mIU/ml 이상일때 임신의 성공으로 확인 하였다. 배아이식 3주 후에 질식초음파 검사에서 태낭 (gestational sac)이 관찰되는 경우를 임상적 임신으로 정의하고 임신 6~7주에 태아의 심 장박 동을 관찰하였다.
- 본 연구에는 37주기의 체외수정시술을 시행한 환자를 대상으로 day 2에 이식한 것과 day 2와 day 5에 연속으로 이식한 군으로 나누었다. 첫 번 째는 난자채취 후 2일 (Day 2)에 14세포기의 배 아를 이식한 19주기를 대상으로 하였다.
- '2 성숙 정도에 따라 DMEM (+10% hFF)이 들어있는 배 양접 시 (3037, Falcon, USA)로 각기 다르게 옮긴 다음 수정 시기 까지 COj 배양기에서 배양하였다. 수정 에 이용하는 난자는 배양접시 당 5개 이하가 되도록 조절 하였다.
- 수정 이 확인된 난자는 vero cell과 공배 양을 실시하였다. 공배양 접시의 준비는 공배양을 실시 하기 하루 전날 20% hFF가 첨가돤 DMEM으로 교 체하였으며, 2~3일 후에 이와 같은 방법으로 공 배양접시를 교체하면서 이식 직전까지 배양하였다.
- 배아를 이식할 때에는 Tomcat catheter (8890-793021, Sherwood, USA)< 이용하였으나, Tomcat catheter로 이식이 되지 않는 경우에는 Jansen-Anderson catheter (Jansen-Anderson Bulb Tip Embryo Transfer Catheter Set, K-JET-3200, G)ok, Australia) 를 이용하였다. 실험 1에서는 Day 2에서만 배아 (2-4세포기 배아, G1-G3)를 이식 하였고, 실험 2에 서는 Day 2에서 배아 (2V세포기 배아, G1-G3)를 이식 하고 나서 여 분의 배아는 Day 5까지 배 양한 다음 배반포가 확인된 배아 중에서 BG1만을 이 식하여 한 주기에서 이식을 2회 실시하였다. 배아 이식 후에는 최소한 6시간 이상 환자를 안정시킨 후 귀가시 켰다.
- 정자의 처리에 사용한 F-10 Nutrient Mixture Medium (Ham's F-10, 11550-043, Gibco, USA)은 1.2 g/I의 NaHCCh (S-5761, Sigma, USA)를 첨가하여 제조하였다. 난자의 수정과 배양에는 DMEM (11966-025, Gibco, USA)을 사용하였고, vero cell의 준비에는 TCM-199 (11150-059, Gibco, USA)을 이용하였다.
- 채취한 난자는 37E와 5% COz로 조절된 조작 기 (IVF chamber, Hoffinan, USA)내에서 해부현미 경 (SMZ-10, Nicon, Japan)을 이용하여 세포질 내 핵의 유 - 무와 난구세포의 특징을 기준으로 난 자의 성숙도를 확인하였다.'2 성숙 정도에 따라 DMEM (+10% hFF)이 들어있는 배 양접 시 (3037, Falcon, USA)로 각기 다르게 옮긴 다음 수정 시기 까지 COj 배양기에서 배양하였다.
- 결과에 대한 분석은 통계프로그램 인 Microsoft Excel-97을 이용하였다. 평균에 대한 유의성은 Student's 나est와 Chisquare (ftest)를 병용으로 실시하여 5% 유의수준 에서 검정하였다. 표준 오차율은 SEM으로 나타내었다.
대상 데이터
- 2 g/I의 NaHCCh (S-5761, Sigma, USA)를 첨가하여 제조하였다. 난자의 수정과 배양에는 DMEM (11966-025, Gibco, USA)을 사용하였고, vero cell의 준비에는 TCM-199 (11150-059, Gibco, USA)을 이용하였다. 모든 배 양액은 0.
- 이 중에서 한개는 새로운 flask에서 배양을 하고, 하나는 freezing medium (Cfell Culture Freezing Medium, 11101, Gibco, USA)으로 동결하고, 나머지 한 개는 배양 접시에 monolayer를 형 성 하도록 2 ml의 배 양액 에 200,000 cell의 농도로 조절하여 약 3일간 배양하였다. 배 양액 은 10% fetal bovine serum (FBS, 26140- 079, Gibcq USA)이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. Veto cdl의 동결과 융해도 Ouhibi 등"의 방법을 이용하였다.
- 배아를 이식할 때에는 Tomcat catheter (8890-793021, Sherwood, USA)< 이용하였으나, Tomcat catheter로 이식이 되지 않는 경우에는 Jansen-Anderson catheter (Jansen-Anderson Bulb Tip Embryo Transfer Catheter Set, K-JET-3200, G)ok, Australia) 를 이용하였다. 실험 1에서는 Day 2에서만 배아 (2-4세포기 배아, G1-G3)를 이식 하였고, 실험 2에 서는 Day 2에서 배아 (2V세포기 배아, G1-G3)를 이식 하고 나서 여 분의 배아는 Day 5까지 배 양한 다음 배반포가 확인된 배아 중에서 BG1만을 이 식하여 한 주기에서 이식을 2회 실시하였다.
- 본 연구에는 37주기의 체외수정시술을 시행한 환자를 대상으로 day 2에 이식한 것과 day 2와 day 5에 연속으로 이식한 군으로 나누었다. 첫 번 째는 난자채취 후 2일 (Day 2)에 14세포기의 배 아를 이식한 19주기를 대상으로 하였다. 두 번째는 난자채취 후 2일 (Day 2)에 2-4세포기의 배아 를 이식 하고 남은 여 분의 배 아를 5일 (Day 5)까지 배양하여 배반포기 단계에서 한번 더 배아를 이 식 한 18주기 를 대상으로 하였다.
데이터처리
- 각각의 실험 설계에 따라 수정율, 배아 발달율 및 임신율을 비교 • 조사하였다. 결과에 대한 분석은 통계프로그램 인 Microsoft Excel-97을 이용하였다. 평균에 대한 유의성은 Student's 나est와 Chisquare (ftest)를 병용으로 실시하여 5% 유의수준 에서 검정하였다.
이론/모형
- 배 양액 은 10% fetal bovine serum (FBS, 26140- 079, Gibcq USA)이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. Veto cdl의 동결과 융해도 Ouhibi 등"의 방법을 이용하였다.
- 난자를 채취하고 나서 수음 (masturbation)으로 specimen container (Baxter, USA)에 정 액 을 받았다. 정액을 실온에서 10~20분간 방치하여 액상화를 유도한 다음 정 자의 농도와 운동성 을 WHO의 기 준에 따라 측정하였다.'3 액상화된 정액은 15 m! comical tube 99, Falcon, USA)로 옮겨 Ham's F-10 (10% hFF)으로 1,500 ipm에서 2회 (5분, 3분) 원 심분리하여 세척하였다.
성능/효과
- 014) 높았다 (Figure 3). 다태 임신율은 SET에서 높게 나타나는 경향이 있었으나 통계적인 유 의차는 없었고 유산이 되는 경우도 양군에서 거의 차이가 없었다. 그러나 임신 결과를 확인한 다음의 자세한 기록이 남아 있지 않거나 차후의 자료가 추적되지 않는 환자가 다수 있어서 자료를 제시하지는 못하였다.
- 배 아이 식 후 매일 50 mg의 황체호르몬 (progesterone in oii, Progest, Samil, Korea)을 근육 주사하였다. 배아이식 후 10~12일째 혈중 |3-hCG의 농도가 10 mIU/ml 이상일때 임신의 성공으로 확인 하였다. 배아이식 3주 후에 질식초음파 검사에서 태낭 (gestational sac)이 관찰되는 경우를 임상적 임신으로 정의하고 임신 6~7주에 태아의 심 장박 동을 관찰하였다.
- 인간 난자를 장기 간 배 양할 때 배 양액으 로 DMEM을 이용하여 배반포기 배아의 형성이 좋았는데 특히 BG1의 출현율이 높게 나타났다. 배양액에 첨가하는 hFF의 농도는, 수정이 확인 되기 전까지의 난자에서는 10%로, 수정 란에서는 20%로 조절한 다음 배양하여 배아의 발달율과 차 후의 발생능력을 높일 수 있었다.
- 기로 양군간에 차이가 없었다. 사용한 난자의 수는 양군에서 각각 121개와 2*) 개로써, 평균 6.4±0.69개와 12.2±0.98개로 SET 에서 현저하게 (p<0.01) 많았다 (Table 1).
- 이상과 같은 연구 결과로 볼 때, 난자를 채취하고 나서 day 2에 배아이식을 한 후 여분의 배아를 배반포기까지 배 양한 다음 day 5에 연속적으로 이 식하여 임신율을 높일 수 있었다. 따라서 Day 5에 배반포기 배아 만을 이식 (blastocyst ET)하기 에 적 절하지 못할 것으로 예측되는 경우에 SET를 적용하면 비astocyst ET에서 나타날 수 있는 이식 자체 의 실패를 방지할 수 있으면서 임신율을 높일 수 있는 이식기법이 될 것이다.
- 본 연구에서 난자의 수정과 배아 발달에 사용한 배양액인 DMEM과 배 양액에 첨가한 난포액은 저자들이 이전에 실시한 실험결과를 바탕으로 하였다. 인간 난자를 장기 간 배 양할 때 배 양액으 로 DMEM을 이용하여 배반포기 배아의 형성이 좋았는데 특히 BG1의 출현율이 높게 나타났다. 배양액에 첨가하는 hFF의 농도는, 수정이 확인 되기 전까지의 난자에서는 10%로, 수정 란에서는 20%로 조절한 다음 배양하여 배아의 발달율과 차 후의 발생능력을 높일 수 있었다.
후속연구
- 따라서 Day 5에 배반포기 배아 만을 이식 (blastocyst ET)하기 에 적 절하지 못할 것으로 예측되는 경우에 SET를 적용하면 비astocyst ET에서 나타날 수 있는 이식 자체 의 실패를 방지할 수 있으면서 임신율을 높일 수 있는 이식기법이 될 것이다. 그러나 2회 연속으로 실시하는 배아이식 이 기 이식된 배아와 자궁내막 에 미칠 수 있는 영향에 대해서는 보다 자세한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 다태 임신율은 SET에서 높게 나타나는 경향이 있었으나 통계적인 유 의차는 없었고 유산이 되는 경우도 양군에서 거의 차이가 없었다. 그러나 임신 결과를 확인한 다음의 자세한 기록이 남아 있지 않거나 차후의 자료가 추적되지 않는 환자가 다수 있어서 자료를 제시하지는 못하였다.
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