Objective: A number of studies to improve in vitro culture conditions have been tried over past ten years by using co-culture system with helper somatic cells. However, the mechanism of coculture is poorly understood. This study was designed to understand the mechanism for the mode of actual action ...
Objective: A number of studies to improve in vitro culture conditions have been tried over past ten years by using co-culture system with helper somatic cells. However, the mechanism of coculture is poorly understood. This study was designed to understand the mechanism for the mode of actual action of co-culture using co-culture system of ICR strain's 1-cell embryos with human oviduct epithelial cells by examining the effect of conditioned medium and contactless coculture using a cell culture insert on the embryo development and by measuring the level of superoxide anion from conditioned medium after co-culture. Methods: ICR strain's zygote embryos were cultured in medium alone (control), coculture, conditioned medium, or contactless coculture system for 6 days. Conditioned media (CM) were prepared as following 5 groups. All CM were collected after culturing oviduct cells for 2 days. CM-1 was stored at $-20^{\circ}C$ until use, and CM-2 was prepared just before use as a culture medium. CM-3 was cocultured with embryos and retrieved just before use. CM-4 and CM-5 were derives from the microfilteration of CM-2 and CM-3, respectively, using Microcon-10 (10 kDa molecular weight cut-off). The percentage of the embryos developed to hatched blastocyst stage and the level of superoxide anion in supernatant from medium alone culture (control), coculture, and contactless coculture were measured. Results: The rates of embryo development to the hatched blastocyst stage were significantly higher in coculture (43%) than in control (0%) (p<0.05). The CM-1 group had no embryo development since 2-cell embryonic stage, whereas the CM-2, CM-3, CM-4 and CM-5 groups had the improved development to 4 or 8 cell embryo stage, but the similar rate of development to hatched blastocyst compared to control. The effect of coculture on embryo development was disappeared in the contactless coculture group. The level of superoxide anion was significantly reduced in coculture group compared to control. Conclusion: It is concluded that the present coculture system overcomes the 2-cell block in vitro and improves the embryo development. This beneficial effect may be due to the direct cell-cell contact between embryo and helper cells or the removal of deleterious components from medium rather than the embryotrophic factors.
Objective: A number of studies to improve in vitro culture conditions have been tried over past ten years by using co-culture system with helper somatic cells. However, the mechanism of coculture is poorly understood. This study was designed to understand the mechanism for the mode of actual action of co-culture using co-culture system of ICR strain's 1-cell embryos with human oviduct epithelial cells by examining the effect of conditioned medium and contactless coculture using a cell culture insert on the embryo development and by measuring the level of superoxide anion from conditioned medium after co-culture. Methods: ICR strain's zygote embryos were cultured in medium alone (control), coculture, conditioned medium, or contactless coculture system for 6 days. Conditioned media (CM) were prepared as following 5 groups. All CM were collected after culturing oviduct cells for 2 days. CM-1 was stored at $-20^{\circ}C$ until use, and CM-2 was prepared just before use as a culture medium. CM-3 was cocultured with embryos and retrieved just before use. CM-4 and CM-5 were derives from the microfilteration of CM-2 and CM-3, respectively, using Microcon-10 (10 kDa molecular weight cut-off). The percentage of the embryos developed to hatched blastocyst stage and the level of superoxide anion in supernatant from medium alone culture (control), coculture, and contactless coculture were measured. Results: The rates of embryo development to the hatched blastocyst stage were significantly higher in coculture (43%) than in control (0%) (p<0.05). The CM-1 group had no embryo development since 2-cell embryonic stage, whereas the CM-2, CM-3, CM-4 and CM-5 groups had the improved development to 4 or 8 cell embryo stage, but the similar rate of development to hatched blastocyst compared to control. The effect of coculture on embryo development was disappeared in the contactless coculture group. The level of superoxide anion was significantly reduced in coculture group compared to control. Conclusion: It is concluded that the present coculture system overcomes the 2-cell block in vitro and improves the embryo development. This beneficial effect may be due to the direct cell-cell contact between embryo and helper cells or the removal of deleterious components from medium rather than the embryotrophic factors.
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문제 정의
33꾀 공 배양과 비 접촉성 공배 양에서 superoxide anion치 가 변하지 않는 반면, 대조군에서는 계속적으로 증가한다는 본 연구 결과는 대조군이 superoxide anion의 생성을 증가시켜 보다 유해한 환경을 초래하는 반면 공배 양하의 체세포의 증식은 증가된 superoxide anion을 제거하여 배양조건을 향상시킬 수 있음을 시사하고 있다. 그러나 본 연구에서 비접촉 성공 배양은 superoxide anion 치가 증가되지 않았음에도 불구하고 공배양의 효과가 나타나지 않았는지에 대해서는 명확하지 않으며 이를 밝히기 위한 연구가 진행중이다. 아마도 배아의 유전자 활성 (embryonic genome activation)을 위해서는 superoxide anion 치의 감소와 함께 다른 요소가 필요한 것으로 사료되며, 그 중 하나로 배아와 세포 사이의 직접적인 접촉을 생각해 볼 수 있는데, 이는 세포 간의 접촉이 발달정지현상을 극복하는 신호전달체계를 가동시킴으로써 초기배아의 유전자를 활성화할 것으로 생각된다.
본 연구는 인간난관상피세포를 이용한 ICR 계통의 생쥐 1-세포기 배아의 공배양 체계를 통해 공배양의 작용기전을 알아보고자 했다. 먼저 공배 양이 발달정 지 현상 (
가설 설정
첫째, 공배양 동안 배아는 체세포에 의해 계속적으로 증가하는 성 장인 자와 cytokine들이 있는 환경에서 배양되지만 조건배양액은 이러한 역동적인 환경의 효과를 갖지 못한다.23 둘째, 조건배양액의 효과는 체세포의 극성 (polarity)에 따라 달라진다는 점이다." 셋째, Reiger 등은 조건배 양액에서 초기배 아 발달에 유해한 것으로 알려져 있는 glu8se의 농도가 공 배양했을 때 보다 상당히 높았음을 보여 주었다.
제안 방법
Lucigenine superoxide an- ion에 대해 높은 특이성을 가진 것으로 250 p.M 농도로 준비하였으며, Superoxide anion치는 Lumi- nometer (Lun血omat LB 96P)하에서 발광양을 20분간 측정 함으로써 결정 하였다.8
53 mM EDTA 용액 으로 분리시 킨 다음 4-well dish (Nunc, Roskide, Denmark)에 well당 IxlO’/ml 농도로 균주하고 5% CO2 배양기에서 2일간 배양하였다. 공배양 1시간 전에 신선한 HTF + 0.4% BSA로 교체하여 실험에 이 용하였으며, HTF + 0.4% BSA 배 양액에서 만 배양한 군을 대 조군으로 하였다.
공배양에 따른 배양조건 내 유해성분의 하나인 superoxide anion 치 의 변화가 배 발생 족진효과와 관계할 수 있다고 사료되어 대조군, 공배양, 비 접 족성 공배 양군의 조건배 양액 에서 suoeroxide anion치를 측정하였다. 공배양과 비접촉성 공 배양에서는 superoxide anion치의 변화가 없었으나 대조군에서는 시간이 지남에 따라 superoxide an- 血!치의 유의한 증가 양상을 나타냈다 (p<0.
공배양의 배 발생 촉진효과가 난관상피 세포에서 분비되는 배아영 양조절인자에 기인하는 지를 알아보기 위해 1-세포기 생쥐배아를 앞서 설명한 5종류의 조건배양액에서 6일 동안 배양하였다. 조건배 양액-1에서는 2-세포기 이후로 배발달이 일어나지 않았으며, 조건배양액 2, 3, 4, 5에서는 각각 4-8세포기 배아단계까지 발생률이 32%, 31%, 37%, 32%으로 대조군 (18%)보다 높았으나 포배형성율 및 부화율 3~7%로 대조군 (3%)과 유의한 차이가 없었다 (Table 2).
대조군, 공배 양군, 배 아와 난관상피세포의 접촉이 없는 비접촉성 공배양군에서 1-세포기 생쥐 배아를 48시간 동안 배양한 후 각 조건배양액에서 Lucigenin (Sigma, M-8010)을 이용하여 superoxide anion치를 즉정하였다. Lucigenine superoxide an- ion에 대해 높은 특이성을 가진 것으로 250 p.
25);">cell block)을 극복하고 포배아로의 정상적인 배발생을 하는지를 조사하였으며, 조건배양액과 배양삽입물 (cell culture insert) 을 이용하여 공배 양의 효과가 positive role 또는 negative role에 의한 것인지, 배아와 체세포간의접 촉에 의한 것 인지를 조사하였다. 마지 막으로 공 배양 후 조건배양액에서 superoxide anion치의 변화를 조사함으로써 배 양액내 superoxide anion 농도변화와 배발생과의 관계를 분석하였다.
작용기전을 알아보고자 했다. 먼저 공배 양이 발달정 지 현상 (cell block)을 극복하고 포배아로의 정상적인 배발생을 하는지를 조사하였으며, 조건배양액과 배양삽입물 (cell culture insert) 을 이용하여 공배 양의 효과가 positive role 또는 negative role에 의한 것인지, 배아와 체세포간의접 촉에 의한 것 인지를 조사하였다. 마지 막으로 공 배양 후 조건배양액에서 superoxide anion치의 변화를 조사함으로써 배 양액내 superoxide anion 농도변화와 배발생과의 관계를 분석하였다.
배 아와 난관상피 세 포사이의 접 촉이 배 아 발달에 끼치는 영향을 알아보기 위해 배양삽입물 (cell culture insert, transwell: Coming 3450)을 난관 상피 세포 단일층위에 놓은 다음 피 펫 끝이 구멍 크기 0.45 micron인 막에 닿지 않게 조심하여 1- 세포기 생쥐배아를 올려 놓았다. 이 배양 삽입물은 난관상피세포에서 분비되는 단백질이나 영양물질의 통과만 가능한 것으로 이러한 방법을 배아와 상피 세포의 접 촉이 없는 비 접 촉성 공 배양이라고 정의하였다.
조건배양액 (CM)은 2일 동안 난관상피세포 단독으로 배양했을 때와 배아와 공배양했을 때로 나누었다. CM-1은 2일간 난관상피세포만을 배양한 뒤 사용전까지 -20 ℃ 에 보관한 것이고, CM -2는 난관 상피세포만을 배양한 뒤 사용 직전에 준비하였고, CM-3는 배아와 공배양한 뒤 조건배양액을 사용하기 직전에 준비한 것이다.
대상 데이터
CM-1은 2일간 난관상피세포만을 배양한 뒤 사용전까지 -20 ℃ 에 보관한 것이고, CM -2는 난관 상피세포만을 배양한 뒤 사용 직전에 준비하였고, CM-3는 배아와 공배양한 뒤 조건배양액을 사용하기 직전에 준비한 것이다. CM-4, CM-5는각각 CM-2, CM-3를 microconcentrator (10 KDa cut-off)를 이용하여 농축시켜 얻은 것으로 농축된 조건배양액은 신선한 HTF + 0.4% BSA와 섞어 30 国 배양소적을 만들어 1-세포기 생쥐배아의 배발생에 이용하였다.
데이터처리
실험을 통하여 얻은 결과들의 유의성 검사를 위하여 Mann-Whitney U Test를 시 행하였으며 p 값이 0.05 이하일 때 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
1-세포기 생쥐배아를 단순배양액 (대조군)과 공배 양에서 6일 동안 배 양시킨 결과 2세포기 배아단계까지의 배발생률은 90% 이상으로 양군간에 유의 한 차이가 없었다. 그러나 4-8세포기, 포배기, 부화시 기까지의 배발생률은 20%, 3%, 0%이고 공배 양군은 72%, 63%, 43%로 공배 양군에서 유의 하게 높았다 (Table 1).
정상적인 배발생을 보였다. 4세포기, 포배기, 부화율은 각각 19%, 3%, 0%로 대조군 (20%, 2%, 0%)과 비슷하게 배발생이 정지되었던 반면, 공배양에 서 포배 형 성율과 부화율은 각각 60%와 40%로 나타나 비접촉성 공배양하에서 공 배양의 효과가 나타나지 않음을 알 수 있었다 (Table 3).
한 차이가 없었다. 그러나 4-8세포기, 포배기, 부화시 기까지의 배발생률은 20%, 3%, 0%이고 공배 양군은 72%, 63%, 43%로 공배 양군에서 유의 하게 높았다 (Table 1).
배아와 체세포간의 접촉이 공배양의 효과와 관계있는지 조사하기 위해 공배양조건하에 배양 삽입물 (cell culture insert)을 난관상피세포 단일층위에 설치한 비접촉성 공배양조건에서 1-세포기 배아를 6일 동안 배 양한 결과 2-세포기 배아 단계까지는 정상적인 배발생을 보였다. 4세포기, 포배기, 부화율은 각각 19%, 3%, 0%로 대조군 (20%, 2%, 0%)과 비슷하게 배발생이 정지되었던 반면, 공배양에 서 포배 형 성율과 부화율은 각각 60%와 40%로 나타나 비접촉성 공배양하에서 공 배양의 효과가 나타나지 않음을 알 수 있었다 (Table 3).
본 연구에서는 공배양의 배발생 촉진효과가 배아 영양 조절인자와 관계하는지를 조사하기 위해 5종의 다양한 조건배양액을 적용하였으나, 조건배양액은 준비 방법에 관계없이 공배양의 배 발생 촉진 효과를 유발하지 못했으며, 더욱이 배양 삽입물을 이용한 비접촉성 공배 양에서도 공배 양의 효과가 사라졌다. 이러한 결과들은 공배양의 효과가 배아영 양조절인자보다는 배아와 체세포 간의 직접적인 접촉에 기인하고 있음을 시사한다.
인간난관상피세포를 이용한 공배양조건이 생쥐 초기배아의 체외배양시 cellBock 극복과 배 발달을 향상시키는데 매우 효과적이며, 이러한 공배 양의 배발생 촉진효과는 배아영 양조절인자에 의해서 보다는 배양액내 유해물질의 제거와 배아와 보조세포사이의 직접적인 접촉에 기인하고 있음을 시 사한다.
배양하였다. 조건배 양액-1에서는 2-세포기 이후로 배발달이 일어나지 않았으며, 조건배양액 2, 3, 4, 5에서는 각각 4-8세포기 배아단계까지 발생률이 32%, 31%, 37%, 32%으로 대조군 (18%)보다 높았으나 포배형성율 및 부화율 3~7%로 대조군 (3%)과 유의한 차이가 없었다 (Table 2).
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