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제안 방법
- 3~4와 같다. 2차 column 분리물 중(M34-l~M34-4) M34-2, M34-3 및 M34-4 획분은 L. monocytogenes ATCC 19111 와 19114의 증식을 저해했으며 (Fig. 3), 이 중 수율이 우수한 M34-4 획분을 선정하여 3차 column chromatography에 사용하였다. 또한 3차 column 분리물에서는(M34-4-l~M34-4-4) M34-4-4 획분의 경우 두 균주 모두에 대해 항균 활성이 우수했으며(Fig.
- 이 중 항균 활성이 가장 좋은 M3 획분과 TLC에서 M3 획분과 거의 유사한 Rf값을 나타낸 M4 획분을 혼합한 M34 획분을 선정하여 항균 물질 분리에 사용하였다. M34 획분의 최소 저해 농도는 20~50 ppm 수준으로 5 종류의 유기산°그보다 항균 효과가 좋음을 확인하였으나 액체 배양법에서 혼탁도를 측정하는 방법은 균 의 증식 양상을 관찰할 수 있으나 정확한 항균 정도를 확인할 수 없어, 이를 보완하기 위해 생균수를 계수하면서 살균 효과를 관찰하였다
- 각 균주 배양액 0.1 mL를 정제된 물질이 일정 농도로 첨가된 액체 배지에 접종하여 3ITC에서 72시간 동안 배양하면서 24시간 간격으로 표준 평판 한천 배양법에 의해 생균수를 계수하고 같은 방법으로 균주 배양액 0.1 mL의 생균수를 계수하여 초기 접종 균수를 구했다. 처리구와 동일 농도로 에탄올만 가한 것을 대조구로 하였다.
- 1 mL를 실온에서 하룻밤 건조한 tryptic soy agar plate에 떨어뜨린 후 균일하게 도포하였다. 각 시험균이 접종된 plate 위에 예덕나무 에탄올 추출물 및 용매 분획 물을 흡수시킨 filter paper(disc diameter 6.0 mm, Whatman No. 2)를 놓고 30℃에서 24~48시간 배양 후 disc 주위에 나타난 증식 저해환 직경(mm)의 크기에 따라 항균 활성을 비교하였다.
- 75% 이하가 되게 하였다. 각 접종액을 미생물 생장 분석기(Bioscreen C)(28,29)의 각 well에 0.3 mL씩 분주한 다음 30℃, 600 nm 조건하에서 72시간 동안 2시간 간격으로 혼탁도를 측정하여 증식 저해 효과를 비교하였으며, 이때 첨가되는 에탄올 자체의 항균력을 배제하기 위하여 모든 시험은 처리농도와 동일하게 에탄올만을 첨가한 대조구를 설정하여 증식정도를 비교하였다.
- 또한 액체 배지에서 항균력 측정을 위해 모든 시료를 75% 에탄올에 용해시켜 항균활성 물질의 농도를 10% 혹은 1% 농도로 조정한 다음 membrane filter(0.2μm, Millipore Co., Bedford, USA)로 제균하였다. 제균된 시료를 멸균된 액체 배지에 10배씩 단계별로 희석하여 일정농도로 첨가한 다음 균주 배양액 0.
- 본 실험에서는 예덕나무 잎으로부터 75% 에탄올 추출물을 얻고 이를 각 용매로 분획 한 다음 column chromatography를 통하여 L. mcwocylogezies에 대한 항균 활성 물질을 분리하였다. 항균 활성이 확인된 순수 분리물질을 1H-NMR, DEPT-135 및 13C-NMR로 분석하여 항균 활성 물질의 구조를 구명하였다.
- 분쇄기로 마쇄한 예덕나무 잎(2900g)에 5배의 75% 에탄올을 혼합하여 환류냉각관이 부착된 플라스크에 넣고 80℃ 수욕상에서 3시간 추출 후 얻은 에탄올 추출물에 헥산을 가하여 헥산 분획물을 얻었으며, 동일방법으로 클로로포름 및 에틸아세테이트를 순차로 가하여 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물 분획물을 각각 얻었다. 각 분획물은 진공 농축기 (rotary vacuum evaporator)와 진공 건조기로 용매를 완전히 제거한 후 에탄올로 녹여 항균효과 실험에 사용하였다.
- 5×46cm)에서 step-wise 용출법으로(헥산 : 에틸아세테이트 =10:1 → 에틸아세테이트, v/v) 12개의 획분(M1~M12)을 분리하였다. 이 중 활성이 우수한 M34(0.50g) 획분을 벤젠 : 에틸아세테이트(7 : 1, v/v) 용매계로 silica gel column chromatography(2.7×16 cm)하여 소 획분(M34-4-l~34-4-4)을 얻었다. 이 중 활성이 우수한 M34-4-4 획분을 헥산 : 아세톤(10:0.
- 1 mL의 생균수를 계수하여 초기 접종 균수를 구했다. 처리구와 동일 농도로 에탄올만 가한 것을 대조구로 하였다.
- mcwocylogezies에 대한 항균 활성 물질을 분리하였다. 항균 활성이 확인된 순수 분리물질을 1H-NMR, DEPT-135 및 13C-NMR로 분석하여 항균 활성 물질의 구조를 구명하였다.
대상 데이터
- Duksan Pure Chemical사 제품으로 헥산(99.5% v/v), 벤젠 (99.5%, v/v), 클로로포름(99.5%, v/v), 아세톤(95.0%, v/v), 에틸아세테이트(99.5%, v/v) 및 메탄올(99.5, v/v)을 사용하였으며, 아세토니트릴(99.9%, v/v)은 Fisher Scientic사(USA) 제품을 사용하였다. 기타 실험 재료로는 Merck사(Germany) 제품인 Silica gel 60과 TLC plate(silica gel 60 F254)를 구입하여 사용하였다.
- 9%, v/v)은 Fisher Scientic사(USA) 제품을 사용하였다. 기타 실험 재료로는 Merck사(Germany) 제품인 Silica gel 60과 TLC plate(silica gel 60 F254)를 구입하여 사용하였다.
- 분석용 기기로는 Spectroline(ENF-260C, Spetronics Co.,USA), Bioscreen C(Labsystem, Oy, Helsinki, Finland), Collection fractor(Foxy JR., Isco. Inc., USA), EI/MS(JEOL JMS-AX505WA), 1H-NMR(400 MHz) 및 13C-NMRQ00 MHz)는 JEOL JNM-LA400을 사용하였다.
- 순수 분리된 물질의 구조동정을 위하여 1H-NMR(400MHz), DEPT-135 및 13C-NMR(100 MHz) (ZEOL JNM-LA400, Japan)을 사용하였다.
- 예덕나무 용매 분획물 중 헥산 분획물이 항균 효과가 우 수하여 분리 대상으로 선정하였으며, 또한 균주별 감수성에 큰 차이가 없기 때문에 2 균주만 선정하여(ATCC 19111, 19114) 시험 균주로 사용하였다.
- 예덕나무 주줄물의 항균활성 시험은 Listeria monocytogenes (ATCC 19111, ATCC 19112, ATCC 19113, ATCC 19114 및 ATCC 15313)를 대상으로 하였으며, 시험균주는 tryptic soy broth와 agar 배지 (Difco, USA)에 접종하여 30℃에서 배양하였다.
- 획분은 최소 저해 농도가 50 ppm이며, M3 획분은 20ppm으로 항균 활성이 우수하였다. 이 중 항균 활성이 가장 좋은 M3 획분과 TLC에서 M3 획분과 거의 유사한 Rf값을 나타낸 M4 획분을 혼합한 M34 획분을 선정하여 항균 물질 분리에 사용하였다. M34 획분의 최소 저해 농도는 20~50 ppm 수준으로 5 종류의 유기산°그보다 항균 효과가 좋음을 확인하였으나 액체 배양법에서 혼탁도를 측정하는 방법은 균 의 증식 양상을 관찰할 수 있으나 정확한 항균 정도를 확인할 수 없어, 이를 보완하기 위해 생균수를 계수하면서 살균 효과를 관찰하였다
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