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문제 정의
- 본 실험에서는 L. momcyMgses의 증식을 효율적으로 억제하고 인공 합성 보존제에 대한 소비자의 기피현상을 감안하여 안전성이 입증된 새로운 식품첨가물을 찾고자 하는 노력의 일환으로 77종의 식물을 채취 또는 구입하여 75% 에탄올로 추출하여 항균활성을 검색하였다. 이 중 감송향, 진득찰, 천황련, 침향 등은 1000 ppm 첨가 수준에서 L.
- . 본 실험에서는 L. mono-cytogenes 뿐만 아니라 그 외 6종의 식중독균(Vibrio para-haemolyticus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli 0157: H7, Salmo nella enteritidis에 대해서도 큰까치수영의 항균 spectrum을 관찰하였고, 큰까치수영이 광범위한 식중독 미생물에 대한 제어제임을 확인하였기에 보고한다.
제안 방법
- 식중독 미생물의 효과적인 제어를 위해 인공합성 보존제 보다 더 우수한 대체물을 천연 식물체에서 찾고, 이러한 물 질들을 효과적으로 이용할 수 있는 방안을 마련하기 위해 식용 혹은 한약재로 이용하는 식물 77 종을 수집하여 부위 별 로 75% 에탄올로 추출하여 그 추출물에 대한 항균활성을 실 험하였다. 실험한 결과 1,000 ppm 수준에서 Listeria monocytogenes 5 균주 모두에 대하여 증식억제효과를 보인 식물은 감송향, 사인, 진득찰, 천황련, 침향, 큰까치수영, 호프 등이 었다.
- 식물 에탄올 주줄물에 대한 항균활성을 L. monocytogenes 5 균주를 대상으로 검색하였고, 큰까치수영의 항균 스펙트럼을 확인하기 위해 식중독 미생물 6종을 대상으로 항균효과를 확인하였다. 이때 사용한 균주와 배지는 Table 2와 같다.
- 큰까치수영 에탄올 추출물을 농축하여 물층만 남긴 후 분별 깔때기를 이용하여 약 4배의 헥산을 가하여 헥산 분획물을 2회 반복하여 얻고, 동일한 방법으로 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차로 가하여 각각의 순차 용매 분획물을 얻었다. 각 분획물은 회전식 진공농축기(EYELA, Japan)와 진공건조기 (New Power Engineering Co.
- 얻었다. 각 분획물은 회전식 진공농축기(EYELA, Japan)와 진공건조기 (New Power Engineering Co., Korea)로 용매를 완전히 제거한 후, 고형분 함량을 구한 다음 원하는 농도만큼 에탄올로 녹여 0.2 ㎛, membrane filter로 제균하여 항균효과 실험에 사용하였다.
- 1 mL를 다시 10mL 액체배지에 접종하여 32℃에서 24시간 배양한 후 균체 배양액을 만들었다. 에탄올로 추출한 항균성 시료는 75% 에탄올로 완전히 용해시키거나 필요에 따라 희석한 후, membrane filter(0.2 ㎛)로 제균하여 액체배지 9.8 mL에 첨가량이 1000 ppm이 되게 항균활성이 확인된 각 추출물 시료를 첨가(0.1 mL)하였다. 이 배지에 균체 배양액 0.
- 1 mL)하였다. 이 배지에 균체 배양액 0.1 mL를 접종한 후 32℃에서 72시간 동안 배양하면서 12시간 간격으로 600nm에서 Bioscreen C (Labsystem, Hels inki, Finland)를 이용하여 optical density(O.D.)를 측정하여 증식억제 효과를 측정하였다. 이때 에탄올로 추출한 시료를 용해시키는데 사용한 에탄올량(0.
- )를 측정하여 증식억제 효과를 측정하였다. 이때 에탄올로 추출한 시료를 용해시키는데 사용한 에탄올량(0.075 mL) 만큼을 대조구에 첨가하여 에탄올 자체의 항균력이 감안 되도록 하였다.
- 큰까치수영 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차 분획하여 분획물을 얻었다. 이 순차 분획물 역시 같은 방법으로 L.
- 부탄올로 순차 분획하여 분획물을 얻었다. 이 순차 분획물 역시 같은 방법으로 L. AnowcNogess에 대한 각 순차 분획물별 최소증식저해농도(MIC)를 조사하였다. 또한 항균효과가 인정된 순차 용매 분획물의 V parahaemolyticiis외 5 종의 식중독 미생물에 대한 항균 스펙트럼도 역시 Bioscreen C를 이용하여 MIC를 조사하였다.
- AnowcNogess에 대한 각 순차 분획물별 최소증식저해농도(MIC)를 조사하였다. 또한 항균효과가 인정된 순차 용매 분획물의 V parahaemolyticiis외 5 종의 식중독 미생물에 대한 항균 스펙트럼도 역시 Bioscreen C를 이용하여 MIC를 조사하였다.
- 큰까치수영 에탄올 추출물의 항균활성을 알아보기 위해 에탄올 추출물을 각각 25, 50, 100, 500ppm을 액체배지에 첨가한 후 L. monocytogenes 5 균주를 접종하여 액체배양 하면서 Bioscreen C를 이용하여 O.D.를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다.
- 한약방에서 수집하였다. 생체로 수집한 식물은 수세한 후 부위별로 분류하여 4℃에서 건조, 분쇄한 후 75% 에탄올로 추출하여 얻은 추출물로 항균활성 실험을 하였다. 실험에 사용한 식물과 사용부위는 Table 1과 같다.
- 식용 혹은 한약재로 사용하는 77종의 식물로부터 얻은 에탄올 추출물을 tryptic soy broth에 1, 000 ppm씩 첨가하여 32℃에서 72시간 동안 배양하면서 균증식 억제 양상을 Bio screen C를 이용하여 관찰하였다.
대상 데이터
- 임상본초학(24) 과 약용식물도감(25)을 참고하여 선발된 미검색 한약재와 기존 실험결과 그 검색 결과가 확실치 않아 재검색이 필요한 77종의 식물과 한약재를 식품의약품안전청 옥천 약용식물재배시험장, 도로공사 전주수목원 및 전주 시내 소재 한약방에서 수집하였다. 생체로 수집한 식물은 수세한 후 부위별로 분류하여 4℃에서 건조, 분쇄한 후 75% 에탄올로 추출하여 얻은 추출물로 항균활성 실험을 하였다.
성능/효과
- 식중독 미생물의 효과적인 제어를 위해 인공합성 보존제 보다 더 우수한 대체물을 천연 식물체에서 찾고, 이러한 물 질들을 효과적으로 이용할 수 있는 방안을 마련하기 위해 식용 혹은 한약재로 이용하는 식물 77 종을 수집하여 부위 별 로 75% 에탄올로 추출하여 그 추출물에 대한 항균활성을 실 험하였다. 실험한 결과 1,000 ppm 수준에서 Listeria monocytogenes 5 균주 모두에 대하여 증식억제효과를 보인 식물은 감송향, 사인, 진득찰, 천황련, 침향, 큰까치수영, 호프 등이 었다. 큰까치수영 에탄올 추출물의 L.
- monocytogenes를 대상으로 50, 100, 500, 1, 000 ppm 농도로 tryptic soy broth에 첨가하여 항균효과를 측정한 결과는 Table 4와 같다. 이중 진득찰(SG: Siegesbeckia glabrescens Makino)은 에탄올 추출물을 500 ppm 첨가시 L. monocytogenes 5 균주 모두에 대하여 72시간까지 균증식을 억제하였고, 100 ppm 첨가 수준에서는 12시간까지 균증식 억제 현상을 보이다가 그 이후 균이 증식하는 것을 관찰할 수 있었다. 천황련(JD: Jeffersonia dubia Benth)의 경우 1,000 ppm 첨가시 L.
- monocytogenes 5 균주 모두에 대하여 72시간까지 균증식을 억제하였고, 100 ppm 첨가 수준에서는 12시간까지 균증식 억제 현상을 보이다가 그 이후 균이 증식하는 것을 관찰할 수 있었다. 천황련(JD: Jeffersonia dubia Benth)의 경우 1,000 ppm 첨가시 L. monocytogenes 5균주 모두 72시간까지 균증식이 완전억제 되었으나, 500 ppm 첨가 수준에서는 L. monocytogenes ATCC 19114에 대해서 12시간까지 균증식이 억제되는 것을 관찰할 수 있었고, 그외 4종의 L. 에 대해서는 항균효과가 없었다. 침향(AA: Aquilaria agallocha Roxburgh)의 경우는 L.
- 에 대해서는 항균효과가 없었다. 침향(AA: Aquilaria agallocha Roxburgh)의 경우는 L. mono cytogenes ATCC 19113 균에 대해서 1,000 ppm 첨가시 72시간까지 균증식을 완전히 억제하였고, L. monocytogenes ATCC 19111, ATCC 15313 균에 대해서는 1,000ppm 첨가시 48시간까지, L. monocytogenes ATCC 19112와 ATCC 19114 균에 대해서는 60시간까지 균증식을 억제하였다. 또한 침향 500 ppm 첨가수준에서는 L.
- monocytogenes ATCC 19112와 ATCC 19114 균에 대해서는 60시간까지 균증식을 억제하였다. 또한 침향 500 ppm 첨가수준에서는 L. monocytogenes ATCC 19111, ATCC 19113 및 ATCC 15313에 대해서 12시간까지 균증식 억제 현상을 관찰할 수 있었다.
- 감송향(NC: Nardostachys chinensis Batal)은 1,000 ppm 수준에서 L. monocytogenes 5 균주 모두에 대하여 72시간까지 균 증식을 억제하였고, 500 ppm 첨가시 L. monocytogenes ATCC 19111, ATCC 19113 및 ATCC 15313에 대해서 36시간까지 균증식 억제 현상을 관찰할 수 있었다.
- 이상의 결과에서 진득찰, 천황련, 침향, 감송향의 에탄올 주줄물은 500-1,000 ppm 첨가 수준에서 L. monocytogenes를 효과적으로 억제할 수 있었는데, 이는 보존제로 사용되고 있는 안식향산나트륨의 경우 pH 5.6에서는 l,500~3,000ppm 수준에서 L. monocytogenes를 정균 혹은 살균이 가능한 것으로 보고(26)되고 있고, 프로피온산나트륨은 1,500-11,000ppm(27), 솔빈산칼륨은 3,000 ppm(27)에서 증식억제 효과가 있다는 결과와 비교해 보면 이 4가지 식물 추출물의 항균효과가 기존보존제에 비하여 우수함을 알 수 있었다.
- 이들 결과에서 보면 5 균주 모두 큰까치수영 에탄올 추출물 500 ppm 첨가시 72시간 동안 균증식 이 완전히 억제되는 것을 볼 수 있으며, 100 ppm 첨가시 12시간까지는 균 증식이 억제되나 12시간 이후 균이 증식되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 에탄올 추출물 첨가시 균종에 따른 항균효과의 차이는 관찰할 수 없었다.
- 큰까치수영 헥산 분획물의 항균효과(Fig. 2)를 보면 L. monocytogenes ATCC 19112와 ATCC 19114에 대해서 50ppm 이상 첨가시 72시간까지 균증식이 완전 억제되는 것을 볼 수가 있었으며, L. monocytogenes ATCC 19113와 ATCC 15313에 대해서는 50ppm 첨가시 36시간까지 균증식이 억제되었으나 그 이후 균이 증식되는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 L.
- monocytogenes ATCC 15313에 대해서는 25 ppm 첨가 시 12시간까지 균증식이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. L. monocytogenes ATCC 19111에 대해서는 50ppm 첨가시 24시간까지 균증식이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다.
- 큰까치수영 클로로포름 분획물의 항균효과(Fig. 3)를 살펴보면 L. monocytogenes ATCC 19112에 대해서 50 ppm 이상 첨가시 72시간까지 균증식이 완전 억제되는 것을 볼 수가 있었으며, L. monocytogenes ATCC 19111, ATCC 19113, ATCC 19114 및 ATCC 15313에 대해서는 50ppm 첨가시 36시간까지 균증식이 억제되었으나 그 이후 균이 증식되는 것을 관찰할 수 있었고, 25 ppm 첨가시에도 L. monocytogenes ATCC 19112, ATCC 19113 및 ATCC 15313에 대해서 12시간까지 균증식이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 큰까치수영 헥산 분획물을 tryptic soy broth에 각각 25, 50, 100, 500 ppm 첨가하여 항균효과를 Bioscreen C를 이용해서 O.D.로 나타내었을 때 V. parahaemolyticus에 대해서는 실험 최저 농도인 25ppm에서도 72시간까지 완전 증식억제 효과를 나타내었으며, B. cereus에 대해서는 50ppm 이상 첨가시 72시간까지 완전 증식 억제효과를 나타내었다. s.
- s. aureus에 대해서는 500ppm 첨가시 72시간까지 완전 증식억제 효과를 나타내었으며, S. typhimurium와 S. eHteritidis의 경우 대조구에 비하여 균증식이 억제되었으나 농도별 균증식 억제 정도는 큰 차이가 없었다.
- 또한, E. coli의 경우 500 ppm 첨가시 12시간까지 증식한 균이 더 이상 증식하지 않고 72시간까지 그 수준을 유지하는 것으로 보아 큰까치수영 헥산 분획물은 E. coli에 대해서는 정균효과를 나타낸다고 볼 수 있었다.
- 이와 같은 결과는 황련 에탄올 추출물이 S. aureus에 대해서 MIC가 90ppm(29)이었고, 자초 에탄올 추출물은 1,000- 1,500 ppm의 농도로 S. aureus와 B. cereus를 저해한다는 결과(3)보다 큰까치수영의 항균효과가 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
- monocytogenes 5 균주 에 대한 최소증식저해농도는 100~500ppm이었다. 순차 용매 분획물의 항균활성은 헥산 분획물과 클로로포름 분획물의 최 소증식저해농도가 50~100ppm으로 같았으며 , 큰까치수영의 항균물질은 극성이 비교적 낮은 물질임을 알 수 있었다. 큰 까치수영의 식중독 미생물에 대한 항균 스펙트럼을 살펴보면 V.
- 순차 용매 분획물의 항균활성은 헥산 분획물과 클로로포름 분획물의 최 소증식저해농도가 50~100ppm으로 같았으며 , 큰까치수영의 항균물질은 극성이 비교적 낮은 물질임을 알 수 있었다. 큰 까치수영의 식중독 미생물에 대한 항균 스펙트럼을 살펴보면 V. parahaemolyticus에 대해서는 실험최저 농도인 25 ppm 에서도 72시간까지 완전 증식억제 효과를 나타내었으며, B. ceretus에 대해서는 50 ppm, S. aureus에 대해서는 500 ppm 첨가시 72시간까지 완전 증식 억제 효과를 나타내었고, S. typhimurium와 S. emertidis의 경우 대조구에 비하여 균증식이 억제되었으나 농도별 균증식 억제 정도는 큰 차이가 없었다. E.
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