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문제 정의
- 본 연구는 솔나리 조직배양을 통한 대량증식방법체계를 확립하기 위하여 솔나리 인편절편체 및 각 조직 절편체에서 캘러스, 인편, 식물체 분화에 영향을 미치는 배지와 식물생장조절물질 그리고 농도의 적정조건을 구명하고, 분화된 식물체의 토양활착율을 높이기 위해 실시 하였다.
제안 방법
- 2,4-D Img/ℓ 를 처 리 한 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지 및 식물생장조절제가 없는 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지에서 솔나리 bulb을 30일간 배양한 후 뿌리의 분화 및 생장을 조사하였다.
- 2,4-D Img/ℓ를 처 리 한 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지 및 식물생장조절제가 없는 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지를 각각 플라스크에 분주한 후 플라스크당 5개의 인편조각을 치상하였고 3반복으로 실시하였다. 솔나리 인편 조각을 30일간 배양후 결과를 조사하였다.
- 5. 7로 조절하였으며, agar를 0.8% 첨가하였다 각각의 배지는 10㎖씩 시험관에 분주하였다. 배지에 재 분화된 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 인편을 치상하여, 25°C, 16시간 광조건하에서 배양한 후 30일에 캘러스 형성율, 잎의 길이, 잎 수, 뿌리 수, 뿌리길이 , bulblet수 등을 조사하였다.
- 7로 조절하였으며, 각각의 배지는 50㎖씩 삼각 플라스크에 분주하였다. 위의 배지에 미리 준비한 재분화된 인편을 고체 배지에는 시험관 1개당 1조각씩 치상하였으며, 액체 배지에는 삼각플라스크 1개당 5개의 인편조각을 치상하여 배양한 후 30일 후 잎의 길이, 잎 수, 뿌리 수, 뿌리길이, bulb 수 등을 조사하였다.
- 고체 배지는 기본 MS 배지에 두 가지 종류의 polyamine인 spermidine과 spermine을 각각 1 mg/ℓ을 처리한 후 3%의 sucrose를 첨가 후 완전히 용해시 킨 후 pH를 5.7로 조절하였으며, agar를 0.8% 첨가하였다. 각각의 배지는 10㎖씩 시험관에 분주하였다.
- 기 본 MS배지 에 2, 4-D lmg/Z 를 첨 가한 후 sucrose 농도를 0, 15, 30, 60 g/ Z 씩 각각 첨 가하여 완전히 용해시킨 후 pH를 5.7로 조절하였으며, agar를 0.8% 첨가하였다. 각각의 배지는 10㎖씩 시험관에 분주하였다.
- 기본 MS 배지 와 MS salt strength를 1/2, 1/4의 농도로 감소시킨 1/2MS, 1/4MS 배지와 2, 4-D를 lmg/ℓ를 첨가한 MS, 1/2MS, 1/4MS의 배지에 각각 3%의 sucrose를 첨가 후 완전히 용해시킨 후 pH를 5.7로 조절하였다. 각각의 배지는 50㎖씩 삼각 플라스크에 분주하였고, 배지는 121℃。1.
- 8% 첨가하였다 각각의 배지는 10㎖씩 시험관에 분주하였다. 배지에 재 분화된 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 인편을 치상하여, 25°C, 16시간 광조건하에서 배양한 후 30일에 캘러스 형성율, 잎의 길이, 잎 수, 뿌리 수, 뿌리길이 , bulblet수 등을 조사하였다.
- 솔나리 인편 조각을 30일간 배양후 결과를 조사하였다.
- 솔나리 인편배양에서 얻어진 분화된 식물체의 잎뿌리 및 인편을 각각 25반복으로 50일간 기내배양 후 캘러스 형성 및 기관의 분화를 관찰하였다.
- 각각의 배지는 10㎖씩 시험관에 분주하였다. 액체 배지는 기본 MS 배지 및 salt strength를 1/2, 1/4의 농도로 감소시킨 1/2MS, 1/ 4MS 배지에 두 가지 종류의 polyamine인 spermidine 과 spermine을 각각 1 mg/ℓ 을 처리한 후 3%의 sucrose를 첨가 후 완전히 용해시킨 후 pH를 5.7로 조절하였으며, 각각의 배지는 50㎖씩 삼각 플라스크에 분주하였다. 위의 배지에 미리 준비한 재분화된 인편을 고체 배지에는 시험관 1개당 1조각씩 치상하였으며, 액체 배지에는 삼각플라스크 1개당 5개의 인편조각을 치상하여 배양한 후 30일 후 잎의 길이, 잎 수, 뿌리 수, 뿌리길이, bulb 수 등을 조사하였다.
- 7로 조절하였으며, 각각의 배지는 50㎖씩 삼각 플라스크에 분주하였다. 위의 배지에 미리 준비한 재분화된 인편을 고체 배지에는 시험관 1개당 1조각씩 치상하였으며, 액체 배지에는 삼각플라스크 1개당 5개의 인편조각을 치상하여 배양한 후 30일 후 잎의 길이, 잎 수, 뿌리 수, 뿌리길이, bulb 수 등을 조사하였다.
- 5기압 이상의 조건으로 15분간 고압멸균하여 사용하였다. 위의 배지에 재분화된 인편 5조각씩을 치상하여 25℃, 16시간 광조건하에서 배양하여 30일 후 캘러스 형성율과 잎의 길이, 잎 수, 뿌리 수, 뿌리길이, bulblet수 등을 조사하였다. 이 실험에서 각각의 배지는 10일 마다 30㎖씩 새로운 배지로 계대 배양하였고 이후의 시험에 있어 배지 멸균 및 배양조건은 현탁배양과 동일한 조건으로 실시하였다.
- 이식하였다. 이식한 후 25°C, 습도 80%, 24시간 광조건으로 주어진 생장상에서 2주간 순화과정을거친 후 습도를 다시 60%로 낮추어 2주간 순화과정을 거친 후 온실로 옮겼고 생존한 식물체를 조사하였으며, 각각 27반복으로 실시 하였다.
성능/효과
- 1. Bulb 유래 식물체 재분화는 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/4MS 액체 배지에서 잎과 뿌리분화 및 생장, bulb 분화가 양호하였다.
- 2,4-D lmg/ℓ 를 처리한 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지 및 식물생장조절제가 없는 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지에서 솔나리 인편 조각을 30일간 배양한 결과(Figure 2), 잎의 분화에 있어서 가장 양호한 분화를 보인 것은 식물생장조절제가 첨가되지 않은 1/4 MS 배지에서였다. 그러나, 잎의 신장에 있어서 2,4-D가 첨가되지 않은 MS 배지가 가장 양호하게 나타났다.
- 2,4-D lmg/ℓ를 처리한 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지 및 식물생장조절제가 없는 MS, 1/2 MS, 1/4 MS 액체 배지에서 솔나리 bulb을 30일간 배양한결과 (Figure 3), 뿌리의 분화 및 생장은 식물생장조절제가 첨가되지 않은 1/4MS 배지에서 가장 양호함을 나타내었다. bulb의 분화도 역시 같은 배지 상태에서 가장 양호함을 나타내었다.
- 그러나, 잎의 신장에 있어서 2,4-D가 첨가되지 않은 MS 배지가 가장 양호하게 나타났다. 2,4-D가 첨가된 배지에서 잎의 분화가 5개의 인편조각 중 한 개의 인편조각에서만 관찰되었으나, 그 생장은 미미하였다. 이는 고체 배지 상태에서 식물체 분화에 관한 결과와 일치하였다.
- 2. 캘러스 현탁배양의 경우 2,4-D lmg/ℓ 를 처리한 액체배지는 배발생 캘러스를 증가하였다. 식물생장조절제가 처리되지 않은 액체배지는 캘러스가 활성을 잃었고, 활성 감소는 salt strength가 감소함에 따라 급격히 감소하였다.
- 특히, vermiculite + perlite (1 : 1 by volume) 에서 96. 3%의 최 적 생존률을 나타냈다. 백합과 식물이 여 러 토양 순화 실험에서도 높은 생존률이 보고되어졌다(Antonio, 1997).
- 3. 솔나리 잎, 뿌리 , 인편 중 재분화 식물체 유도는 인편이 가장 적합하며, 인편을 치상하였을 때, 잎의 분화는 MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 첨가와 1.5%의 sucrose 첨가한 곳에서 가장 양호하였다. 잎의 생장은 MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 를 첨가와 3.
- 4. 고체배지에서 잎의 분화는 spermidine에 비해 spermine첨가가 효과적이었고, 잎의 신장은 spermidine처리가 보다 효과적이었다. 뿌리의 분화및 생장은 spermine처리에 의해 양호한 결과를 나타내었고, 인편의 분화는 spermidine첨가에서만이 나타났다.
- 5. 솔나리 인편배양을 통해 분화된 식물체의 토양순화 실험에서, 재분화된 식물체의 생존률은 vermiculite + perlite (1 : 1 by volume) 에서 96.3%를 나타내어 가장 양호한 결과를 얻었고, 순화된 식물체의 뿌리 생장은 peat moss에서 가장 양호하였다.
- 5%에서 가장 양호한 결과를 나타냈으며, 분화된 잎의 신장역시 같은 농도에서 가장 양호한 신장을 관찰할 수 있었다. MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 를 첨가했을 때잎의 분화는 sucrose 농도가 1.5%일 때 가장 양호함을 보였고, 잎의 신장은 sucrose 농도가 3.0% 일 때 가장 좋았다. 그러나 sucrose 농도가 6%를 일 때 잎의 분화나 잎의 신장이 억제 됨을 알수 있었다.
- 및 횐색으로 변하여 고사하였다. MS 배지에 2,4-D lmg/ℓ 에서 2개체 만이 캘러스가 형성 되었고, MS 배지 에 NAA 1㎎/ℓ 를 첨가하였을 때 3개체에서 캘러스형성과 1개체에서 잎과 뿌리가 분화되었으며, 뿌리는 여러개의 뿌리가 유도되는 것을관찰 할 수 있었다.
- Polyamine의 효과를 알아보기 위한 실험에서, polyamine처리는 액체배지보다는 고체배지에 첨가하는 것이 양호한 결과를 얻었다. 액체배양시 적정 polyamine농도를 구명을 위한 실험이 수행 되야 할것으로 사료되며, 다른 식물생장조절물질 및 다른 polyamine과의 조합처리를 통한 상승작용에 대한실험이 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
- 뿌리의 분화 및 생장, 인편의 분화는 MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 를 첨가와 6%의 sucrose 를 첨가한 배지가 가장 양호하였다. Sucrose 6%를 처리한 배지에서 분화된 인편은 상당히 크고 짙은 녹색을 띄고 있었으며, 2,4-D lmg/ℓ 를 첨가한 배지에서 자구형성이 많았고, 또한 sucrose 6%를 처리 한 곳에서 상당히 많은 수로 root가 분화되는 것을 관찰 할 수 있었다.
- Sucrose 농도에 따른 식물체 재분화 실험에서 sucrose 농도가 3% 일 때 식물체 재분화가 가장 양호하게 일어났으며, sucrose 농도가 6%일 때 bulb 의 크기 및 분화정도가 양호함을 나타내었다. 이 결과는 sucrose 농도에 따른 이전의 실험결과와 같았다 (Bergonon, 1992).
- 그러나 잎의 분화는 spermine 첨가가 효과적이었고, 잎의 성장은 spermidine처리가 보다 효과적으로 나타났다. 뿌리의 분화 및 생장은 spermine처리에 의해 양호한 결과를 나타내었고, 인편의 분화는 spermidine첨가에서만이 나타났다.
- 기본 MS salt에 NAA lmg/ Z 와 1.5% sucrose를 첨가하였을 때 2개체에서 캘러스가 형성되었고, 이두 개체 모두 뿌리의 분화가 나타났다. 뿌리에 대한 동일한 실험에서, 거의 모든 처리에서 캘러스가 형성되었다.
- 본 실험에서는 솔나리 인편을 현탁배양할 때 식물생장조절제가 첨가되지 않은 배지에서 줄기 분화, 뿌리분화, bulb 형성 및 생장이 효과적이었다. 뿐만 아니라 MS salt를 감소시킴으로서 재분화된 bulb 수가 매우 증가함을 알 수 있었고 bulb 형성에는 현탁배양이 보다 효과적이라는 결과를 얻을 수 있었다.
- 이는 고체 배지 상태에서 식물체 분화에 관한 결과와 일치하였다. 분화된 잎의 수도 식물생장조절제가 첨가되지 않은 1/4 MS배지에서 가장 양호한 것으로 관찰되었다.
- 9%로 가장 낮았다. 뿌리 성장 및 토양 활착률은 peat moss, vermiculite, vermiculite + perlite (5 : 5 by volume), 상토, perlite 순으로 양호함을 나타냈다. 순화시 초기에는 지상부가 고사하는 것이 관찰되 었지만, 이 후에는 재분화된 식물체가 고사됨이 없이 계속적으로 성장하였다.
- 뿌리의 분화 및 생장, 인편의 분화는 MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 를 첨가와 6%의 sucrose 를 첨가한 배지가 가장 양호하였다. Sucrose 6%를 처리한 배지에서 분화된 인편은 상당히 크고 짙은 녹색을 띄고 있었으며, 2,4-D lmg/ℓ 를 첨가한 배지에서 자구형성이 많았고, 또한 sucrose 6%를 처리 한 곳에서 상당히 많은 수로 root가 분화되는 것을 관찰 할 수 있었다.
- 0%의 sucrose를 처리한 곳에서 관찰되었다. 뿌리의 분화 및 생장, 인편의 분화는 MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 를 첨가와 6%의 sucrose를 첨가한 배지에서 가장 양호함을 나타내었다.
- 그러나 잎의 분화는 spermine 첨가가 효과적이었고, 잎의 성장은 spermidine처리가 보다 효과적으로 나타났다. 뿌리의 분화 및 생장은 spermine처리에 의해 양호한 결과를 나타내었고, 인편의 분화는 spermidine첨가에서만이 나타났다.
- 그러나 잎의 분화는 spermine 첨가가 효과적이었고, 잎의 성장은 spermidine처리가 보다 효과적으로 나타났다. 뿌리의 분화 및 생장은 spermine처리에 의해 양호한 결과를 나타내었고, 인편의 분화는 spermidine첨가에서만이 나타났다.
- 효과적이었다. 뿐만 아니라 MS salt를 감소시킴으로서 재분화된 bulb 수가 매우 증가함을 알 수 있었고 bulb 형성에는 현탁배양이 보다 효과적이라는 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과는 Bergonon (1992), Shinsaku (1995), Sundeep (1992) 등의 결과와 같았고, 액체배지에서 bulb 하부에서 shoot가 분화되는 것을 관찰하였는데, bulb 하부는 높은 재분화능을 지니고있다는 기존의 연구 발표와 일치함을 보였다(이 등, 1995).
- 이는 2,4- D 1㎎/ℓ 를 처리한 액체배지에서 나타나는 것과 유사함을 나타내었다. 솔나리 인편배양에서 polyamine의 처리는 액체 배지 보다 고체배지 에서 효과가 더욱 양호한 결과를 얻을 수 있었다. 분화는 인편의 기부에서부터 분화되기 시작하였다.
- 솔나리 인편배양에서 얻어진 분화된 식물체의잎, 뿌리 및 인편을 50일간 기내배양한 결과 뿌리와 잎에서는 캘러스 형성 및 기관의 분화가 관찰되지 않았다. 뿌리는 아무런 변화 없이 치상할 때의 상태와 다름이 없었고, 잎은 25반복 중 단 1개체에서 캘러스 형성이 되었을 뿐 나머지 잎은 모두 희거나 검게 변하여 고사하였다.
- 이 결과는 이전의 보고에서 가장 양호함을 나타낸 1/2 MS 배지보다 더낮은 상태의 salt strength에서 나타났다. 식물생장조절제를 처리한 배지는 인편에서 배발생 캘러스가 발생하는 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 캘러스는 인편 상부와 하부에서 발생하였고, 캘러스 성장에 따라 인편에서 분리되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 인편조직을 이용한 sucrose 및 식물생장조절물질에 대한 실험결과(Table 1.), 잎의 분화는 2, 4-D lmg/ℓ 를 첨 가했을 때 sucrose 농도가 1.5%에서 가장 양호한 결과를 나타냈으며, 분화된 잎의 신장역시 같은 농도에서 가장 양호한 신장을 관찰할 수 있었다. MS 기본 배지에 NAA lmg/ℓ 를 첨가했을 때잎의 분화는 sucrose 농도가 1.
- 재분화된 식물체의 토양순화 결과 (Table 3), 가장 양호한 순화 토양은 vermiculite + perlite (1 : 1 by volume) 였으며, 그 생존률은 96.3%를 보였다. 반면 가장 순화가 되어지지 않는 토양으로는 perlite였으며, 생존률은 51.
- 재분화된 인편조직을 이용한 polyamine 효과에 따른 실험결과(Figure 1), 캘러스 형성은 spermidine , 1㎎/ℓ 처리에서만 25%의 캘러스 형성율을 보였으나, spermine을 처리한 경우 캘러스 가 형성되지 않았다. 그러나 잎의 분화는 spermine 첨가가 효과적이었고, 잎의 성장은 spermidine처리가 보다 효과적으로 나타났다.
- 캘러스 현탁배양을 수행한 결과 2,4-D lmg/ℓ 를 처리한 액체배지에서는 배발생 캘러스가 증가하는것을 알 수 있었고, 식물생장조절제가 처리되지 않은 액체배지에서는 캘러스 증식 없이 상당량의 캘러스가 활성을 잃었고, 활성 감소는 salt strength가 감소함에 따라 급격히 감소하였다. 그리고, 식물생장조절제가 처리되지 않는 액체배지에서, 몇 몇 캘러스 덩어리에서 잎의 분화가 관찰되었다.
후속연구
- 백합과 식물이 여 러 토양 순화 실험에서도 높은 생존률이 보고되어졌다(Antonio, 1997). 그러 나 생존률을 향상시키 기 위해 최적의 토양 및 환경 요인에 대한 보다 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 것이 양호한 결과를 얻었다. 액체배양시 적정 polyamine농도를 구명을 위한 실험이 수행 되야 할것으로 사료되며, 다른 식물생장조절물질 및 다른 polyamine과의 조합처리를 통한 상승작용에 대한실험이 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
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