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문제 정의
- 본 연구에서는 방사선에 민감한 소장 상피 세포들에서 방사선 조사에 의한 세포고사와 유사분열사의 발생 정도를 알아보고자, 방사선조사 후 흰쥐 소장의 음와 세포에서 세포 고사의 발생 정도를 조사하였고 유사분열 중인 세포 수의 감소를 측정하여서 간접적으로 유사분열사의 발생 정도도 조사하였다. 그리고 세포고사의 정도를 헤마톡실린 에오진 염색 소견과 in situ end labeling (ISEL) 법으로 비교하였다.
제안 방법
- 7] 순으로 감소된다.") 또한 G2, M 기의 세포들이 많이 존재하는 오전 6~9시경에 방사선에 의한 세포고사의 빈도가 가장 높았다고 보고되고 있어서, 7) 본 연구에서도 이러한 일 중 변동을 고려하여 오전 8~9시 사이에 방사선조사를 하였다.
- Equilibration buffer에 10~15초간 처치한 후 남아있는 buffer를 제거하고, TdT 효소와 digoxigenin-11-dUTP 및 dATP 혼합 용액에 371 에서 1시간 30분 처리하고 stop/wash buffer에 10분간 방치하였다. Peroxidase/} 부착된 항 digoxigenin 항체를 37C 에서 1 시간 작용시키고 PBS로 세척하였으며, 부착된 peroxidase는 diaminobenzidine (DAB)으로 발색하였고 대조 염색은 헤마톡실린으로 실시하였다. 양^ 대조군은 이유기의 암컷 쥐의 유선(mammary 이and) 절편을 사'§하였고 음성 대조군은 TdT 대신 PBS를 작용시킨 표본을 사용하였다
- 세포고사의 형태학적인 특징은 Kerr 등과 Wyllie 등"이 기술한 것을 이용하였다. 각 실험군마다 음와당 세포고사의 평균값을 구하였고 유 사분 열사를 간접적으로 알아보기 위하여 음와당 유사분열 세포 수의 평균값을 구하였다(fIg. 1).
- 희생된 흰쥐의 회맹관으로부터 약 15 cm 정도에 위치한 소장의 조직을 절단하여 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 고정된 조직을 5 “m의 두께로 잘라서 헤마톡실린 에오진 염색을 시행하고, 광학현미경으로 관찰하였다.
- A) 용액에 실온에서 15분간 처치하고 증류수로 수세하였다. 그 후 내재성 peroxidase 반응을 억제하기 위하여 3% 과산화수소 (H2O2)에 5분간 처치하고 PBS로 수세하였다. Equilibration buffer에 10~15초간 처치한 후 남아있는 buffer를 제거하고, TdT 효소와 digoxigenin-11-dUTP 및 dATP 혼합 용액에 371 에서 1시간 30분 처리하고 stop/wash buffer에 10분간 방치하였다.
- 그리고 세포고사의 정도를 헤마톡실린 에오진 염색 소견과 in situ end labeling (ISEL) 법으로 비교하였다.
- 따라 증가되어 약 1 Gy에서 포화된다고 한다. 본 연구에서도 방사선량을 결정하기 위한 예비 실험으로 2 Gy와 4 Gy로 나누어서 세포고사의 발생 정도를 비교하였지만, 양 군 간에 유의한 차이가 없어서 2 Gy로 실험을 하였다.
- ISEL법은 세포괴사의 초기 변화와 유사분열 중인 세포의 핵에서 발생되는 DNA 3'-OH 말단과 반응하여 위양^이 발생될 수 있고일부 세포들에서는 형태학적으로는 세포고사의 기준에 속하지만 ISEL 염색이 되지않이. 서 위음성이 발생될 수도 있다고 보고되고 있으므로”) 본 연구에서는 광학 현미경을 이용한 형태학적인 확인으로 세포 고사를 검사하였다. 참고 자료로 확인하였던 ISEL법은발색의 시간적인 조건에 따라 위양성이 다소 발생되었으므로 세포고사의 검출에는 헤마톡실린 에오진 염색이 보다 간단하고 해석하기도 용이한 것으로 생각된다.
- 세로로 절단된 음와의 한쪽 면에 위치한 세포의 줄을 '음와로 정의하였고, ° 내강이 있고 기저부에 Paneth 세포가 있으며 최소한 17개의 세포가 존재하는 음와를 선택하여75 마리당 30개씩 관찰하였다. 세포고사의 형태학적인 특징은 Kerr 등과 Wyllie 등"이 기술한 것을 이용하였다.
- 총 2 Gy의 전신 방사선조사를 하였다. 소장 음와의 세포주기의 일중 변동(cinMian rtiythm)을 고려하여 방사선 조사를 오전 8~9시 사이에 시행하였다.
- Peroxidase/} 부착된 항 digoxigenin 항체를 37C 에서 1 시간 작용시키고 PBS로 세척하였으며, 부착된 peroxidase는 diaminobenzidine (DAB)으로 발색하였고 대조 염색은 헤마톡실린으로 실시하였다. 양^ 대조군은 이유기의 암컷 쥐의 유선(mammary 이and) 절편을 사'§하였고 음성 대조군은 TdT 대신 PBS를 작용시킨 표본을 사용하였다
- 염색 헤마톡실린 에오진 염색에서 세포고사가 가장 많이 관찰되었던 시간대의 조직을 대상으로 ISEL 염색을 하였다. ISEL 법은 세포고사 시에 발생되는 DNA 분절의 노출된 3, 말단에 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 를 이용하여 표지된 nucleotide를 반응시키는 것으로 조직 구조를 유지한 상태에서 세포고사 염색을 실시하였다.
- 정상 대조군과 방사선조사 후 2, 4, 8, 24, 48시간대의 실험군마다 4마리씩의 흰쥐를 에테르 마취 후 희생하였다. 희생된 흰쥐의 회맹관으로부터 약 15 cm 정도에 위치한 소장의 조직을 절단하여 10% 중성 포르말린에 고정하였다.
- 한 변의 길이가 30 cm이고 높이가 7 cm이며 호흡이 가능하도록 옆면에 구멍이 많이 있는 직육면체 용기에 마취하지 않은 흰쥐를 10마리씩 넣고 뚜껑을 덮어서 흰쥐들을 한 층으로 분포시킨 다음, 용기의 상, 하에 조직 등가물질을 3cm씩 대고, 6 MV 선형가속기(CL2100 QD, Varian, USA)를이용하여 분당 500 cGy의 선량률로 용기의 위 아래 방향에서 총 2 Gy의 전신 방사선조사를 하였다. 소장 음와의 세포주기의 일중 변동(cinMian rtiythm)을 고려하여 방사선 조사를 오전 8~9시 사이에 시행하였다.
대상 데이터
- ISEL 법은 세포고사 시에 발생되는 DNA 분절의 노출된 3, 말단에 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 를 이용하여 표지된 nucleotide를 반응시키는 것으로 조직 구조를 유지한 상태에서 세포고사 염색을 실시하였다. 염색은 ApoTag (r) Plus in Situ Apoptosis Detection Kit (Oncor, Gaithersburg, MD, U.S.A)를 이용하였다. 파라핀 포매된 조직을 5 zzm 두께로 절단하여 Probe-On PLUS 슬라이드에 부착시켜 건조 시킨 후 염색에 사용하였다.
- 체중 200 ~250 g의 웅성 Sprague-Dawley 흰쥐를 대상으로 실험하였다. 실험 기간 중에는 5마리씩 사육장에 넣어서 사육하였다.
- 희생된 흰쥐의 회맹관으로부터 약 15 cm 정도에 위치한 소장의 조직을 절단하여 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 고정된 조직을 5 “m의 두께로 잘라서 헤마톡실린 에오진 염색을 시행하고, 광학현미경으로 관찰하였다.
이론/모형
- 30개씩 관찰하였다. 세포고사의 형태학적인 특징은 Kerr 등과 Wyllie 등"이 기술한 것을 이용하였다. 각 실험군마다 음와당 세포고사의 평균값을 구하였고 유 사분 열사를 간접적으로 알아보기 위하여 음와당 유사분열 세포 수의 평균값을 구하였다(fIg.
성능/효과
- 그리고 세포 고사의 발생이 방사선조사 후 4시간경에 최고값으로 증가되었다가 24시간 경에 정상값 가까이로 감소되었고 유사분열 세포의 수가 8시간 경에 최저치로 감소되었다가 48시간에 정상치 비슷하게 회복되었으므로 2 Gy 방사선조사에 의한 급성 손상으로 소장 음와의 상피 세포에서 발생되는 세포의 사망은 대개 24~48시간 내에 정상으로 회복되며, 발생 시기와 정도를 고려하여 볼 때, 세포고사가 유사분열사보다 신속하고 많이 발생되는 주된 기전으로 생각된다.
- 이상의 결과들에서 세포고사가 주로 음와 기저부 주위에서발생되었으므로, 분화된 융모 세포보다는 미분화된 음와 세포가 방사선에 의한 세포고사에 민감함을 알 수 있었다. 그리고 세포 고사의 발생이 방사선조사 후 4시간경에 최고값으로 증가되었다가 24시간 경에 정상값 가까이로 감소되었고 유사분열 세포의 수가 8시간 경에 최저치로 감소되었다가 48시간에 정상치 비슷하게 회복되었으므로 2 Gy 방사선조사에 의한 급성 손상으로 소장 음와의 상피 세포에서 발생되는 세포의 사망은 대개 24~48시간 내에 정상으로 회복되며, 발생 시기와 정도를 고려하여 볼 때, 세포고사가 유사분열사보다 신속하고 많이 발생되는 주된 기전으로 생각된다.
- 정상 대조군에서 음와당 평균 L29개의 유사분열 세포가 관찰되었으나, 방사선조사 후 2, 4, 8, 24, 48시간 후에는 각각 0.56, 0.47, 0.23, 0.65, 1.19로, 방사선조사 후 8시간까지 감소되었다가 48시간 경에 정상값으로 회복되는 양상이었다. 따라서 유사분열사는 방사선조사 후 8시간까지 증가되었고, 그 후로 감소되어서 48시간 경에 정상화되는 것으로 생각된다ig.
- 서 위음성이 발생될 수도 있다고 보고되고 있으므로”) 본 연구에서는 광학 현미경을 이용한 형태학적인 확인으로 세포 고사를 검사하였다. 참고 자료로 확인하였던 ISEL법은발색의 시간적인 조건에 따라 위양성이 다소 발생되었으므로 세포고사의 검출에는 헤마톡실린 에오진 염색이 보다 간단하고 해석하기도 용이한 것으로 생각된다.
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