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문제 정의
- 있음을 보고 한 바 있다 [12]. 이번 연구에서는 석창포 정유의 항산화활성을 in vitro에서 검토하고 또한 정유향기액의 흡입이 뇌중과산화지질의 생성을 억제하는지를 확인하기 위하여 경련을 유발시킨 실험동물 모델을 이용하여 in vitro에서 항산화활성을 조사하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- In vivo test에서는 석창포 정유액 5 g을 petri dish에 넣고 최소한의 공기만 통하는 특수 cage를 이용하여 7일간 실험동물에 흡입시켰으며 마지막 흡입 1시간 후 pentyl-enetetrazole 70 ㎎/㎏을 0.1 ml 피하주사하고 30분후에 처치한 다음, 뇌를 적출하여 뇌중과 산화지질의 양을 위와 같은 방법으로 측정하였다.
- 따라서 지질과산화 반응의 억제는 생약의 항산화 활성 검증에서 가장 중요한 지표로 이용되고 있다. 과산화지질 생성 실험조건의 시험 관내에 뇌 조직 마쇄액과 석창포 정유의 용량을 달리하면서 첨가시켜 과산화지질의 생성정도를 관찰하였다. 그 결과, 용량이 증가할수록 과산화지질의 생성이 크게 억제되는 용량의존적 경향을 보여주었다 (Fig.
- 4 ml를 첨가해 37℃ 에서 20분간 반응시킨 다음, 20% trichloroacetic acid를 가해 반응을 종료시켰다. 반응 종료 후, 생성된 6-pyridone을 파장 300 nm에서홉광도의 변화를 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다. 효소 활성도는 1분당 1 mg의 단백질이 생성시킨 6-pyridone 의 양을 nmole로 나타내었다.
- 않는다는 점에서 xanthine oxidase와 구별된다. 생체 내의 조효소로서 다양한 생화학적 산화반응에 관여하며 여러 종류의 생리기능을 조절, 보폰하여 항상성유지에 중요한 역할을 하는 NAD의 대사산물인 N-methylmcotinic 디cid amide를 기질로 하고 횐쥐의 뇌 cytosol분획을 효소원으로 드하는 반응액 중에 석창포의 정유분획을 용량별로 첨가하고Laldehyde oxidase의 활성변화를 관찰하였다. 그 결과, Fig.
- 석창포 정유액을 흡입시킨 실험동물에서 인위적으로 유발된 지질과산화가 어느 정도 억제되는지를 관찰하였다. Fig.
- 2 ml를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 20% trichloroacetic acid 를 가하여 단백질을 제거시키고 원심분리하였다. 이때 생성된 uric acid를 파장 292 nm에서 홉 광도의 변화를 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다.
- 한방에서 경련 억제의 목적으로 처방되고 있는 석창포의 정유액을 분리하여 활성산소종생성계 효소인 xanthine oxidase와 aldehyde oxidase에 대한 억제 활성을 in vitro에서측정하고 지질과 산화 억제 효과를 in vitro와 in vivo에서 각가 조사하였으며 DFI가! radical 소거효과를 검토하억 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 사용하였으며 건조된 약재를 분말로 하여 사용하였다.Malondialdehyde, sodium dodecylsulfate, N-methylnicotinic acid amide, 2-thiobarbituric acid, xanthine mono sodium salt, DPPH (l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)등은 Sigma사 (St.Louis, USA) 제품을 사용하였으며 기타 시약은 국산 특급을 사용하였다. 실험동물은 한국실험동물 개발로 부터 구입한 외관상 건강한 ICR계 웅성 mouse (30±1 g)를 본 대학 동물사육실에서 일정한 조건으로 사육하여 실험에 사용하였다.
- 석창포는 동국대학교 강남 한방병원에서 처방하고 있는 약재를 사용하였으며 건조된 약재를 분말로 하여 사용하였다.Malondialdehyde, sodium dodecylsulfate, N-methylnicotinic acid amide, 2-thiobarbituric acid, xanthine mono sodium salt, DPPH (l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)등은 Sigma사 (St.
- Louis, USA) 제품을 사용하였으며 기타 시약은 국산 특급을 사용하였다. 실험동물은 한국실험동물 개발로 부터 구입한 외관상 건강한 ICR계 웅성 mouse (30±1 g)를 본 대학 동물사육실에서 일정한 조건으로 사육하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 효소원 중의 단백질은 Bradford법으로 정량하 있으며 모든 실험 결과는 mean±S.E로 표시하였고 통계적 유의성eStudent's Rest로 검정하였다.
이론/모형
- Aldehyde oxidase (EC 1.2.3.1) 활성 측정은 Rajagopalan 등의 방법[14] 에 의헤 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 일 정량에 기질인 N-methylnicotinic acid amide 1.5 mM과 효소원 0.4 ml를 첨가해 37℃ 에서 20분간 반응시킨 다음, 20% trichloroacetic acid를 가해 반응을 종료시켰다. 반응 종료 후, 생성된 6-pyridone을 파장 300 nm에서홉광도의 변화를 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다.
- DPPH (1,1 diphenyl 2pinylhydTazyl) redical 함량 측정은 Blosi 의 방법[2] 에 따라 각 농도별 시료 0.1 ml에 DPPH radical의 1.5x10uM 버:hanol용액 4 ml를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 다음, 520 nm에서 홉 광도를 측정하여 산출하였다. DPPH radical의 소거 활성은 다음 식으로 산정하였다.
- In vitro에서의 과산화지질 함량 측정은 (가ikawa 등의 방법[11]에 준해 뇌조직 마쇄균 질액 0.1 ml에 8.1% sodiumdodesyl sulfate, 20% acetate buffer (pH 3.5) 및 0.8% 2-thiobarbituric acid용액을 가헤95 ℃ 에서 1시간 동안 반응시키고 실온으로 냉각한 다음 생성된 홍색의 착색물질을n-butanol : pyridine (15 : 1, v/v) 흔액으로 이행시켜 파장 532 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 정량하였다. 과산화지질의 함량은 조직 1 g당 malondialdehyde의 양을 nmole로 니타내었다.
- Xanthine oxidase (type O) (EC 1.2.3.2) 활성 측정은 Stirpe 등의 방법[15]에 춘해 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 일정량에 기질인 xanthine (mono sodium salt) 60 uM 및 효소원 0.2 ml를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 20% trichloroacetic acid 를 가하여 단백질을 제거시키고 원심분리하였다. 이때 생성된 uric acid를 파장 292 nm에서 홉 광도의 변화를 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다.
성능/효과
- 관찰하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 생리식엽 수만을 투여한 대조군에서는 과산화지질의 양이 조칙 1응당 19.7 MDA nmoles 이었으며 pentylenetetrazole (PTZ) 투여군에서는 25.8 MDAnmoles로 나타나 인위적인 경련유발 시 뇌 중 과산화지칠이 23.6%정도 증가됨을 알 수 있었다. 그러나 향기액을 7일간 홉 입시켰을 때는 뇌조직 중의 과산화지질이 21.
- Xanthine oxidase는 free radical 생성효소의 일종으로 radical 생성과정에서 xanthine dehydrogenase로부터 형 전환되어 생화학적 반응을 촉매하는 중요한 역할을 하고 있다, 횐쥐 뇌 조직의 cytosol을 효소원으로 하고 xanthine을 기질로 하는 xanthine oxidase 활성을 측정하는 반응액 내에 석창포 정유분획을 농도를 달리하면서 첨가시킨 다음, 효소활성을 측정한 결과, 0.01 m응/ml의 농도에서 대조군에 비해 13.3% 정도 효소 활성을 억제시키는 것으로 나타났다 (Fig. 1). 그리고 0.
- 생체 내의 조효소로서 다양한 생화학적 산화반응에 관여하며 여러 종류의 생리기능을 조절, 보폰하여 항상성유지에 중요한 역할을 하는 NAD의 대사산물인 N-methylmcotinic 디cid amide를 기질로 하고 횐쥐의 뇌 cytosol분획을 효소원으로 드하는 반응액 중에 석창포의 정유분획을 용량별로 첨가하고Laldehyde oxidase의 활성변화를 관찰하였다. 그 결과, Fig. 2 에서 보는 바와 같이 0.001 mg/ml의 낮은 농도에서 대조 d군에 비해 5.0%의 효소 활성 억제 효과를 나타내었으며 그 이상의 농도에서는 2히려 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 석창포 정유가 xanthine oxidase의 활성을 억제시키는 농도가 0.
- 과산화지질 생성 실험조건의 시험 관내에 뇌 조직 마쇄액과 석창포 정유의 용량을 달리하면서 첨가시켜 과산화지질의 생성정도를 관찰하였다. 그 결과, 용량이 증가할수록 과산화지질의 생성이 크게 억제되는 용량의존적 경향을 보여주었다 (Fig. 3). 특히, 1.
- 1). 그리고 0.1 mg/ml의 농도에서는 대조군과 같은 활성을 보였으나 그 이상의 농도에서는 오히려 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타나 과량의 정유는 효소 억제 효과가 없는 것으로 관찰되었다.
- 0%의 효소 활성 억제 효과를 나타내었으며 그 이상의 농도에서는 2히려 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 석창포 정유가 xanthine oxidase의 활성을 억제시키는 농도가 0.01 mg/ml이며 그 이상의 농도에서는 활성을 증가시킨다는 실험 결과와 종합해보면, 두 종류의 활성산소종 생성계 효소 활성은 낮은 농도의 정유액에서는 억제되나 농도가 높아질수록 오히려 증가되어 과량의 정유는 오히려 활성산소종 생성을 촉진시킬 수도 있는 것으로 예상된다.
- 석창포 정유는 xanthine oxidase에 대해서는 0.01 mg/mJ 에서 13.3%, aldehyde oxidase에 대해서는 0.001 m흥/ml에서 5.0% 각각 효소 활성을 억제하였으나 과량에서는 오히려 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 지질과 산화 억제효과는 1.
- 0% 각각 효소 활성을 억제하였으나 과량에서는 오히려 효소 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 지질과 산화 억제효과는 1.0 mg/ml에서 대조군에 비해 49.4% 억제하여 우수한 효과를 보였으며 향기를 7일간 홉입시킨 in vivo test에서는 인위적으로 지실과 산화를 유발시킨 내 조군에 비해 과산화지실이 16.7% 감소되었다. 그러나 DPPH radical에 대한 소거효과는 20 mg/ml에서 약 4%의 미미한 효과를 나타내었다.
- 3). 특히, 1.0 mg/ml의 농도에서 생성된 MDA의 양이 조직 1 g당 13.3 nmoles로서 대조군에 비해 지질과산화 반응이 494% 억제되었으며 10.0 mg/ml에서는 10.6 rmolg로서 56.7%가 억제되어 우수한 효과를 나타내었다.
- 항산화 활성을 검정하는 또 다룐 지표로서 사용되는 DPPH 라디칼 소거 효과에서는 석창포 정유액의 용량이 증가함에 따라 효과가 증가하는 경향은 있으나 그 효과는 낮게 나타나 2 mg/ml의 농도에서도 약 4% 정도의 소거 효과만을 보였다 (Fig. 5). 따라서 석창포 정유액은 라디칼을 직접적으로 제거하는 효과는 미약한 것으로 분석된다.
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