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제안 방법
- 99%의 사멸율이 되도록 조사 시간을 조절하면서 UV를 조사하여 돌연변이 유도를 한 후에 즉시 알루미늄 호일로 싸서 차광하여 광회복에 의한 DNA 복구가 일어나지 않도록 하였다(7). 28℃, 4 일간 배양한 후에 생존 콜로니를 무작위 선별하여 생산배지가 함유된 한천베지로 만든 직경 8 mm, 높이 4 mm의 agar piece 상에 도말한 후에 건조가 안되도록 humid chambet에서 28℃, 7 일간 배양한 다음 생물학적 검정을 실시하였다. 660 nm에서 광학밀도가 2.
- 세포 분열이 유도된 평판베지를 파장 260 nm, 20 W 자외선燈 2개가 65 cm 거리에 설치된 무균상자에서 UV를 조사하였다. 90-99.99%의 사멸율이 되도록 조사 시간을 조절하면서 UV를 조사하여 돌연변이 유도를 한 후에 즉시 알루미늄 호일로 싸서 차광하여 광회복에 의한 DNA 복구가 일어나지 않도록 하였다(7). 28℃, 4 일간 배양한 후에 생존 콜로니를 무작위 선별하여 생산배지가 함유된 한천베지로 만든 직경 8 mm, 높이 4 mm의 agar piece 상에 도말한 후에 건조가 안되도록 humid chambet에서 28℃, 7 일간 배양한 다음 생물학적 검정을 실시하였다.
- A. teichomyceticuse teicoplanin 생산성을 높이기 위해, 계대배 양 배지에서 7일간 배양하여 얻은 포자 형성 콜로니를 생리식염수에 현탁한 후에 유리섬유로 여과하여 균사를 제거하고 포자 현탁액을 민들었다. 예상 사멸율에 띠라 적당히 희석된 포자현탁 액 100 μl를 종균배지가 든 한천 평판배지에 도말하고 3이에서 2시간 미리 배양하여 세포 분열이 일어나도록 하였다.
- Fig. 3에서 실험한 결과에 따라 우수 변이주 출현 빈도가 높은 치사율 90%가 되도록 UV 조사 시간을 120초로 하여 얻어진 변 이주 86개와 UV를 조사하지 않은 모균주 85개에 대해 무작위로 생물학적 검정에 의한 저지환 크기를 측정하여 히스토그램을 작성한 결과는 Fig. 4와 같다. 모균주의 자연변이주들에 대해 teicoplanin 역가 분포를 조사한 결과 전형적인 정규분포곡선을 그리면서 안정한 역가분포를 나타내었고 UV 조사로 얻어진 변 이주의 역가분포는 모균주와 비교할 때 정규분포곡선의 peak가 오른쪽으로 이동하였다.
- Teicoplanin 생산성을 제외한 변이주의 특성에 대해서는 고체 배양에서의 포자형성능, 전분분해능, 단백질분해능, 삼투압 내성 및 항생제에 대한 내성을 비교하였다. 포자형성능은 포자형성배 지에서 배양한 후에 현미경으로 포자낭 형성을 관찰하였다.
- Teicoplanin 생산을 위해서는 생산 배지 40 mP} 담긴 250 ml Erlenmeyer flask에 종균배양액 4 씩 접종하여 28℃, 120 ipm 에서 7일간 배양하거니-, 3 /의 생산배지가 들어있는 5 I 발효조 (KF-5L, 한국발효기)에 5% (v/v) 접종량으로 종균배양액을 접종하여 배양온도 28℃, 교반속도 300 rpm, 통기량 0.5 wm으로 7 일간 배양하면서 12시간마다 시료를 취하여 분석하였다.
- UV를 이용한 돌연변이 유도로 고생산성 균주를 얻기 위한 최적의 UV 시-멸율을 얻기 위하여 260 nm 파장의 20 W 지외선등 2개가 65 cm에 설치된 거리에서 UV 조사 시간에 따른 사멸곡선을 구하였다. Fig.
- UV조사에 의한 돌연변이 특성을 확인하기 위하여 작용기작이 서로 디른 5가지 항생제에 대한 최소저해농도(MIC)를 측정하였 다(Table 2). Rifampin, tetracycline에 대한 MIC는 변화가 없지만 streptomycin, erythromycin에 대한 돌연변이주의 MIC값이 감소 한 것으로 보아 UV조사에 의해 ribosome에 변이가 일어났거나 내성관련 유전자가 변화되었다고 생각되었다.
- 5 mm의 유리관으로 구멍을 내고 아스피레이터로 한천을 홉입하여 agar well을 제조하였다. agar well 각각에 표준 용액 및 배양액의 원심분리 상등액을 50 μl씩 넣고 1일간 배양한 다음 저지환이 크기를 측정하여 표준용액의 회귀곡선으로부터 농도를 계산하였다.
- 항생제에 대한 내성은 농도구배법을 이용하였다. 먼저 항생제가 포함된 배지를 기울여서 굳힌 후 같은 부피의 항생제 불포함 배지를 그 위에 부어 수평이 되도록 굳힌 다음 I* O (CFU/诚)이 되도록 회석된 균주를 도말하여 4일 동안 배양한 후에 plate위에 생장 범위까지 거리를 측정하여 포함된 항생제의 최소저해농도 (MIC)를 계산하여 항생제 내성을 비교하였다.
- 본 연구에서는 Actinoplanes teichomyceticus ATCC31121 을 모 균주로 시용하여 UV에 외한 유전적 개량을 통하여 돌연변이주를 얻는 방법을 최적화하고 그 방법을 통하여 얻은 teicoplanin 과량생산 돌연변이주를 얻은 후 발효조 배양을 통한 생산성 향상을 확인하였고, 변이주의 여러가지 특성을 조사하였다.
- 멸율일 때 우수 변이주 발생 빈도가 높은 것으로 보고되고 있다(5-7). 본 연구에서는 우수 돌연변이주 출현 확을이 높은 UV조사 시간을 구하기 위하여 Fig. 2에서 구한 사멸곡선식에서 치사율 90%, 99%,99.9%, 99.99%가 되기 위한 UV 조사시간 41초, 83초, 124초 그리고 166초를 확인하고 해당 시간별로 UV를 조사하여 생존한 콜로니에 대한 생물학적 검정에 의한 저지환 크기를 측정하여 히스토3램을 직.성하였다(Fig.
- 예상 사멸율에 띠라 적당히 희석된 포자현탁 액 100 μl를 종균배지가 든 한천 평판배지에 도말하고 3이에서 2시간 미리 배양하여 세포 분열이 일어나도록 하였다. 세포 분열이 유도된 평판베지를 파장 260 nm, 20 W 자외선燈 2개가 65 cm 거리에 설치된 무균상자에서 UV를 조사하였다. 90-99.
- teichomyceticuse teicoplanin 생산성을 높이기 위해, 계대배 양 배지에서 7일간 배양하여 얻은 포자 형성 콜로니를 생리식염수에 현탁한 후에 유리섬유로 여과하여 균사를 제거하고 포자 현탁액을 민들었다. 예상 사멸율에 띠라 적당히 희석된 포자현탁 액 100 μl를 종균배지가 든 한천 평판배지에 도말하고 3이에서 2시간 미리 배양하여 세포 분열이 일어나도록 하였다. 세포 분열이 유도된 평판베지를 파장 260 nm, 20 W 자외선燈 2개가 65 cm 거리에 설치된 무균상자에서 UV를 조사하였다.
- 포도당 농도는 dinitrosalicylic acid (DNS)법 (Miller, 1959)을 시용하였으며, 암모니아는 암모니아 이온전극(EA-940 Ion Analyzer, Orion Research, USA)을 이용하여 즉정하였다(14). 인의 농도는 베양액에 몰리브덴산 암모늄을 작용시켜 인산몰리 브덴산암모늄을 만든 디음, 1 -amino-2-naphthol-4-sulfon)c acid로 환원시켜 발색시킨 후에 660 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 구하였다 (1).
- 5%가 힘유된 nutrient 배지에 1% (v/v)가 되도록 접종한 후에 bioassay dish (23 cmX23 cm, Nunc, UK)에 150 ml를 붓고 굳힌 다음 변이주를 배양한 agar piece들을 일정한 간격으로 올려 놓고 37P에서 1일간 배양하였다. 저지환이 가장 큰 agar piece 싱-의 콜로니를 선별하여 계대 배양 배지에 도말하여 배양한 후에 생산베지에서 다시 teicoplanin 생산성을 다시 확인하여 생산성이 높은 변이주를 선 별하였다.
- , Italy)를 80, 400, 2000, 10000 mghnl 용액으로 만들어 사용하였다. 지시균인 Staphylococcus aureus를 660 nm에서 광학밀도가 2.0 이상(>109 CFU/mZ)이 되도록 배양하고, 한천(15%가 함유된 nutrient 배지에 l%(v/v)를 접종한 후에 bioassay dish에 150 ml를 붓고 굳힌 다음 직경 5.5 mm의 유리관으로 구멍을 내고 아스피레이터로 한천을 홉입하여 agar well을 제조하였다. agar well 각각에 표준 용액 및 배양액의 원심분리 상등액을 50 μl씩 넣고 1일간 배양한 다음 저지환이 크기를 측정하여 표준용액의 회귀곡선으로부터 농도를 계산하였다.
- Teicoplanin 생산성을 제외한 변이주의 특성에 대해서는 고체 배양에서의 포자형성능, 전분분해능, 단백질분해능, 삼투압 내성 및 항생제에 대한 내성을 비교하였다. 포자형성능은 포자형성배 지에서 배양한 후에 현미경으로 포자낭 형성을 관찰하였다. 전분 분해능은 기용성 전분을 기질로 첨가한 후 I시간 동안 형성된 포도당의 밀리몰수를 1 unit로 나타내었고, 단백분해능은 카제인을 기질로 첨가한 후 분 동안 형성된 tyrosine의 mg수를 1 umt로 하였으며 내염성은 생장이 가능한 최고 NaCJ 농도로 하였다 (17).
대상 데이터
- A. teichomyceticus ATCC31121.을 계대베양 배지에 접종하여 28℃ 항온기에서 7일간 배양한 다음 형성된 포자를 40 ml의 종 균배지가 들어있는 250 ml baffled 삼각 flask에 1 ml 당 IX 106개가 되도록 접종하고 28℃에서 2일간 150 rpm으로 배양을 실시한 것을 종균으로 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균주는 생명공학연구원(KCTC)으로부터 분양 받은 Actinoplanes teichomyceticus ATCC31121 (KCTC9543) 을 사용하였다. 자연친주에 UV 조사를 통하여 얻은 변이추 T1014의을 teicoplanin 생산 발효에 사용하였다.
- 43) 을 사용하였다. 자연친주에 UV 조사를 통하여 얻은 변이추 T1014의을 teicoplanin 생산 발효에 사용하였다.
- 시료내의 teicoplanin 농도 측정은 agar well diffusion 방법에 외한 생물학적 검정법을 이용하였으며 지시균으로 Staphylococcus aureus를 시용하였다. 표준시약으로는 Targocid (200 mg/vial teicoplanin 주사제, Gruppo Lepetit S.P.A., Italy)를 80, 400, 2000, 10000 mghnl 용액으로 만들어 사용하였다. 지시균인 Staphylococcus aureus를 660 nm에서 광학밀도가 2.
이론/모형
- 시료내의 teicoplanin 농도 측정은 agar well diffusion 방법에 외한 생물학적 검정법을 이용하였으며 지시균으로 Staphylococcus aureus를 시용하였다. 표준시약으로는 Targocid (200 mg/vial teicoplanin 주사제, Gruppo Lepetit S.
- 건조균체량(DMW)은 배양액 10 ml를 Wliatman GF/C 유리여 과지로 감압 여과한 후 105℃, 2시간 건조한 후 무게를 달아 측정하였다. 포도당 농도는 dinitrosalicylic acid (DNS)법 (Miller, 1959)을 시용하였으며, 암모니아는 암모니아 이온전극(EA-940 Ion Analyzer, Orion Research, USA)을 이용하여 즉정하였다(14). 인의 농도는 베양액에 몰리브덴산 암모늄을 작용시켜 인산몰리 브덴산암모늄을 만든 디음, 1 -amino-2-naphthol-4-sulfon)c acid로 환원시켜 발색시킨 후에 660 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 구하였다 (1).
- 항생제에 대한 내성은 농도구배법을 이용하였다. 먼저 항생제가 포함된 배지를 기울여서 굳힌 후 같은 부피의 항생제 불포함 배지를 그 위에 부어 수평이 되도록 굳힌 다음 I* O (CFU/诚)이 되도록 회석된 균주를 도말하여 4일 동안 배양한 후에 plate위에 생장 범위까지 거리를 측정하여 포함된 항생제의 최소저해농도 (MIC)를 계산하여 항생제 내성을 비교하였다.
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