선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 유전자 재조합 EHase 생촉매 개발 연고와 관련하여 지금까지진행되어 온 EHase의 클로닝 및특성 분석에 대한 연구도 디부분 인간 및 동물 갚 또는 cylosol에 존재하는 EHase에 대하여 주로 진행되어 왔으며, 상업적 의미가 있는 미생물 유레외 EHase에 대한 연구는 몇종의 미생물에 대한 연구만 진행되이왔다(16-19). 따라서, 본 연구에서는 고기능성 유전자 재조합 EHase 생촉매 개발 연구의 일환으로 방향족 에폭사이드 기질에 대한 입체 선텍적 가수분해능이 우수한 Aspergillus niger LK 유래의 EHase에 대한 기질 특이성 분석과 더불어 EHase 유전자를 클로닝하고 그 특성을 분석하고사 하였다.
제안 방법
- A. niger LK를 고체배지(glucose 10 g/L, com-steep liquor 20 g/L, Bacto-Agar 20 g/L)에서 3〜4일간 배양한 후 생성된 건은색 포자를 액체베지(glucose 10 g/L, com-steep liquor 20 g/L)에 접종하여 27°C, 250 rpm에서 3일간 배양한 후 원심분리하고 상등액을 제거하고 균체를 증류수로 두 번 정도 세척하였다. 균체를 41에서 3〜4일간 건조시켜 얻은 A.
- 0)에 현탁시킨 후 4〜10 mM 농도로 다양한 라세믹 에쏙시-이드 기질을 주입하였다. 반응기로는 screw-cap 플라스크 또는 jacketed glass 효소반응기를 사용하였으며, 27°C, 250 ipn에서 교빈-시키면서 반응을 진행시켰다. 반응용액을 pentane 또는 cyclohexane으로 추츨한 후, 유기용매 층을 GC 로 분석하여 enantiomeric excess (ee = 奇〔 % 값 및 EHase의 활성을 평가하였다一 기질인 라세믹 에폭사이드 및 광학적으로 순수한 에폭사이드 표준품은 시약 등급을 구입하여 사용하였다.
- 반응용액을 pentane 또는 cyclohexane으로 추츨한 후, 유기용매 층을 GC 로 분석하여 enantiomeric excess (ee = 奇〔 % 값 및 EHase의 활성을 평가하였다一 기질인 라세믹 에폭사이드 및 광학적으로 순수한 에폭사이드 표준품은 시약 등급을 구입하여 사용하였다. 광학활성 에폭사이드의 ee값 및 추율을 계산하기 위하여 (R)-이성질체와 (£)-이성질체에 대한 분리능이 있는 Supelco사(미국)의 8-Dex 120 (0.25 mm ID, 30 m length, 25 /./m film thickness) 컬럼음 사용하였으며, GC 조건은 문헌치를 이용하였다(15).
- niger LK의 total RNA는 Chomczynski과 Sacchi의 빙-범을 사용하여 분리하였다(20). 분리된 total RNA로부터 cDNA 의 힙성에 있어서 primer는 random nonamer를 사용하였고 reverse transcriptase를 이용하여 42'C에서 1분간 역전사반응을 수행하였으며, 6(TC에서 10분간 RNa骯로 처리한 후 RNAase 및 reverse transcriptase 등은 94"C에서 5분간 실활시켜 A. niger LK의 first strand cDNA를 힙”성하였다.
- A. niger LK의 cDNA library로부터 EHase 유전사를 증폭시키기 위하여 PCR을 사용하였다. PCR에 사용한 primer^ 기존 연구들이 mRNA 記qieK紀를 참조하였다(18).
- pETBlue-l에 클로닝하는 경우, PCR 산물을 end conver모ion한 다음 ligaHon하여 competent cell 에 형질전환 시켜 X-gal, IPTG 및 ampicillin0] 함유된 LB 평판에서 흰섹 콜로니를 선발하여 EHa维가 들어있는 플라스미드인 pET/EHasR를 얻었다. pRSET A에 클로닝하는 경우에는 먼저 제한효소 무위가 있는 primes들을 사용하여 얻은 PCR product를 TA 이oning v硕or의 일종인 pEZ-T vector(RNA, Kor契)에 ligatioir하여 DH5« 에 형칠전환시킨 후 X-gal, IPTG 및 ampicillin이 첨가된 LB agar pla把에서 흰신] 콜로니를 따서 여러 종류의 제한克소로 가수분해하여 전기영동하여 표ia熒 유천자升 삽입되어 있는지 확인하였다須guie 1). EHasc 유전자가 삽입되어 있는 을 X/同과 Kpnl으로 분해하여 전기영동한 다음 1200 bp 정도의 DNA band로부터 추출한 DNA를 pRSET A vectoro]] wbcloning하였다.
- pRSET A에 클로닝하는 경우에는 먼저 제한효소 무위가 있는 primes들을 사용하여 얻은 PCR product를 TA 이oning v硕or의 일종인 pEZ-T vector(RNA, Kor契)에 ligatioir하여 DH5« 에 형칠전환시킨 후 X-gal, IPTG 및 ampicillin이 첨가된 LB agar pla把에서 흰신] 콜로니를 따서 여러 종류의 제한克소로 가수분해하여 전기영동하여 표ia熒 유천자升 삽입되어 있는지 확인하였다須guie 1). EHasc 유전자가 삽입되어 있는 을 X/同과 Kpnl으로 분해하여 전기영동한 다음 1200 bp 정도의 DNA band로부터 추출한 DNA를 pRSET A vectoro]] wbcloning하였다. Ampi cillin pla忙에서 형성된 콜로니들로부터 정제한 pl 臨 mid 들을 여러 종류의 제한효소로 가수뿐해하여 확인한 후 pRSET A/EHaw 를 얻었다.
- EHasc 유전자가 삽입되어 있는 을 X/同과 Kpnl으로 분해하여 전기영동한 다음 1200 bp 정도의 DNA band로부터 추출한 DNA를 pRSET A vectoro]] wbcloning하였다. Ampi cillin pla忙에서 형성된 콜로니들로부터 정제한 pl 臨 mid 들을 여러 종류의 제한효소로 가수뿐해하여 확인한 후 pRSET A/EHaw 를 얻었다.
- 재조합 EHase를 발현시키기 위하여 pET/EHase DNA를 DH5a 세포로부터 정제한 다음 T7 RNA polymerase 유전자가 있는 발현 ho거인 E. coll BL21(DE3)pLacI competent cell 에, pRSET A/EHas巳는 E. coll BL21(DE3) competent 典 11 에 형질전환시켜 ampicillin pla把에서 positive 콜로니를 얻었다. 재조합 EHase 유전자가 있는 콜로니를 1% gluco詫와 50 俸 ampicillin이 포함된 LB배지에 OD颁값이 0.
- coll BL21(DE3) competent 典 11 에 형질전환시켜 ampicillin pla把에서 positive 콜로니를 얻었다. 재조합 EHase 유전자가 있는 콜로니를 1% gluco詫와 50 俸 ampicillin이 포함된 LB배지에 OD颁값이 0.5가 될 때까지 배양한 후 IPTG를 최종농도 0.4 mM이 되도록 첨가한 후 3시 社 더 배양하였다. 베양액을 원심분리한 후 균체를 buffer(10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.
- 4 mM이 되도록 첨가한 후 3시 社 더 배양하였다. 베양액을 원심분리한 후 균체를 buffer(10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4)에 현탁시켜 파쇄한 후 12% SDS-PAGE를 통해 발현정도를 분석하였다.
- niger LK 는 방향족 에폭사이드 라세믹체에 대한 입체 선택적 가수분해능이 우수한 미생물로서, A niger LK 유래의 EHa記의 기질 륵이성을 평가하기 위하여 다양한 styrene oxide 계열의 에폭사이드 기칠에 대하역 입체특이성 가수분해 반응을 실시하였다. 기질 특이성 분석을 위한 생촉매 반응은, 우선 건조분말 형다]로 제조된 & niger LK 생족매 30 mg을 1 mL 의 100 mM phosphate buffer/p 들어 있는 screw capped reaction vial에 넣은 후 해당되는 놈도외 리세믹에 녹사이드 기실을 첨가해주면서 반응을 시작하였다. 기질의 용해도 및 고농도 기실에 의한 생촉매 활성 저하 현상 등을 고려하여 4-10 mM 정도에서 圣기능도를 결정하였디-.
- 기질의 용해도 및 고농도 기실에 의한 생촉매 활성 저하 현상 등을 고려하여 4-10 mM 정도에서 圣기능도를 결정하였디-. 가수분헤 반응 후 남은 에폭사이드의 absolute configuratioii은 chiral GC 분석읖 통해 결정하였으며, 수율은 라세믹 에폭사이드 기질 농도에 내해 남은 광학활성 에폭사이드의 농도 백분율로 결정하였다 (이론수율은 50%). Table 1을 보면, A.
- A. niger LK로부티 분리 한 total RNA로부터 fir이 strand cDNA를 합성하였으며, PCR을 사용하여 얻은 EHase DNA를 pETBlue-1 vector에 subek而瓏하여 pET/EHas己을 얻었다. 횐색 콜로니들의 plasmid DNA를 분리한 뒤 wqu帥cing하여 확인한 결과 upstr 血n 의 DNA 들이 3〜5 bp 씩 제거되어 subcloniii윽된 ph蛤 mid 들이 많았으며 흰색 콜로니이면서도 agarose 선기영동상으로는 vector의 크기와 같은 pl迎mid들이 많았다.
- pET/EHase 플라스미드상에 EHase 유전자가 올바른 위치로 삽입되어 있는지를 알아보기 위하여 plasmid를 분리하고 여러 종류의 제한효소로 가수분해하여 1% agarose gel 에 전기영동을 실시하였다. Xbal으로 분해 한 경우 vector는 3476 bp, pET/EHase는 4673 bp ML기에 해당되는 band를 불 수 있었으머, Eg加로 제한하면 3540 bp와 1139 bp의 fragment를, Smal으로 제한하면 3973 bp오]- 703 bp, EcoRI으로 제한하면 3800 bp와 900 bp에 해당되는 fragment의 band를 확인할 수 있어 A.
- 이 디-시 클로닝을 하였디-. X"ol과 Kpril site를 가지는 primer들을 사용하여 PCR을 수행한 후 TA cloning vector에 subcloning하고 다시 pRSET A에 subcloning하여 4개의 positive colony를 얻었다. A.
- niger LK의 EHase가 삽입되었다고 생각되는 pRSET A/EHase DNA를 XhA 및 Kpn 1으로 가수분해 한 경우 1200 bp 정도의 band 와 vector 크기인 2900 bp의 band들이 보여 EHase gene이 삽입되었음을 확인하였다. 또한 Bg/II 및 EcoRI으로 잘라 1150 bp 및 830 bp의 band가 있었으므로 옳은 방향으로 삽입되었음을 확인하고 EHase 단백질을 발현시키기 위하여 pRSET A/EHase DNA를 발현균주로 사용되는 E. coli BL21(DE3) competent cell 에 형질전환시켰다. 재조합 E.
- coli BL21(DE3) 균주를 LB베지에서 배양하면서 IPTG로 발현을 유도한 후 12% SDS-PAGE에 전기영동을 실시한 결과 주목할만한 발현 정도의 차이를 관측할 수는 없었다(data not shown). 올바르게 발현되었는지를 확인하기 위하여 재조합 E. coll BL21 (DE3)을 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 재조함 E.
- Styrene oxide 계열의 리세믹 에폭사이드 기질에 대한 입체 선택적 가수분해능이 우수한 Aspergillus m'ger계열외 셍촉매를 선발하였고, A. niger LK 유래의 EHase의 기질 특이성을 분석하였디■. A.
- niger LK의 EHase는 benzene ring에 oxirane ring이 직접 연결되어 있는 styrene oxide, p-nitrostyrene oxide 기질에 대해서는 (R)~이성질체, benzene ring과 oxirane ring 시, 이에 ether 등의 연결 chain이 있는 기질예 데헤서는 (S)-이성질체에 대한 입체선텍적 가수분해능이 우수하였다. 4 niger LK의 EHase 유전자를 RT-PCR 방법으로 클로닝하였고, sequencing을 통해 다른 미생물 유래의 EHase와의 se quence identity 분석 등을 통해 특성을 분석하였다. Yeast 유래의 EHase와는 32% 수준의 sequence identity를 보였으며, Agrobacterium, Corynebacterium 등의 박테리아 유래 EKase와는 identity가 매우 낮은 특성음 보였다.
대상 데이터
- niger LK를 고체배지(glucose 10 g/L, com-steep liquor 20 g/L, Bacto-Agar 20 g/L)에서 3〜4일간 배양한 후 생성된 건은색 포자를 액체베지(glucose 10 g/L, com-steep liquor 20 g/L)에 접종하여 27°C, 250 rpm에서 3일간 배양한 후 원심분리하고 상등액을 제거하고 균체를 증류수로 두 번 정도 세척하였다. 균체를 41에서 3〜4일간 건조시켜 얻은 A. niger LK 건조분말을 생촉매로 시용하였다.
- 반응기로는 screw-cap 플라스크 또는 jacketed glass 효소반응기를 사용하였으며, 27°C, 250 ipn에서 교빈-시키면서 반응을 진행시켰다. 반응용액을 pentane 또는 cyclohexane으로 추츨한 후, 유기용매 층을 GC 로 분석하여 enantiomeric excess (ee = 奇〔 % 값 및 EHase의 활성을 평가하였다一 기질인 라세믹 에폭사이드 및 광학적으로 순수한 에폭사이드 표준품은 시약 등급을 구입하여 사용하였다. 광학활성 에폭사이드의 ee값 및 추율을 계산하기 위하여 (R)-이성질체와 (£)-이성질체에 대한 분리능이 있는 Supelco사(미국)의 8-Dex 120 (0.
- PCR에 사용한 primer^ 기존 연구들이 mRNA 記qieK紀를 참조하였다(18). E. coli 발현 벡터인 pETBlue-l(^ovagen, USA)에 클로닝하기 위하여 사용한 primer 로는 개시코돈인 ATG 로 시작하는 5 AN (start): 5’ - atgtccgctccgttcgccaagtttccctcg - 3' 모} 3AN(stop): 5' - etaette- tgGcaGmctgctogacaaatgc - 3’이었으며, 또 다른 발현베터 인 pRSET A(Invitrogen, USA) 에 클로닝하기 위하여 사용한 primer로는 X/两과 X/湖의 제한효소 위치가 있는 5ANEHF: 5’ - egetega슬RtatccgctccgttugGGaa흠t - 3’ 호+ 3ANEHR: 5’ - gcggla- ccctacHctgccacacctgctcg - 3' 사용하였다. pETBlue-l에 클로닝하는 경우, PCR 산물을 end conver모ion한 다음 ligaHon하여 competent cell 에 형질전환 시켜 X-gal, IPTG 및 ampicillin0] 함유된 LB 평판에서 흰섹 콜로니를 선발하여 EHa维가 들어있는 플라스미드인 pET/EHasR를 얻었다.
이론/모형
- A. niger LK의 total RNA는 Chomczynski과 Sacchi의 빙-범을 사용하여 분리하였다(20). 분리된 total RNA로부터 cDNA 의 힙성에 있어서 primer는 random nonamer를 사용하였고 reverse transcriptase를 이용하여 42'C에서 1분간 역전사반응을 수행하였으며, 6(TC에서 10분간 RNa骯로 처리한 후 RNAase 및 reverse transcriptase 등은 94"C에서 5분간 실활시켜 A.
성능/효과
- niger LK 유래의 EH故는 다양한 머yn海 oxide 계열의 에폭사이드기질에 대한 입체특이성 가수분해능이 우수함을 알 수 있었다. 기질 특이싱의 경우, benzene 血g에 oxirane ri理이 직접 연결되어 있는 styrene oxide, y^-nitrostyrene oxide의 경우 남은 에폭사이드의 chirality가 (S)형인 반면, benzene ring과 oxirane ring 사이에 ether 능의 연결 chain이 있는 기질에 대해서는 남은 광학활성 에폭사이드의 absolute coiifigLiralioii이 ㈤ 형임을 알 中 있있다 따라서, A niger LK의 E压疏의 입체 선택성은 기질의 분자 구조에 따라 absolute configuration 이 변경됨을 알 수 있었디-' 수율의 경우 /7-nitrostyrene oxide 에 대해 약 35% 수준외 가장 높은 수율로 얻을 수 있었으며, 고부가가치 chiral 으]약품 등에 닐리 사용되는 styrene ox成를 기칠로 사용한 경우에서는 약 30% 수준(이론 수율 드 50%)의 비교적 높은 수율로 광학적으로 순수한 (5)-styrene oxiW를 얻을 수 있었다.
- niger LK로부티 분리 한 total RNA로부터 fir이 strand cDNA를 합성하였으며, PCR을 사용하여 얻은 EHase DNA를 pETBlue-1 vector에 subek而瓏하여 pET/EHas己을 얻었다. 횐색 콜로니들의 plasmid DNA를 분리한 뒤 wqu帥cing하여 확인한 결과 upstr 血n 의 DNA 들이 3〜5 bp 씩 제거되어 subcloniii윽된 ph蛤 mid 들이 많았으며 흰색 콜로니이면서도 agarose 선기영동상으로는 vector의 크기와 같은 pl迎mid들이 많았다. 이는 PCR 산불의 5’말단에 인산기가 붙어있지 아아 PCR 산물의 돌출된 염 기를 질"라 blunt &nd로 만들거나 5’에 인산기를 붙여주는, 효소들이 들어있는 end conversion mix 때문인 것으로 생각된다.
- 블로닝된 EH姦의 1197 场에 대한 염기서열을 분석해본 결과, 398개의 아미노산으로 구성되어 있었으며 이는 약 44.5 kDa에 해당되는 단백질임을 알 수 있었다. EHa%의 pl 값은 약 4.
- niger LCP521 유래의 EH巽와 유사한 결과를 보여주었다(18). 클로닝된 EH 球의 아미노산 서열을 A, niger LCP521 의 EHase의 서열과 비교해본 결과 89% 수준의 높은 sequence id巳ntity를 가지고 있었다, 또한 진핵세포인 Rhodotortda glutinis 유래의 EHase 아미노산 서열들과 비교히〕본 결괴-, 32% 수준의 identity를 보였다. Agrobacterium 및 Co顷旋bmeW的의 EH&se와는 각각 13% 및 9% 수준의 낮은 id即tity를 보여주어 특히 원핵세포 유己H 의 E田船외는 상당히 다른 아미노산서열을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다(Figure 2).
- 클로닝된 EH 球의 아미노산 서열을 A, niger LCP521 의 EHase의 서열과 비교해본 결과 89% 수준의 높은 sequence id巳ntity를 가지고 있었다, 또한 진핵세포인 Rhodotortda glutinis 유래의 EHase 아미노산 서열들과 비교히〕본 결괴-, 32% 수준의 identity를 보였다. Agrobacterium 및 Co顷旋bmeW的의 EH&se와는 각각 13% 및 9% 수준의 낮은 id即tity를 보여주어 특히 원핵세포 유己H 의 E田船외는 상당히 다른 아미노산서열을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다(Figure 2).
- niger LK의 EHase DNA가 vector에 올바른 방향으로 들어갔음을 알 수 있었다. pET/EHase를 발현시키기 위하여 DNA를 E. colt BL21(DE3)pLacI에 형질전환시켜 LB 배지에 비양하고 발현정도를 확인하기 위하여 12% SDS-PAGE에 전기영동음 실시하였으나, IPTG로 유도하지 않은 균과 발현 성도를 비교하였을 때 차이를 발견할 수 없었다. 그러나, 유전자 재조합 E.
- colt BL21(DE3)pLacI에 형질전환시켜 LB 배지에 비양하고 발현정도를 확인하기 위하여 12% SDS-PAGE에 전기영동음 실시하였으나, IPTG로 유도하지 않은 균과 발현 성도를 비교하였을 때 차이를 발견할 수 없었다. 그러나, 유전자 재조합 E. coli를 생촉매를 이용한 styrene oxide 가수분해 반응을 실시해본 결과 촉매 활성은 존제함을 알 수는 있었다 (data not shown). 기존 문헌을 살펴보면, Agrobacterium radiobaaer 유래의 EHase의 경우 E.
- X"ol과 Kpril site를 가지는 primer들을 사용하여 PCR을 수행한 후 TA cloning vector에 subcloning하고 다시 pRSET A에 subcloning하여 4개의 positive colony를 얻었다. A. niger LK의 EHase가 삽입되었다고 생각되는 pRSET A/EHase DNA를 XhA 및 Kpn 1으로 가수분해 한 경우 1200 bp 정도의 band 와 vector 크기인 2900 bp의 band들이 보여 EHase gene이 삽입되었음을 확인하였다. 또한 Bg/II 및 EcoRI으로 잘라 1150 bp 및 830 bp의 band가 있었으므로 옳은 방향으로 삽입되었음을 확인하고 EHase 단백질을 발현시키기 위하여 pRSET A/EHase DNA를 발현균주로 사용되는 E.
- coli BL21(DE3) competent cell 에 형질전환시켰다. 재조합 E. coli BL21(DE3) 균주를 LB베지에서 배양하면서 IPTG로 발현을 유도한 후 12% SDS-PAGE에 전기영동을 실시한 결과 주목할만한 발현 정도의 차이를 관측할 수는 없었다(data not shown). 올바르게 발현되었는지를 확인하기 위하여 재조합 E.
- coll BL21 (DE3)을 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 재조함 E. coll 균체 300 mg을 넣은 효소 반응기에서 약 3시간 반응 후 반응액을 cyclohexane으로 추출하고 chiral GC로 분석을 한 결과, wild-type외 E. coli 균주는 (R), (S)-이성질체 모두에 내해분헤능이 없는 반면 재조합 E. coli는 원 균주인 A. 疋g&와 마찬가지로 (Q-이성질체에 대한 분해능이 ($)-이성질체에 비헤 높음을 확인할 수 있었다(Figure 3). 이러한 실험 결과들로부터 대장균음 숙주로 히.
- 4 niger LK의 EHase 유전자를 RT-PCR 방법으로 클로닝하였고, sequencing을 통해 다른 미생물 유래의 EHase와의 se quence identity 분석 등을 통해 특성을 분석하였다. Yeast 유래의 EHase와는 32% 수준의 sequence identity를 보였으며, Agrobacterium, Corynebacterium 등의 박테리아 유래 EKase와는 identity가 매우 낮은 특성음 보였다. E.
후속연구
- niger LK 유래의 EHase 발현이 가능함을 확인할 수는 있었으나 높은 효율로는 발현되지는 못했다. 이는 Aspergillus 또는 Rhodoiorida 유래의 EHase를 E. c湖에서 효율적으로 발현시키지 못했던 다른 연구 결과들과 함께 보다 효윤적인 진핵세포 유래의 EHasc 발현 시스템 개발이 필요함을 알 수 있다. 클로닝된 A.
- c湖에서 효율적으로 발현시키지 못했던 다른 연구 결과들과 함께 보다 효윤적인 진핵세포 유래의 EHasc 발현 시스템 개발이 필요함을 알 수 있다. 클로닝된 A. niger LK의 EHase에 대하여 E. c#에서의 고효율 발현 연구가 친헹중이며, 향후에 개발될 고기능성 재조합 미생물 생 촉매는 광학활성 에폭사이드 제조용 생물전환공정 시스템에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 통해 확인할 수 있었다. 클로닝된 EHase의 보다 효율적인 발현 인구가 필요하며, 이리한 재조합 EHase는 고부가가치 광학활성 에폭사이드 제조를 위한 생물전환공정 시스템의 생촉매로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.