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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 BPA의 생물학적 처리를 위해 BPA의 정량분석법 정립과 BPA 분해능이 우수한 미생물의 탐색 및 선별, 선별된 BPA 분해 세균의 동정, BPA 분해 효율 및 특성을 조사하였다.
제안 방법
- BPA 분해 미생물로서 최종 선별되어 동정된 3 균주(S.marcescens 1901, S. marcescens 1902, P. putida 1401)를 BPA가 100mg/l 혹은 500mg/l의 농도로 포함된 PAV 배지에서 균체 성장과 BPA 분해정도를 시간대별로 측정하여 BPA 분해 특성을 조사하였다. BPA 농도 100에서 배양했을 경우(Fig.
- BPA 분해 미생물을 분리하기 위하여 여천공단, 대구·구미공단 등의 폐수, 활성 오니, 주변 토양 등을 균원 시료로 채취하여 단일 탄소원으로 BPA가 500 mg/l의 농도로 함유된 PAS 배지에 균원 시료를 10%(v/v or w/v)가 되도록 접종하여 30℃에서 5일간 왕복 진탕(130 rpm)하면서 BPA에 대한 적응 과정을 거쳤다. BPA가 10, 100, 500mg/l로 함유된 PAS agar plate에 101~104 까지 희석된 배양액을 도말하여 30℃에서 7일간 배양하여 집락을 형성하는 미생물을 순수 분리하였다.
- BPA가 10, 100, 500mg/l로 함유된 PAS agar plate에 101~104 까지 희석된 배양액을 도말하여 30℃에서 7일간 배양하여 집락을 형성하는 미생물을 순수 분리하였다. 순수분리된 균주는 단일 탄소원으로 BPA가 100 mg/l 혹은 500 mg/l의 농도로 포함된 PAS 액체 배지에서 130 rpm, 30℃, 5일간 배양한 후, spectrophoto-meter (UV160A, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 균체 탁도를 측정하여 균체 성장(A600)이 0.
- BPA가 10, 100, 500mg/l의 농도로 포함된 PAS 혹은 PAV 배지 20ml이 들어있는 100ml 삼각플라스크에 seed 배양액을 1%(v/v) 접종하고, 130rpm, 30℃에서 3일간 배양하여 잔존 BPA 농도를 측정하였다. Seed는 100mg/l의 BPA가 포함된 LB 배지에서 40시간 동안 30℃, 130 rpm으로 진탕배양하였다.
- 8]과 PAS 배지 100ml에 vitamin mixture(biotin 2μg, calcium pantothenate 400μg, folic acid 2μg, niacin 400 μg, p-aminobenwoic acid 200μg, thiamine 400μg in 10 ml DW) 1 ml를 첨가한 PAV 배지를 사용하였다. PAV 배지의 경우 pH를 7.0으로 보정하였고, 평판 고체 배지로 사용할 때 Bacto agar (Difco)를 1.8%의 농도로 첨가하였으며, 액체 배양을 이용한 BPA 분해능 조사를 위한 실험에서는 PAS 및 PAV 배지에 BPA stock solution(50,000 mg/l in 90% methanol)을 BPA의 최종 농도가 10, 100, 500mg/l가 되도록 첨가하였다.
- 추출한 DNA를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)반응을 수행하였다. PCR 반응은 PCR buffer(20 mM Tris-HCl, 100mM KC1, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 50% Glycerol, pH 8.0: Takara, Shiga, Japan)에 deoxyribonucleotide triphosphate가 각각 20 mM, primer는 각각 50 pmol을 첨가하고, Taq DNA polymerase (Takara Taq) 2.5 unit와 주출된 genomic DNA를 최종 50 ng이 되도록 하여 최종 100㎕로 PCR 반응 용액을 제조하였다. 16S rDNA를 증폭하기위해 사용한 primer로 9F(E.
- coli 536-519; 5'-GWATTACCGCG- GCKGCTG-3')을 사용하였다. PCR반응은 GENEAmp® System 2400(Perkin Elmer, Foster, CA, USA)을 이용하였고, 반응 조건은 우선 95℃에서 5min 동안 DNA를 변성시켜, 94℃에서 1 min, 60℃에서 1 min, 72℃에서 2 min으로 30 cycle을 시행한후 72℃에서 5 min 동안 final extension을 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 ABI automatic DNA sequencer (model 377, Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 염기 서열을 결정하였다.
- 증폭된 PCR산물은 ABI automatic DNA sequencer (model 377, Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 염기 서열을 결정하였다. 결정된 16S rDNA 염기서열은 BLAST search(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 사용하여 분석하였으며, Clustal W (23) program package를 이용하여 Genebank에 등록된 다른 균주들과 분자진화학적 거리를 비교 분석하여 진화계통학적 위치를 확인하였다.
- 따라서, 이들 3 균주들을 독립적으로 BPA 분해실험에 적용하는 것보다 혼합하여 배양하는 경우가 보다 좋은 BPA 분해 효율을 나타낼 것으로 생각되어 혼합배양에 의한 BPA 분해실험을 수행하였다. 균주의 혼합배양은 선별된 3종의 균주를 1901 + 1902, 1901+1401, 1902+1401, 1901+1902+1401의 조합으로 혼합 배양하였으며, 3균주를 순수 배양하여 BPA 분해능을 비교·조사하였다(Fig. 6). 혼합배양의 실험구 중에서는 100 mg/l BPA 농도의 경우, S.
- BPA의 PAS 배지에 대한 용해도는 상온에서 약 350mg/l로 알려져 있지만(16), methanol에 먼저 50,000mg/l로 녹여 stock solution을 조제한 후, PAS 배지에 첨가한 경우는 BPA 최종 농도 500mg/l의 농도까지 결정 상태 없이 완전히 용해되는 것을 확인하였다. 그러므로, 본 실험에서는 BPA 최고 농도를 500mg/l로 하여 BPA 분해 미생물을 분리 및 분해 특성을 조사하였다.
- 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 이들 3 균주들을 독립적으로 BPA 분해실험에 적용하는 것보다 혼합하여 배양하는 경우가 보다 좋은 BPA 분해 효율을 나타낼 것으로 생각되어 혼합배양에 의한 BPA 분해실험을 수행하였다. 균주의 혼합배양은 선별된 3종의 균주를 1901 + 1902, 1901+1401, 1902+1401, 1901+1902+1401의 조합으로 혼합 배양하였으며, 3균주를 순수 배양하여 BPA 분해능을 비교·조사하였다(Fig.
- 또한, BPA 분해 세균의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 조사하여 동정결과를 확인하였다. 생리학적 특성은 Cowan(5)의 방법에 따라 조사한 후 Bergey's manual of systematic bacteriology(14)에 따라 확인하였다.
- 먼저, BPA에 적응시킨 균원시료를 BPA농도 10, 100, 500mg/l로 각각 함유된 PAS 고체 배지에 도말하여 7일간 배양한 후, 집락을 형성하는 미생물 87주를 순수 분리하였다. 그 중 29주를 500mg/l의 BPA로부터 분리하였으며, 49주는 100mg/l의 농도로부터, 나머지 9주만이 10mg/l의 BPA가 함유된 고체 배지상에서 분리되었다.
- 선별된 BPA 분해세균의 동정은 16S rDNA의 부분적 염기서열 분석을 통해 수행하였다. 선별된 세균은 LB(Luria-Bertani) 배지에서 20시간 배양한 후 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(3).
- 분석을 통해 수행하였다. 선별된 세균은 LB(Luria-Bertani) 배지에서 20시간 배양한 후 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(3). 추출한 DNA를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)반응을 수행하였다.
- BPA가 10, 100, 500mg/l로 함유된 PAS agar plate에 101~104 까지 희석된 배양액을 도말하여 30℃에서 7일간 배양하여 집락을 형성하는 미생물을 순수 분리하였다. 순수분리된 균주는 단일 탄소원으로 BPA가 100 mg/l 혹은 500 mg/l의 농도로 포함된 PAS 액체 배지에서 130 rpm, 30℃, 5일간 배양한 후, spectrophoto-meter (UV160A, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 균체 탁도를 측정하여 균체 성장(A600)이 0.1 이상인 균주들을 선별하였다.
- Seed는 100mg/l의 BPA가 포함된 LB 배지에서 40시간 동안 30℃, 130 rpm으로 진탕배양하였다. 잔존 BPA 의 농도는 배양액 1ml을 취하여 16,000×g, 3 min 동안 원심분리하여 균체를 제거한 후, 그 상등액을 methanol로 적당하게 희석하고, PVDF(polyvinylidene fluoride) filter(Whatman, Kent, UK, 0.45㎛)로 여과한 다음 HPLC(Class-LC10, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 분석하였다.
- PCR반응은 GENEAmp® System 2400(Perkin Elmer, Foster, CA, USA)을 이용하였고, 반응 조건은 우선 95℃에서 5min 동안 DNA를 변성시켜, 94℃에서 1 min, 60℃에서 1 min, 72℃에서 2 min으로 30 cycle을 시행한후 72℃에서 5 min 동안 final extension을 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 ABI automatic DNA sequencer (model 377, Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 염기 서열을 결정하였다. 결정된 16S rDNA 염기서열은 BLAST search(www.
- 선별된 세균은 LB(Luria-Bertani) 배지에서 20시간 배양한 후 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(3). 추출한 DNA를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)반응을 수행하였다. PCR 반응은 PCR buffer(20 mM Tris-HCl, 100mM KC1, 0.
대상 데이터
- 5 unit와 주출된 genomic DNA를 최종 50 ng이 되도록 하여 최종 100㎕로 PCR 반응 용액을 제조하였다. 16S rDNA를 증폭하기위해 사용한 primer로 9F(E. coli 9-27; 5'-GAGTTTGATCC- TGGCTCAG-3')와 536R (E. coli 536-519; 5'-GWATTACCGCG- GCKGCTG-3')을 사용하였다. PCR반응은 GENEAmp® System 2400(Perkin Elmer, Foster, CA, USA)을 이용하였고, 반응 조건은 우선 95℃에서 5min 동안 DNA를 변성시켜, 94℃에서 1 min, 60℃에서 1 min, 72℃에서 2 min으로 30 cycle을 시행한후 72℃에서 5 min 동안 final extension을 수행하였다.
- BPA 분해 미생물을 분리하기 위해 BPA를 원료로 플라스틱류를 성형, 제조하는 공장들의 폐수, 활성 오니, 주변 토양 등의 균원 시료 40점을 사용하였다. BPA의 PAS 배지에 대한 용해도는 상온에서 약 350mg/l로 알려져 있지만(16), methanol에 먼저 50,000mg/l로 녹여 stock solution을 조제한 후, PAS 배지에 첨가한 경우는 BPA 최종 농도 500mg/l의 농도까지 결정 상태 없이 완전히 용해되는 것을 확인하였다.
- (Milwaukee, WI, USA)의 제품을 사용하였으며, 주요 배지 성분들은 Difco(Detroit, MI, USA) 제품들을 사용하였다. BPA 분해실험에 사용한 배지는 최소 무기염 배지인 PA salts(PAS) medium(12)[g/1; K2HPO4 4.35, KH2PO4 1.7, NH4C1 2.1, MgSO4·7H2O 0.2, MnSO4·5H2O 0.05, FeSO4·7H2O 0.01, CaCl2·2H2O, 0 0.03, pH 6.8]과 PAS 배지 100ml에 vitamin mixture(biotin 2μg, calcium pantothenate 400μg, folic acid 2μg, niacin 400 μg, p-aminobenwoic acid 200μg, thiamine 400μg in 10 ml DW) 1 ml를 첨가한 PAV 배지를 사용하였다. PAV 배지의 경우 pH를 7.
- BPA는 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA)의 제품을 사용하였으며, 주요 배지 성분들은 Difco(Detroit, MI, USA) 제품들을 사용하였다. BPA 분해실험에 사용한 배지는 최소 무기염 배지인 PA salts(PAS) medium(12)[g/1; K2HPO4 4.
- ) 가 장착된 HPLC를 사용하였다. 이동상 용매는 methanol water (70:30, v/v) 혼합용액을 사용하였고, flow rate는 1.0 ml/min이었으며, column oven의 온도는 40℃, detection은 UV 275 nm에서 수행하였다. 이 분석 조건에서 BPA는 4.
이론/모형
- 조사하여 동정결과를 확인하였다. 생리학적 특성은 Cowan(5)의 방법에 따라 조사한 후 Bergey's manual of systematic bacteriology(14)에 따라 확인하였다.
성능/효과
- putida 1401)를 BPA가 100mg/l 혹은 500mg/l의 농도로 포함된 PAV 배지에서 균체 성장과 BPA 분해정도를 시간대별로 측정하여 BPA 분해 특성을 조사하였다. BPA 농도 100에서 배양했을 경우(Fig. 4), 3종의 균주 중 S. marcescens 1902의 균체 성장이 우수하였으며, 3균주 모두 배양 3일 이후에는 BPA의 분해가 거의 이루어지지 않는 것으로 관찰되었다. 5.
- 40점을 사용하였다. BPA의 PAS 배지에 대한 용해도는 상온에서 약 350mg/l로 알려져 있지만(16), methanol에 먼저 50,000mg/l로 녹여 stock solution을 조제한 후, PAS 배지에 첨가한 경우는 BPA 최종 농도 500mg/l의 농도까지 결정 상태 없이 완전히 용해되는 것을 확인하였다. 그러므로, 본 실험에서는 BPA 최고 농도를 500mg/l로 하여 BPA 분해 미생물을 분리 및 분해 특성을 조사하였다.
- 0㎛이었다(Table 3). KCN이 포함된 배지와 MacConkey agar에서 생육을 보였고, catalase와 oxidase활성을 나타내었으며, citrate를 이용하였으나 urea, gelatin, aesculin 분해능은 없었다. 그 밖의 생리학적 시험 결과로부터 strain 1401은 P.
- 5), BPA 농도 100mg/l의 경우와는 달리 배양 2일까지 균체성장의 lag phase가 확연히 관찰되었으며, 또한 BPA 분해도 배양 2일 후에급격히 이루어지는 것으로 나타났다. P. putida 1401의 균체성장은 OD600가 0.6 정도로 다른 2종의 균주보다 상당히 우수하였으며, S. marcescens 1901의 경우 OD600이 0.2 정도로 BPA 100mg/l에서 배양했을 때와 큰 차이가 없었다. BPA 분해능의 경우 S.
- Strain 1401은 염기서열이 결정된 521 bp상에서 Pseudomonas putida, P. monteilii, P. plecoglossicida와 99%의 상동성을 보였다 (Table 1). Strain 1401은 그람 음성균이고, 호기성 균주이며, 운동성이 있는 간균으로서 크기는 0.
- marcescens 1901의 경우는 배양 3일째에 BPA 분해 효율이 20-25%로 나타났으며, 그 후 별다른 BPA의 감소는 관찰되지 않았다. 결론적으로 BPA농도 100mg/l에서 S. marcescens 1901의 BPA 분해능이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
- 고농도(500mg/l)의 BPA에서 배양했을 경우(Fig. 5), BPA 농도 100mg/l의 경우와는 달리 배양 2일까지 균체성장의 lag phase가 확연히 관찰되었으며, 또한 BPA 분해도 배양 2일 후에급격히 이루어지는 것으로 나타났다. P.
- 1 이상인 균주들으 분리하였다. 그 결과, 8종의 균주가 BPA를 단일 탄소원으로 하여 생육하는 미생물로 2차 분리되었고, 대부분의 분리 균주는 PAS 배지보다는 PAV 배지에서 균체성장이 우수하였다(Fig. 1). 특히, strain 1502, 1901, 1902, 1401의 4 균주가 다른 균주들에 비해 균체성장이 우수하였으며, strain 1401의 경우 500mg/l의 BPA를 포함하는 PAV 배지에서 OD600가 0.
- KCN이 포함된 배지와 MacConkey agar에서 생육을 보였고, catalase와 oxidase활성을 나타내었으며, citrate를 이용하였으나 urea, gelatin, aesculin 분해능은 없었다. 그 밖의 생리학적 시험 결과로부터 strain 1401은 P. putida와 가장 유사한 특성을 가지고 있는 것으로 확인이 되어 P. putida로 동정되었다. 지금까지 보고된 BPA 분해미생물로는 Lobos 등(16)이 신 균주로 분리한 그람 음성의 호기성 세균인 MV1 균주와 Hirano 등 (13)의 Pleurotus ostreatus안 진균이 있다.
- 5 정도의 높은 균체성장을 보였다. 그 외의 분리 균주들은 주로 BPA농도 100mg/l에서 가장 양호한 균체 성장을 보이고 있으며, 대부분의 균주가 500mg/l BPA에서 생육 저해를 받는 것으로 나타났다. 다만, strain 14이과 1902는 500mg/l의 BPA에서 높은 균체성장을 보였기 때문에 BPA에 대한 저항성이 비교적 높은 것으로 판단된다.
- putida 1401로 혼합배양한 실험구가 가장 높은 분해 효율을 나타냈다. 그러나, 순수 배양을 통한 BPA 분해 실험에 비해 BPA 분해효율은크게 향상되지 않았으며, 선별된 3균주의 순수 배양과 혼합 배양에 의한 BPA 분해효율을 비교한 결과, 유의한 차이는 나타내지 않았다.
- 본 연구에서 선별된 균주는 500mg/l의 BPA를 3일 만에 최대 40%까지 분해할 수 있으며 500mg/l는 고농도의 BPA를 단일 탄소원으로 이용한다는 점에서 의미가 있고, BPA에 적응시킨 균주의 접종량을 증가시키면 보다 향상된 BPA 분해가 이루어질 것이라 생각한다. 이상의 결과로부터 본 연구에서 선별된 BPA 분해세균은 BPA 오염수역 및 토양의 bioremediation에 적용이 가능할 것으로 생각된다.
- 2), strain 1502, 1901, 1902, 1401의 4균주는 20-40%의 분해 효율을 나타내어 다른 균주들에 비해 BPA 분해 효율이 우수한 것으로 관찰되었다. 분리균주 1902와 1401은 BPA 100 mg/l의 농도에서 약 20%의 분해 효율을 보인 반면, 500 mg/l의 농도에서는 약 40%로 고농도의 BPA에서 분해 효율이 높게 관찰되었다. 분리균주 1901과 진균으로 확인된 1502는 BPA 농도 100 mg/l와 500 mg/l에서 모두 25% 정도의 비슷한 분해 효율을 나타내었다.
- 분리균주들을 BPA가 100 mg/l 혹은 500 mg/l의 농도로 포함된 PAV 배지에 접종하여 BPA 분해 효율을 조사한 결과(Fig. 2), strain 1502, 1901, 1902, 1401의 4균주는 20-40%의 분해 효율을 나타내어 다른 균주들에 비해 BPA 분해 효율이 우수한 것으로 관찰되었다. 분리균주 1902와 1401은 BPA 100 mg/l의 농도에서 약 20%의 분해 효율을 보인 반면, 500 mg/l의 농도에서는 약 40%로 고농도의 BPA에서 분해 효율이 높게 관찰되었다.
- 선별 균주의 동정을 위하여 16S rDNA의 염기서열 분석 방법을 이용한 결과, 선별균주 1901과 1902는 염기서열이 결정된 527 bp상에서 Serratia marcescens와 99%의 높은 상동성을 보였다 (Table 1). 선별과정에서 strain 1902는 1901과 달리 고체평판상에서 진한 적색의 집락을 형성하였기에 strain 1901과 다른 종의 균주로 생각이 되었으나, 이 결과에서는 같은 종으로 나타났다.
- 0 이상으로 하여 8시간 배양한 결과, 270mg/l 농도의 BPA를 80-90%까지 분해한다고 보고하였다. 이 결과와 비교하여 볼 때 본 연구에서 선별한 균주의 분해능이 상대적으로 낮다고 볼 수 있으나, 균주 MV1의 경우 탄소원으로 BPA 첨가방법(BPA농도를 270mg/l로 유지시킴)에서 본 연구의방법(500mg/l의 BPA첨가)과 차이를 나타내고 있으며, 초기 접종한 균체의 농도가 본 연구와 비교해서 10배 정도 높기 때문에 BPA 분해능 결과에 차이가 있다고 말할 수 있다.
- 이상의 결과로부터 strain 1901과 1902는 S. marcescem로 확인되었다.
- 분리균주 1901과 진균으로 확인된 1502는 BPA 농도 100 mg/l와 500 mg/l에서 모두 25% 정도의 비슷한 분해 효율을 나타내었다. 이상의 결과로부터 고농도 BPA에서 분해능이 우수한 strain 1902와 1401 그리고, 100mg/l의 BPA에서 분해 효율이 가장 높은 strain 1901을 본 연구의 BPA 분해균주로 최종 선별하였다.
- 그 중 29주를 500mg/l의 BPA로부터 분리하였으며, 49주는 100mg/l의 농도로부터, 나머지 9주만이 10mg/l의 BPA가 함유된 고체 배지상에서 분리되었다. 저농도(10mg/l)에서는 에너지원으로 사용되는 탄소원의 농도가 낮아 생육이 쉽게 이루어지지 않는 것으로 생각되며, 고농도(500mg/l)의 BPA는 균체 생육을 저해하는 것으로 보이고, BPA를 100mg/l의 농도로 첨가해준 실험구에서 가장 많은 미생물이 분리되었다.
- marcescens 1902는 배양 3일 만에 약 40%의 BPA 분해 효율을 나타내었다. 즉, R putida 1401과 S. marcescens 1902의 경우, 저농도보다 고농도(500mg/l)에서 BPA 분해효율이 2배 정도 우수한 것으로 나타났다.
- 최종 선별된 3 균주의 BPA에 대한 분해 특성을 조사한 결과, 각 균주들마다 저농도 혹은 고농도의 BPA를 보다 효율적으로 분해하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 이들 3 균주들을 독립적으로 BPA 분해실험에 적용하는 것보다 혼합하여 배양하는 경우가 보다 좋은 BPA 분해 효율을 나타낼 것으로 생각되어 혼합배양에 의한 BPA 분해실험을 수행하였다.
- 1). 특히, strain 1502, 1901, 1902, 1401의 4 균주가 다른 균주들에 비해 균체성장이 우수하였으며, strain 1401의 경우 500mg/l의 BPA를 포함하는 PAV 배지에서 OD600가 0.5 정도의 높은 균체성장을 보였다. 그 외의 분리 균주들은 주로 BPA농도 100mg/l에서 가장 양호한 균체 성장을 보이고 있으며, 대부분의 균주가 500mg/l BPA에서 생육 저해를 받는 것으로 나타났다.
- 6). 혼합배양의 실험구 중에서는 100 mg/l BPA 농도의 경우, S. marcescens 1901과 S. marcescens 1902를 혼합배양했을 때가 분해효율이 가장 높았고, 500 mg/l BPA 농도의 경우는 S. marcescens 1902와 P. putida 1401로 혼합배양한 실험구가 가장 높은 분해 효율을 나타냈다. 그러나, 순수 배양을 통한 BPA 분해 실험에 비해 BPA 분해효율은크게 향상되지 않았으며, 선별된 3균주의 순수 배양과 혼합 배양에 의한 BPA 분해효율을 비교한 결과, 유의한 차이는 나타내지 않았다.
후속연구
- 생각한다. 이상의 결과로부터 본 연구에서 선별된 BPA 분해세균은 BPA 오염수역 및 토양의 bioremediation에 적용이 가능할 것으로 생각된다.
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