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문제 정의
- 본 연구는 neuropeptide Y의 식욕증가 기능에 의한 식욕조절 기전을 관찰하여 보고자한다’ 특히 절식 이라는 식이조절과 식욕감퇴라는 유전적 소인 중 어느 것이 neuropeptide Y에 더 영향을 미칠 것인가를 관찰하고자 한다. 이를 위해 24시간 절식시킨 정상 생쥐와 유전적으로 식욕부진증을 가지고 태어난 돌연변이 생쥐를 대상으로 그들의 시상흐卜부에서 neuropeptide Y의 발현정도를 조직수준에서의 관찰과 분자생물학적 수준에서의 관찰인 역전사 중합효소 반응 및 닷 블롯팅을 이용하여 관찰하였다.
- 본 연구는 신경 peptide 중 식욕증가 욕구에 관여한다고 알려진 neuropeptide Y의 식욕조절 기 전을 관찰하기 위해 시도되었다. 연구방법으로는 환경적으로 24시간 절식시킨 생쥐와 유적적으로 식욕부진증을 가지고 태어난 생쥐를 대상으로 이들의 시상하부에서 neuropeptide Y 신경전달 물질의 발현 양상을 조직학적 수준에서의 관찰인 면역조직화학 법과 분자생물학적 수준에서 의 관찰인 역 전사연쇄 중합반응(RT-PCR).
제안 방법
- GAPDH와 neuropeptide Y의 primer는 Genbank에 등록된 염기서열을 참고하여 제작하였다.'RT-PCR을 정량하기 위하여 각 cycle별로 증폭하여(2L 24. 27. 30, 33. 36, 39. 42) 유효농도 곡선에 해당하는 cycle을 관찰하여 결정하였다.”'
- 05M PBS로 세척하였다. 10% gout serum, 1% bovine serum albumin(BSA) 용액과 반응시켜 비특이적 결합을 제거한 후 neuropeptide Y 1차 항체 용액 (DiaSorin, cat. No. 22940, USA) 을 상온에서 24시간 반응시켰다. PBS로 세척 후 2차 항체 용액(Vector Lab.
- Ether로 마취한 실험동물의 흉강을 열고 심장의 좌심실을 통하여 0.05M 인산염 완충식 염수(phosphate buffered saline. PBS)를 lee 주사기로 1분간 주입하여, 혈액이 완전히 제거된 후 0.1M 인산염 완충용액(phosphate buffer. PB)에 녹인 4% paraformaldehyde(PFA) 용액을 10분간 관류하였고, 관류속도는 50~60ml/min으로 하였다. 적출한 뇌를 4% PFA에 담가서 에서 12~16시간 결과 후 고정하였다.
- 내부 표준물질로느: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자 cDNA의 일부를 같은 방법으로 24회 증폭하여 neuropeptide Y 유전자 발현정도를 보정하였다. GAPDH와 neuropeptide Y의 primer는 Genbank에 등록된 염기서열을 참고하여 제작하였다.'RT-PCR을 정량하기 위하여 각 cycle별로 증폭하여(2L 24.
- xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다. Neuropeptide Y의 항체와 면역반응을 보인 신경세포나 신경섬유들은 발색제인 DAB에 의해 갈색으로 나타났으며, 이런 반응을 나타낸 신경세포나 신경섬유와 뇌 조직의 각 부위의 염색성을 광학현叫경으로 관찰하여 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos'”의 부도를 참고로 하였다.
- 22940, USA) 을 상온에서 24시간 반응시켰다. PBS로 세척 후 2차 항체 용액(Vector Lab. Inc., USA)에서 1 시간 (실온) 반응시키고 avidin-biotin peroxidase complex (Vectastain-Elite ABC kit, Vector Laboratories, Inc., USA) 용액으로 실온에서 1시간 반응 후 PBS로 세척하고 발색제 3, 3'-diaminobenzidine(DAB)으로 상온에서 5분간 발색한 후 PBS로 세척하여 발색반응을 중지시켰다. 발색이 끝난 조직은 gelatin-coated slide에 ethanol의 농도를 점차적으로 증가시켜(70~100%) 탈수하였고.
- PCRe PCR 자동화기 계 (Perkin Elmer 9600, USA)에서 template로 cDNA, Taq polymerase, dNTP, sense primer, antisense primer, 10 x buffer 및 탈■이온수를 첨가하여, 총 반응용액을 30pl로 하였다. neuropeptide Y는 94P에서 5분간 1회, 94P에서 30초, 58P에서 30초, 72P에서 30초씩 40회 반응시키고.
- 5분 후에 다시 흡착지에 남아 있는 detection agent를 세거하고 흡착지가 마른 후에 비닐 백을 열고 병-한다. Sealing뇐 비닌백을 카세드에 붙이고 X-선 필름을 2장 넣어 상온에서 15~30분간 autoradiograpl■「를 하였나、15분 후에 필름 한장을 현상하여 감광성도를 확인하고 적설한 감광시간은 결성하여 현상하였다(Gene Images CDP-star detection module. Cat. No. RPN 3510. NJ. USA).
- GAPDH. neuropeptide Y 유전자를 형광물질로 표지된 probe로 만들기 위해 각각의 cDNA로부터 일부분을 증폭하이 얻은 유전자(GAPDH 324bp, neuropeptide Y 146bp)를 gel에 길어 Gel 추출 kit(QIAEX Ⅱ. Cat. No. 20051, Germany)를 이용하여 분리정 세하였다. 이와 같이 분리 정제한 유선자를 희석하여 5분간 가열하여 변성시킨 후, 얼음에 방치하였다.
- 적출한 뇌를 4% PFA에 담가서 에서 12~16시간 결과 후 고정하였다. 고정된 뇌 조직은 조직내 결정화를 막기 위해서 30% sucrose 용액에 2~5일간 침전시킨 후 microtome(Leica, NuPloch, Germany)을 이용하여 40pm 두께로 잘라 저장액(30% glycerin, 30% ethylene glycol, 10% 0.2M PB) 에 10장씩을 냉장보관하여 사용하였다.
- 2% 한천 겔에서 전기영동하였다. 내부 표준물질로느: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자 cDNA의 일부를 같은 방법으로 24회 증폭하여 neuropeptide Y 유전자 발현정도를 보정하였다. GAPDH와 neuropeptide Y의 primer는 Genbank에 등록된 염기서열을 참고하여 제작하였다.
- 연구방법으로는 환경적으로 24시간 절식시킨 생쥐와 유적적으로 식욕부진증을 가지고 태어난 생쥐를 대상으로 이들의 시상하부에서 neuropeptide Y 신경전달 물질의 발현 양상을 조직학적 수준에서의 관찰인 면역조직화학 법과 분자생물학적 수준에서 의 관찰인 역 전사연쇄 중합반응(RT-PCR). 닷 블롯팅을 통해 관찰하였다. 연구 결과는 다음과 같다.
- 비협조적 보행 등이 뚜렷하게 나타나면서 식욕이 감소하고 체중이 같은 자손인 wild type과 heterozygous type의 반 이하로 되어 결국 출생 후 19일에서 26일 사이에 기아 상태가 되어 죽는다 顺 이러한 특징들을 기준으로 생후 3주된 이유기의 생쥐(anorexia) 중 실험군을 선별하였다. 면역조직화학법 실험에서는 식욕부진 돌연변이군 8마리, wild type을 24시간 절식시 킨 군(fasting) 8마리 , wild type 대조군(control) 8마리로 하여 이들 세 군에 대한 비교실험을 하였고, RNA 분리를 위해서 각 그룹별로 4마리씩의 동물을 배정하였다.
- 분리한 총 RNA에 역전사효소를 닣어 cDNA를 만든 후 neuropeptide Y 유전자 cDNA의 일부분을 증폭하기 위해 primer를 이용하여 PCR을 시행하여 대량으로 증폭하였다.'" 총 RNA용액과 oligodT primer를, 65℃에서 10분간 반응시킨 후에 avian myeloblastosis virus(AMV) 역전사효소, RNAasin Ipl.
- 분리한 총 RNA에서 GAPDH와 neuropeptide Y 유전자를 probe로 만들어 이들의 발현을 관찰하였다. 모든 과정에 이용되는 시약 조제 시에 탈이온수 대신에 RNase free water인 0.
- 연구방법으로는 환경적으로 24시간 절식시킨 생쥐와 유적적으로 식욕부진증을 가지고 태어난 생쥐를 대상으로 이들의 시상하부에서 neuropeptide Y 신경전달 물질의 발현 양상을 조직학적 수준에서의 관찰인 면역조직화학 법과 분자생물학적 수준에서 의 관찰인 역 전사연쇄 중합반응(RT-PCR). 닷 블롯팅을 통해 관찰하였다.
- 더 영향을 미칠 것인가를 관찰하고자 한다. 이를 위해 24시간 절식시킨 정상 생쥐와 유전적으로 식욕부진증을 가지고 태어난 돌연변이 생쥐를 대상으로 그들의 시상흐卜부에서 neuropeptide Y의 발현정도를 조직수준에서의 관찰과 분자생물학적 수준에서의 관찰인 역전사 중합효소 반응 및 닷 블롯팅을 이용하여 관찰하였다.
- PB)에 녹인 4% paraformaldehyde(PFA) 용액을 10분간 관류하였고, 관류속도는 50~60ml/min으로 하였다. 적출한 뇌를 4% PFA에 담가서 에서 12~16시간 결과 후 고정하였다. 고정된 뇌 조직은 조직내 결정화를 막기 위해서 30% sucrose 용액에 2~5일간 침전시킨 후 microtome(Leica, NuPloch, Germany)을 이용하여 40pm 두께로 잘라 저장액(30% glycerin, 30% ethylene glycol, 10% 0.
대상 데이터
- probe로 만들어 이들의 발현을 관찰하였다. 모든 과정에 이용되는 시약 조제 시에 탈이온수 대신에 RNase free water인 0.1% diethyl pyrocarbonate(DEPC) water로 사용하였다. ,
- 본 실험에 이용한 식욕부진 돌연변이 생쥐는 2번 염색체 agouti locus 20cM의 돌연변이 생쥐로, ”>Jackson La-boratory(USA)로부터 구입한 한 쌍의 heterozygous bi」 eeder(B6C3Fe~a/a~anx A/+ a, anx/)를 교배시켜 출생한 homozygous 식욕부진(anx/anx) 생쥐이다. 식욕부진 돌연변이 생쥐는 출생 7일 후부터 현저하게 성장이 저하되고 16일 경부터 비정상적인 행동인 신체진전, 과다행동.
데이터처리
- . one-way ANOVA로 검증하였고 유의성은 Tu~ key's multipe range Zest로 검정하였으며, 실험군중 두 군간의 차이는 Student's r-test로 검증하였다.
이론/모형
- RT-PCR 방법 외에 닷 블롯팅법에 의한 발현을 측정하였다(Fig. 3). 대조군과 절식군은 비슷한 발현을 보였고.
- Neuropeptide Y의 항체와 면역반응을 보인 신경세포나 신경섬유들은 발색제인 DAB에 의해 갈색으로 나타났으며, 이런 반응을 나타낸 신경세포나 신경섬유와 뇌 조직의 각 부위의 염색성을 광학현叫경으로 관찰하여 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos'”의 부도를 참고로 하였다. NPY 면역반응도는 영상분석기(image analyser) 를 이용하여 동일 부위에서 일정하게 나타난 염색성의 징도를 명도에 따른gray scale값을 측성하였고 밝기의 변화를 석절하게 측정할 수 있는 전압을 5volt로 정하여 이후 모든 :工룹의 측정하고자 흐卜는 부위의 영상분석을 하였나、측정된 염색성의 성도는 0에서 255의 수치로 표현하였다.
- 면역조직화학넙에 의한 조식학적인 관찰 외에 mRNA 수준에서 관찰하기 위하이 RT-PCR 법을 이용하여 시상하부 선체의 mRNA의 양을 정 량하였다. Fig.
- 면역조직화학법은 이전에 보고된 방법인 자유부유법(在对 floating method)을 이용하였다.*" 관찰하고자하는 부위의 조직절편을 0.
- 면역조직화학법을 이용하여 대조군. 절식군.
성능/효과
- 2) 분자생물학적 방법인 RT-PCR과 dot-blotting에 의해 선체 시상하부에 존재하는 neuropeptide Y mRNA을 측정한 결고k 설식군은 대조근과 비슷한 반현정도를 보였고■. 식욕부진 돌연변이군은 대조구에 비해 감소하는 경향을 보였다.
- '" Pages 등空은 48시 간. 72시간을 절식시킨 후에 뇌의 cortex, hippocampus, striatum 세부분의 neuropeptide Y 수준을 조사한 결과 48시간 절식시킨 군에서 cortex에서 증가하였고, striatum에서는 감소하였으며. 72시간 절식시킨 군에서는 그 증가율이 더 유의적 이었다고 보고하고 있다.
- 05, Table 1). 또한 절식군의 경우 식욕부진 돌연변이 군보다 neuropeptide Y 발현이 통계적 유의성은 없으나 더 낮은 경향을 보였다. PVN 영역에서는 실험군간의 차이를 나타내지 않았다.
- 또한 Jahng 등"도 식욕부진돌연변이 생쥐의 ARC 영역에서 neuropeptide Y 발현이 감소하였다고 보고하였다. 본 연구도 다른 연 殆들과 비슷한 경향으로 나타났으며, 이러한 결과들로 미루어 볼 때, 식욕부진 돌연변이 생쥐군에서 neuropeptide Y 발현 감소가 유전적으로 식욕부진증을 나타내는 원인이 되는 것으로 사료뇐다. 식욕부진 돌연변이 생쥐의 mRNA 수준을 RT-PCR법이나 닷 블롯팅법을 이용하여 양적。-로 측정한 연구는 없었으므로 본 연구가 스)욕-부진 돌-연변이 생쥐에서 neuropeptide Y mRNA의 관련 여부를 더 정확히 추정할 수 있었다.
- 이러한 연구결과로 볼 때. 본연구에서 절식시킨 생쥐의 조직학적 관찰에서 neuropeptide Y가 증가되지 않고 분자생물학적 관찰에서도 대조군과 비숫한 경향을 보인 이유는 본 연구에 이용된 식욕부진 돌연변이 생쥐의 유전적인 특성상 4주내에 죽기 때문에 절식시킨 생쥐의 절식기간을 24시간으로 제한한 결과로 사료된다.
- 식욕과 관련된 시상하부의 다른 신경영역에 관한 많은 연구가 수행되었고 그 결과 시상하부의 신경영역들은 서로 다른 역할을 담당하여 ARC와 LHA 영역은 주로 섭식과 포만의 신호를 생성하고, VMN, DMN, SCN 영역은 생성되거나 분비된 신호를 적절하게 조절하며, PVN 영역은 섭식과 포만의 신호가 작용하는 영역인 것이 밝혀졌다.”
- 시상하부에서 특히 PVN영역에서 fajfa와 在/-쥐 모두 neuropeptide Y 농도감소가 관찰되었다. 이 실험 결과 식욕억제 신경전달물질인 serotonin과 neuropeptide Y 신경세포가 시상하부에서 상호작용하여 식욕기 전을 에너지 의 항상성유지 에 기여 한다는 것을 증명하였다.
- 이상의 결과를 요약하면 시상하부 여러 영역에서의 neuropeptide Y 발현은 부위에 따라 다양하게 나타났으벼、대조구에 비해 식욕부진 돌연변이 생쥐에서 neuropeptide Y mRNA 발현이 감소된 깃으로 叫루어 보아 식욕부진 돌연변이 생쥐의 식욕조절에 영향을 E 친 것으로 사让뇐다.
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