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문제 정의
- 본 연구는 식물의 잎권에 콜로니를 형성하고 있는 생물막 및 잎 표면 세균과 분리용 용액에 부유하고 있는 잎표면세균을 직접 관찰하는데 있어 효과적인 형광염료 선정 그 염색법을 확립하고 이렇게 확립된 형광현미경 관찰법을 사용하여 잎표면세균을 계수하는 것이다.
가설 설정
- 2개의 시료에 대하여 시료 당 30 field의 세균수를 센 후 이를 산술 평균하여 총 세균수를 계산하였으며 효모나 균류로 보이는 세포는 모두 제외하였다. 총 세균수는 잎의 양쪽 면에 균일하게 분포하는 것으로 가정하고 cells/cm2 단위로 나타내었다.
제안 방법
- 음파분리는 1분 동안 3회. 30초 간격으로 실시하였다(5) 음파분리용액을 따라내어 다른 용기에 보관하고 남은 잎 조각이 들어 있는 용기에 인산완충용액 50 ㎖을 추가로더 넣어 같은 방법으로 음파분리를 재실시하였다. 얻어진 2개의 음파분리용액을 완전 혼합한 후 10 ㎖의 시료를 Sudan Black B 로 염색된 polycarbonate 여과지(지름 25 mm, 구멍 크기 0.
- 이를 극복하기 위하여 시료 건조시간 및 현미경 관찰시간을 최소화하였다. 따라서 염색된 잎 시료의 수분을 빨리 제거하기 위하여 시료를 거름종이 위에 올려놓고 수분을 흡수시키는 한편 공기 중에서 5분 동안 말리던 것을 70℃의 건조기에서 2분 동안 말리는 방법을 사용하였다. 이 방법은 건조시간을 줄여 줄뿐만 아니라 잎에시 수분이 용출되어 나오는 시간을 늦게 해주는 효과도 있는 것으로 확인되었다.
- 이렇게 DAP1 의 염색법은 시료의 종류에 따라 크게 다르므로 잎권에 가장 적합한 염색법을 개발할 필요가 있는 것이다. 본 연구에서 사용되는 잎은 물에 비하여 형광을 방해하는 배경물질이 많기 때문에 오염된 연안해수와 퇴적토의 직접관찰에 적용되었던 5.0 ㎍/ml 용액에 5분 동안 염색하는 것을 기본으로 하고 이 농도의 절반인 2.5 ㎍/ml에 대해서도 실험을 실시하였다. 한편 Fischer 등(3)은 소택지에서 자라는 사상녹조류 표면의 부착세균에서 분리한 I6S rDNA의 염기서열을 가지고 계통분류를 실시하여 부착세균군집구조를 확인하였는데 이때 녹조류 세포를 DAPI로 염색한 결과 부착세균이 효과적으로 분리된 것으로 확인하였다.
- 앞에서 확립된 잎표면세균의 형광현미경 관찰법을 적용하여 1998년 4월 대전대학교 교내 떡갈나무 잎을 대상으로 잎표면 세균을 계수하였는데 2개의 잎 조각 시료에 대하여 각각 30 field 에서 센 세균수를 산술 평균하였다. 그 결과 떡갈나무 잎 표면에는 0.
- 30초 간격으로 실시하였다(5) 음파분리용액을 따라내어 다른 용기에 보관하고 남은 잎 조각이 들어 있는 용기에 인산완충용액 50 ㎖을 추가로더 넣어 같은 방법으로 음파분리를 재실시하였다. 얻어진 2개의 음파분리용액을 완전 혼합한 후 10 ㎖의 시료를 Sudan Black B 로 염색된 polycarbonate 여과지(지름 25 mm, 구멍 크기 0.22 ㎛)로 여과한 다음 각각의 여과지를 2.5 및 5.0 /jg/ml DAPI 용액에 담구어 5분 동안, 그리고 0.05% AO 용액에는 3분 동안 담구어 염색한 후 인산완충용액으로 세척하여 여과지를 공기 중에서 말렸다. 이런 방법으로 각 염색법 당 2개씩 모두 6개의 여과지를 얻은 동일한 염색법이 적용된 2개의 여과지를 같은 slide glass에 올려놓고 cover slip으로 덮고서 관찰하였다.
- 2)에 담구어 잎을 3번 세척하였다. 이 잎 시료를 각각- 2.5 및 5.0 flg/ml DAPI 용액에 담구어 5분 동안, 그리고 0.05% AO 용액에 담구어 3분 동안 염색한 다음 인산완충용액에 담구어 세척하고 공기중에서 말린 다음 각각 2개씩의 잎 시료를 slide glass에 올려놓고 cover slip으로 덮은 다음 cover slip 주위를 접착 테이프를 붙여 slide glass와 고정시켰다.
- 05% AO 용액에는 3분 동안 담구어 염색한 후 인산완충용액으로 세척하여 여과지를 공기 중에서 말렸다. 이런 방법으로 각 염색법 당 2개씩 모두 6개의 여과지를 얻은 동일한 염색법이 적용된 2개의 여과지를 같은 slide glass에 올려놓고 cover slip으로 덮고서 관찰하였다.
- 즉 공기 중 건조는 현미경 관찰 시작 후 5분 이내에 잎에서 물방울이 용출되어 30개의 field 관찰이 불가능하였던 반면 건조기로 건조된 잎 시료는 10분 이상이 지나도 물방울이 용출되지 않아 30개의 field 관찰이 가능하였다. 이렇게 건조기에서 건조된 잎 시료는 즉시 slide glass 위에 고정시킨 후 바로 형광현미경으로 관찰하였다. 이 런 방법으로 준비된 시료에서 관찰된 잎표면세균은 공기 중에서 말린 시료에 비하여 현미경 상이 더욱 뚜렷하였으며 물방울 용출시간을 지연시켜 더 오랜 시간동안 현미경 관찰이 가능하였다.
- 잎표면세균의 분리를 위해서 인산완충용액으로 3회 세척한 떡갈나무 잎 10개(한 면의 평균 표면적은 75 cn『)를 멸균한 가위로 1 X 1 cm 크기로 자른 후 멸균된 인산완충용액 50 ㎖에 담구어 음파를 조사하였다. 음파분리는 1분 동안 3회.
- 잎표면세균의 직접관찰법을 확립하기 위해서 잎에 붉은 색을띤 장미 잎과 붉은 색이 전혀 없이 녹색인 떡갈나무 잎을 대상으로 하여 3가지 염색법을 비교 관찰하였다. 먼저 장미 잎의 경우 AO 0.
- dentata) 잎을 대상으로 실험하였다. 잎표면세균의 직접관찰을 위해서 멸균한 가위로 두 종류의 잎을 1.0X0.5 cm 크기로 자른 다음 여과멸균된 인산완충용액(10 mM, pH 7.2)에 담구어 잎을 3번 세척하였다. 이 잎 시료를 각각- 2.
- 형광현미경 (Axioskop 50, Carl Zeiss, Germany) 관찰은 DAPI 시료의 경우 1번 필터를, AO 시료의 경우 9번 필터를 이용하였으며 1600X의 배율로 관찰하여 나타나는 형광 상을 서로 비교하였다.
대상 데이터
- 1999년 4월에 채취한 장미(Rosa hybrida) 잎과 떡갈나무 (Quercus dentata) 잎을 대상으로 실험하였다. 잎표면세균의 직접관찰을 위해서 멸균한 가위로 두 종류의 잎을 1.
- 안 등(1)은 밤나무 잎에서 잎권세균을 분리시킨 용액을 0.05% AO로서 7분간 염색하여 밤나무 잎표면의 총 세균수를 계수하였고, Morris 등(11)은 상추, 시금치, 배추와 같은 야채 잎을 0.01% AO로서 2분간 염색하여 잎표면의 생물막을 성공적으로 관찰한바 있으며, Mercier와 Lindow(lO)는 콩, 옥수수, 오이와 같은 농작물의 잎에 배양한 Pseudomonas fluorescent 접종한 후 잎에 부착한 세균을 관찰하는데 역시 AO로서 염색한 바 있기 때문에 본 연구에서도 AO를 실험 대상으로 삼았다. 본 연구에서는 잎 표면에서 부착생장하는 세균을 계수하는 것이 주 목적으로 세포 외 중합체 (EPS, extracellular polymeric substances)와 같은 생물 막 구성성분의 배경형광을 최대한 줄이기 위하여 Herbert(5)가 제시한 3분의 AO 염색시간을 적용하였다.
이론/모형
- 01% AO로서 2분간 염색하여 잎표면의 생물막을 성공적으로 관찰한바 있으며, Mercier와 Lindow(lO)는 콩, 옥수수, 오이와 같은 농작물의 잎에 배양한 Pseudomonas fluorescent 접종한 후 잎에 부착한 세균을 관찰하는데 역시 AO로서 염색한 바 있기 때문에 본 연구에서도 AO를 실험 대상으로 삼았다. 본 연구에서는 잎 표면에서 부착생장하는 세균을 계수하는 것이 주 목적으로 세포 외 중합체 (EPS, extracellular polymeric substances)와 같은 생물 막 구성성분의 배경형광을 최대한 줄이기 위하여 Herbert(5)가 제시한 3분의 AO 염색시간을 적용하였다. Fry(4)는 AOS 염색된 세균은 주로 연녹색의 형광을 띠며 주황색의 형광을 띠는 세균의 수는 5% 미만이라고 하였지만 본 연구에서는 AO로 염색된 잎 표면 세균 가운데 연녹색을 띤 것은 전혀 없이 모두가 주황색을 띰으로써 배경과의 구별이 거의 불가능하였다.
- 잎 표면에 부착생장하는 총 세균수의 직접계수는 가장 형광 상이 뚜렷하고 세균의 확인이 가능한 염색법을 사용하였으며 떡갈나무 잎을 대상으로 하였다. 2개의 시료에 대하여 시료 당 30 field의 세균수를 센 후 이를 산술 평균하여 총 세균수를 계산하였으며 효모나 균류로 보이는 세포는 모두 제외하였다.
성능/효과
- 결론적으로 본 연구에서 용액 속으로 분리된 잎권세균을 여과한 여과지의 형광현미경 관찰을 위해서는 DAPI 5.0 ㎍/ml의 농도로 5분 동안 염색한 후 세척과정을 거치지 않고 바로 공기 중에서 말려 slide glass에 올려놓고 관찰 계수하는 방법이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 센 세균수를 산술 평균하였다. 그 결과 떡갈나무 잎 표면에는 0.05% AO로 염색하였을 때는 평균 4.55X 103, 2.5 Rghnl DAPI로 염색하였을 때는 2.08X105, 그리고 5.0 flg/ml DAPI로염색하였을 때는 평균 3.80X 105 cells/cn?의 세균이 존재하는 것으로 나타남으로써 (Table 1) DAPI에 의한 염색법이 AO에 비하여 우수한 것으로 나타났다. 여기서 DAPI에 의한 총세균수는 안 등⑴이 1996년과 1997년 사이에 채취한 공단지역 및 청정지역 밤나무 잎에서 분리한 용액을 여과한 여과지를 AO로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 평균 총세균수(AODC)인 9.
- 1A, D)에 비하여 뚜렷한 현미경 영상을 나타내어 계수가 가능하였다. 그러나 DAPI로 염색한 여과지의 세균이 AO로 염색한 시료보다 더 뚜렷한 형광을 나타내었으며. 5.
- 더구나 총 세균수를 세기 위해서는 30개의 filed를 관찰하여야 하는데 A0가 내는 붉은 색의 형광은 DAPI의 푸른 색 형광에 비하여 눈의 피로를 쉽게 가져오기 때문에 그만큼 관찰하는데 노력과 시간이 더 많이 들었다. 따라서 잎표면세균을 형광현미경으로 직접 관찰하여 총세균수를 세기 위해서는 5.0 ㎍/ml 용액에서 5분 동안 염색하는 방법이최적인 것으로 판단되었다.
- 떡갈나무 잎에 음파(sonication)를 쬐어 잎권세균을 인산 완충용액 속으로 분리한 후 이 용액을 여과시킨 여과지를 앞에서 결정한 3종류의 염색법으로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과 잎 표면의 직접관찰 때와는 달리 모든 염색법에서 여과지 표면의 세균이 배경과는 뚜렷이 구별되는 형광을 나타냄으로써 쉽게 관찰할 수 있었다(Fig. 2). AO로 임색한 여과지의 세균(Fig.
- 나타났다. 또한 AO보다는 DAPI의 현미경 영상이 더 뚜렷하여 세균 관찰이 용이하였다. 더구나 총 세균수를 세기 위해서는 30개의 filed를 관찰하여야 하는데 A0가 내는 붉은 색의 형광은 DAPI의 푸른 색 형광에 비하여 눈의 피로를 쉽게 가져오기 때문에 그만큼 관찰하는데 노력과 시간이 더 많이 들었다.
- 용액 속에 분리된 세균의 간접 계수치는 사용된 분리방법에 따라 달라진다(8, 12). 많이 사용되는 분리 방법으로는 본 연구에서 사용된 음파분리(sonication) 외에 분 ifl(grinding, blending), 분쇄기계(Stomacher Lab-Blender)를 이용한 stomacher blending, 세척 (washing) 의 4가지가 있는데 Donegan 등(2)이 이 4가지 방법의 분리효율을 콩과 귀리의 잎을 이용하여 실험한 결과 잎권세균의 분리효율의 우수성은 stomacher blending>grinding>sonication>washing의 순으로 나타났다. 이 실험에서 가장 분리효율이 우수한 stomacher blending은 본 연구에서 사용한 음파분리의 3.
- 하지만 stomacher blending은 잎표면세균은 물론 잎내부세균까지도 검출될 수 있으므로 잎표면세균만을 세는 본 연구목적에는 음파분리가 최적인 것으로 판단된다. 실제로 본 연구에서 음파분리의 효율을 측정하기 위하여 음파조사에 의하여 잎표면세균의 분리가 일어난 잎 표면을 5.0 jUg/m/ DAPI로 염색하여 관찰한 결과 잎표면세균수가 8.55 X 103 cells/cn?로서 분리 전의 총세균수인 3.80X 105 cells/ cm?의 2% 정도에 불과하여 (Table 1) 우리가 사용한 음파 분리 방법의 효율이 아주 좋은 것으로 나타났다.
- 55 X 103 cells/cn?로서 분리 전의 총세균수인 3.80X 105 cells/ cm?의 2% 정도에 불과하여 (Table 1) 우리가 사용한 음파 분리 방법의 효율이 아주 좋은 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고 여과지 위의 세균수가 훨씬 적게 검출된 것은 잎표면세균의 분리과정에서 잎 표면에 존재하는 많은 다른 물질도 같이 분리되어 여과지 위에 걸러지기 때문에 이러한 방해물질에 의해 관찰되는 세균수가 실제보다 훨씬 적은 것으로 보인다.
- 0 flg/ml DAPI로염색하였을 때는 평균 3.80X 105 cells/cn?의 세균이 존재하는 것으로 나타남으로써 (Table 1) DAPI에 의한 염색법이 AO에 비하여 우수한 것으로 나타났다. 여기서 DAPI에 의한 총세균수는 안 등⑴이 1996년과 1997년 사이에 채취한 공단지역 및 청정지역 밤나무 잎에서 분리한 용액을 여과한 여과지를 AO로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 평균 총세균수(AODC)인 9.
- 따라서 염색된 잎 시료의 수분을 빨리 제거하기 위하여 시료를 거름종이 위에 올려놓고 수분을 흡수시키는 한편 공기 중에서 5분 동안 말리던 것을 70℃의 건조기에서 2분 동안 말리는 방법을 사용하였다. 이 방법은 건조시간을 줄여 줄뿐만 아니라 잎에시 수분이 용출되어 나오는 시간을 늦게 해주는 효과도 있는 것으로 확인되었다. 즉 공기 중 건조는 현미경 관찰 시작 후 5분 이내에 잎에서 물방울이 용출되어 30개의 field 관찰이 불가능하였던 반면 건조기로 건조된 잎 시료는 10분 이상이 지나도 물방울이 용출되지 않아 30개의 field 관찰이 가능하였다.
- 많이 사용되는 분리 방법으로는 본 연구에서 사용된 음파분리(sonication) 외에 분 ifl(grinding, blending), 분쇄기계(Stomacher Lab-Blender)를 이용한 stomacher blending, 세척 (washing) 의 4가지가 있는데 Donegan 등(2)이 이 4가지 방법의 분리효율을 콩과 귀리의 잎을 이용하여 실험한 결과 잎권세균의 분리효율의 우수성은 stomacher blending>grinding>sonication>washing의 순으로 나타났다. 이 실험에서 가장 분리효율이 우수한 stomacher blending은 본 연구에서 사용한 음파분리의 3.9배였다. 하지만 stomacher blending은 잎표면세균은 물론 잎내부세균까지도 검출될 수 있으므로 잎표면세균만을 세는 본 연구목적에는 음파분리가 최적인 것으로 판단된다.
- 이렇게 AO와 DAPI를 가지고 잎을 형광염료로 염색하여 현미경으로 잎표면을 직접 관찰한 결과 AO를 적용할 수 있는 식물은 제한된 반면 DAPI는 거의 모든 종류의 식물에 적용 가능한것으로 나타났다. 또한 AO보다는 DAPI의 현미경 영상이 더 뚜렷하여 세균 관찰이 용이하였다.
- 1A). 이와는 달리 DAPI는 세균의 형광이 배경과 뚜렷이 구별됨으로써 세균을 쉽게 확인하고 계수할 수 있었다(Fig. IB, C). 특히 5.
- 잎 시료의 음파조사를 통하여 용액 속으로 분리한 후 polycarbonate 여과지에 걸러진 세균을 형광 염색하여 잎 표면 세균을 간접적으로 계수한 결과 평균 1.84X 105 cells/cm2의 세균이 존재하는 것으로 확인되었다(Table 1). 이는 직접계수된 잎 표면세균수의 약 48%에 해당한다.
- 이 방법은 건조시간을 줄여 줄뿐만 아니라 잎에시 수분이 용출되어 나오는 시간을 늦게 해주는 효과도 있는 것으로 확인되었다. 즉 공기 중 건조는 현미경 관찰 시작 후 5분 이내에 잎에서 물방울이 용출되어 30개의 field 관찰이 불가능하였던 반면 건조기로 건조된 잎 시료는 10분 이상이 지나도 물방울이 용출되지 않아 30개의 field 관찰이 가능하였다. 이렇게 건조기에서 건조된 잎 시료는 즉시 slide glass 위에 고정시킨 후 바로 형광현미경으로 관찰하였다.
- IB, C). 특히 5.0 ㎍/ml DAPI 농도에서는 2.5 ㎍/ml에 비하여 세균의 형광이 한층 더 강하여 배경과의 뚜렷이 구별됨으로써 가장 좋은 현미경 상을 얻을 수 있었다(Fig. 1C). 그리고 떡갈나무 잎은 장미잎과는 달리 AO로 염색한 경우에도 세균이 배경과 구별되는 뚜렷한 주황색의 형광을 강하게 띠어 직접관찰이 가능하였다(Fig.
- 9배였다. 하지만 stomacher blending은 잎표면세균은 물론 잎내부세균까지도 검출될 수 있으므로 잎표면세균만을 세는 본 연구목적에는 음파분리가 최적인 것으로 판단된다. 실제로 본 연구에서 음파분리의 효율을 측정하기 위하여 음파조사에 의하여 잎표면세균의 분리가 일어난 잎 표면을 5.
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