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가설 설정
- b: white line formitng organisms.
- d: bacterium which dosen't have hemolitic activity.
- d: bacterium which dosen't have hemolytic activity.
제안 방법
- tolaasii의 오염을 조사하였다. 또한 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopye; CLSM)29,30)을 이용하여 신선한 버섯의 조직 관찰3"2)과 자연 갈변되었을 때 의 조직 관찰 그리고 P. tolaasii^ 의해 오염되는 갈변병 버섯의 조직을 시간 경과에 따라 비교 관찰하였다.
- 25 mM CaCl2를 함유한 Hepes buffered saline(150mM NaCl, 5 mM KC1, 5 mM Hepes, 1 mM MgSO4 per liter, pH 7.4) 4 ml와 defibrinated sheep blood(Korea Media) 0.5 ml, 세포 배양 여과액 0.5 ml를 첨가하여 멸균된 test에 넣고 항온수조에서 1~2시간 방치한 후 상층액을 취하여 spectrophotometer(DU-650, Beckman, U.S.A)로 600 nm에서 흡광도를 측정하여 용혈활성을 조사하였다.
- 병원성 검정을 위한 방법으로 browning-pitting test24~26)를 실시하였으며 양송이 버섯 자실체를 이용하였다. Petri dish 안에 멸균수로 적신 여과지를 넣어 습실 상태의 조건을 만 들어 준 후 양송이 버섯의 갓조직을 여과지 위에 넣고 배양한 분리 세균의 현탁액(6× 107~109 CFU/ml) 20)11를 버섯 갓의 표면에 접종하여 25℃ 배양기에 두면서 24시간 간격으로 갈변과 버섯조직의 함몰 여부를 조사하였다.
- 본 연구에서는 Pseudomonas tolaasii ATCC 51309, WLRO 16-1C, WLRO 502-3(G-23)를 충북대학교 농생물학과에서 분양받아 실험에 사용하였다. White line test(8, 15, 24)는 분리된 균주와 분양받은 WLRO (WLRO 16-1C, WLRO 502-3(G-23))를 Pseudomonas Agar F 평판배지 위에서 1~2 cm 간격을 두고 streak 한 후 25℃에서 24시간 정도 배양했을 때 분리균주와 WLRO사이에 흰색침강선(white line)이 형성하였는지를 조사하였으며, 그 결과 WLRO를 선발하였다. 변패된 느타리버섯에서의 분리균주에서의 WLRO는 분양받은 P.
- 느타리버섯에 p. tolaasii 107× 108 CFU/tnl를 인위적으로 2시간 동안 접종하여 부착을 시킨 후 시간 경과에 따른 변 패 모습을 CLSM으로 관찰하였고 Fig. 5과 같다. 또한 대조 구로서 염색을 하지 않은 느타리의 자실체에 같은 조작으로 P.
- tolaasii가 접종된 후 0, 3, 10, 20시간마다 버섯자실체를 멸균된 칼로 1 × 1 cm?로 잘라내어 조직을 슬라이드 글라스 위에 올려두 고 커버 글라스로 덮은 후 테이프로 고정시켰다. 공초점 레이저 현미경(CLSM)의 RGB방법으로 100x10배율, 512 X512 픽셀에서 버섯 조직은 488 nm(522DF32 filter)에서 녹색 형광의 영상을 광학적 절편화(optical sectioning)하여 관찰하였다.
- 수분이 제거된 버섯 조직 단편을 슬라이드 글라스 위에 놓고 버섯 조직 주위를 단편의 두께만큼 두꺼운 종이로 간격을 준 후 커버 글라스를 덮고 테이프로 고정하였다. 그리고 공초점 레이저 현미경 (CLSM, MRC-1024, BioRad Inc., Hemel hempstead, England)을 이용하여 100 × 10 배율, 512 X512 픽셀 상태로 488 nm(522DF32 filter)에서 광학적 절 편화(optical sectioning)와 수직적 절편화(vertical sectioning)하여 버섯의 조직을 비교 관찰하였다.
- tolaasii는 PAF(Difco, Maryland, USA)에서 48시간 동 안 진탕배양(25℃, 200 rpm)하였다. 그리고 신선한 버섯의 자실체를 0.1% A0S 염색한 후 3-4회 수세하고 풍건한 다음 배양된 P. tolaasii를 2시간동안 접종하였다. P.
- 병원성 Pseudomonas spp.는 느타리버섯을 오염시키는 주 된 원인균이므로 분리된 병원성 균주에서 선발하여 그 toxin의 생성과 tolaasin의 용혈 특성과의 비교 실험을 실시하였다. 병원성 28 strains를 처리하여 조제한 세포 배양 여과액을 신선한 버섯 자실체에 접종한 결과 16 strains만이 병징 을 나타내었다.
- )를 실시하고 그 후 세균세포를 제거하고 상충 액 만을 분리 , 막여과(0.45 Jim)를 통하여 여과하여 조제하였 다. 다음 세포 배양 여과액을 버섯의 자실체 표면에 0.5 ml 정도 접종하여 조직의 갈변과 함몰 여부를 조사하였다.
- 독소 생성을 검정하고자 하는 균의 세포 배양 여과액을 신선한 버섯에 접종하여 조사하였다8). 우선 세포 배양 여과 액은 선발된 균을 KB에 접종하여 48시간동안 진탕배양 (25 ℃, 200 rpm)한 후 25℃에서 9000 ipm으로 30분 동안 원 심분리(micro high speed centrifuge, VS-15000CFN, Vision Scientific Co.
- 5과 같다. 또한 대조 구로서 염색을 하지 않은 느타리의 자실체에 같은 조작으로 P. tolaasii를 접종하여 육안으로 보이는 버섯조직과 CLSM을 통한 조직의 변화를 함께 관찰하였다. 균을 접종하고 3 시간이 지나 대조구에서 연한 갈변의 증상을 나타났을 때 같은 시간의 처리구의 버섯 조직 관찰에서는 조직 변화에서는 신선한 버섯의 조직이나 2시간 동안 균 부착했을 때의 관찰 된 사진과 큰 차이가 보이지 않았다.
- 본 연구에서는 시장에서 유통중인 느타리버섯의 갈변병을 일으키는 병원성 Pseudomonas spp.를 조사하고 각 세균의 세포 지방산 조성에는 차이가 있다는 사실에 근거하여 미생 물 신속 동정기를 이용함으로 그 지방산을 분석하고 동정하 였으며 느타리 갈변병의 치명적인 병징을 나타내는 P. tolaasii의 오염을 조사하였다. 또한 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopye; CLSM)29,30)을 이용하여 신선한 버섯의 조직 관찰3"2)과 자연 갈변되었을 때 의 조직 관찰 그리고 P.
- 미생물의 동정을 위한 전처리는 KB에서 순수 배양된 각각의 선발균을 trypticase soy broth agar(TSBA, Difco, Mary land, USA) 평판배지에 streak하여 28℃에서 24시간 동안 배양하고 harvest, saponification, methylation, extraction, base wash의 5단계 과정을 실시하였다. Saponification은 reagent l(NaOH 45 g/methanol 150m]/D.
- White line test(8, 15, 24)는 분리된 균주와 분양받은 WLRO (WLRO 16-1C, WLRO 502-3(G-23))를 Pseudomonas Agar F 평판배지 위에서 1~2 cm 간격을 두고 streak 한 후 25℃에서 24시간 정도 배양했을 때 분리균주와 WLRO사이에 흰색침강선(white line)이 형성하였는지를 조사하였으며, 그 결과 WLRO를 선발하였다. 변패된 느타리버섯에서의 분리균주에서의 WLRO는 분양받은 P. tolaasii^- white line test를 같은 방법으로 실시하여 white line 형성여부를 조사하였다.
- 1% acri dine orange (AO, sigma)를 이용하여 30초간 염색한 후 2~3회 수세하고 풍건하여 조직내 수분을 완전히 제거하였다. 수분이 제거된 버섯 조직 단편을 슬라이드 글라스 위에 놓고 버섯 조직 주위를 단편의 두께만큼 두꺼운 종이로 간격을 준 후 커버 글라스를 덮고 테이프로 고정하였다. 그리고 공초점 레이저 현미경 (CLSM, MRC-1024, BioRad Inc.
- 12~2월, 3~5월, 6~9월로 기간을 나누어 각기 다른 농산물 시장에서 변패된 느타리버섯을 수집하여 갈변병의 원인균 주의 1차 분리에 사용하였다. 수집된 갈변병의 느타리버섯에 서 변패된 부위를 잘라내어 멸균 pak에 0.85% 생리식염수와 함께 넣고 실온에서 30분동안 stomacherfStomacher 400, Seward, England)로 마쇄한 후 단계별 희석하여 King's mediun B(KB, BBL, Cockeysville, Maryland, USA) 평판배지에 도말하였으며, 25℃에서 24~48시간 배양하여 오염균 주를 분리하였다. 순수 분리된 세균은 nutrient broth(NB, BBL, Cockeysville, Maryland, USA)와 20% glycerol(Shinyo pure chemical Co.
- W 900 ml)를 넣고 5분. 정도 교반한 후 유기층만을 재분리하였다.
- 각 시료는 gas chromatography# 이용하여 지방산에 대한 각 peak의 정성 . 정량 데이터를 얻고 microbial identifica tion system(MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Delaware U.S.A)의 sherlock software내의 있는 표준미생물의 library의 fatty acid profiles과 비교하여 자동적으로 data화함으로 써 미생물을 동정하였다. GC는 hewlett-packard 6890 series로 capillary column (ultra2, nonpolar fused silica, 23m-dia- meter x 0.
대상 데이터
- 12~2월, 3~5월, 6~9월로 기간을 나누어 각기 다른 농산물 시장에서 변패된 느타리버섯을 수집하여 갈변병의 원인균 주의 1차 분리에 사용하였다. 수집된 갈변병의 느타리버섯에 서 변패된 부위를 잘라내어 멸균 pak에 0.
- 본 연구에서는 Pseudomonas tolaasii ATCC 51309, WLRO 16-1C, WLRO 502-3(G-23)를 충북대학교 농생물학과에서 분양받아 실험에 사용하였다. White line test(8, 15, 24)는 분리된 균주와 분양받은 WLRO (WLRO 16-1C, WLRO 502-3(G-23))를 Pseudomonas Agar F 평판배지 위에서 1~2 cm 간격을 두고 streak 한 후 25℃에서 24시간 정도 배양했을 때 분리균주와 WLRO사이에 흰색침강선(white line)이 형성하였는지를 조사하였으며, 그 결과 WLRO를 선발하였다.
- 재래시장에서 유통되는 느타리 버섯중 변패된 것을 수집하여 버섯의 오염균주를 125 strains 분리하였고 Table 1에 나타내었다. 재배사의 경우 버섯에서의 갈변병의 피해는 주로 겨울철에 발병율이 높고 피해도가 큰 것으로 조사된 바 있다6, 33).
이론/모형
- 병원성 검정을 위한 방법으로 browning-pitting test24~26)를 실시하였으며 양송이 버섯 자실체를 이용하였다. Petri dish 안에 멸균수로 적신 여과지를 넣어 습실 상태의 조건을 만 들어 준 후 양송이 버섯의 갓조직을 여과지 위에 넣고 배양한 분리 세균의 현탁액(6× 107~109 CFU/ml) 20)11를 버섯 갓의 표면에 접종하여 25℃ 배양기에 두면서 24시간 간격으로 갈변과 버섯조직의 함몰 여부를 조사하였다.
성능/효과
- 노쇠한 버섯의 조직은 Geels旳가 SEM으로 관찰한 결과와 같이 균사가 건조한 상태가 되고 균사의 부피가 많이 감소한 경향이 관찰되었다. CLSM을 이용한 관찰에서 버섯 조직의 높이 변화를 optical sectioning을 통하여 입체적인 영상을 획득했으며, 수직단면영상(Fig. 4)도 힘께 얻을 수 있었다.
- fluorescens biotype C로 동정이 되었다. WLRO의 동정 결과에서 분리 균주 535와 910-1 은 P. fluorescens biotype A이지만 각각 병원성과 비병원성을 나타내었다. Table 5에서의 동정 결과를 보면 white line을 형성하지 않았는데 P.
- 하지만 WLRO의 경우 병원성을 나타내었던 3 strains 중 하나는 세포 배양 여과액의 접종시 48 시간이 지나도 아무런 증상이 나타나지 않았고 2 strains은 갈변의 병징을 나타내었다. WLRO의 용혈활성은 600nm에 서 흡광도를 측정해본 결과 WLRO의 비병원성인 3 strains는 1.00 정도였으며 병원성이었던 3 strains는 0.9-1.0 사이의 수치를 나타내었다. WLRO가 분비하는 "IP는 적혈구에 대한 colloid osmotic lysis와 biosurfMctant의 특성을 가지고 있지만 버섯 조직내에는 아무런 병징을 나타내지 않는다는 연구보고8)에서 볼 때 WIR0가 비병원성 임에도 대조 구와의 흡광도의 차이는 WLIP에서 기인된다고 볼 수 있겠다.
- 신선한 버섯의 실모양으로 길게 이어진 개개의 균사(hypha)가 모여서 느슨한 다발모양으 로 배열된 균사체(mycelium)의 섬유균사조직(prosenchyma)이 선명하게 나타났으며, 또한 균사가 접합된 모습과 굵은 균사가 가는 균사에 엉켜있는 모습이 나타나있었다. 노쇠한 버섯의 조직은 Geels旳가 SEM으로 관찰한 결과와 같이 균사가 건조한 상태가 되고 균사의 부피가 많이 감소한 경향이 관찰되었다. CLSM을 이용한 관찰에서 버섯 조직의 높이 변화를 optical sectioning을 통하여 입체적인 영상을 획득했으며, 수직단면영상(Fig.
- 하지만 유인성분의 다른 화합물과 그 특징은 아직 연구 중에 있다. 또한 결과를 살펴보면 P. tolaasii는 병원성을 나타냈지만 white line을 형성하지 못한 83, 1521-2의 2 strains와 약한 병징을 나타냈지만 세포 배양 여과액을 접종하였을 때 병징이 나타나지 않은 141, 409, 604의 3 strains 그리고 병원성 균주의 선발에서 도 병원성을 나타내지 않았던 602, 81의 2 strains가 나타나 있는데 이때의 tolaasin은 균의 밀도와 pH 변하, 온도, toxin의 세포막 용해를 저해하는 Zn'2 등의 2가 양이온 등에 의해 그 활성이 변화8,17,20)하므로 저해되거나 상실된 것으로 추정이 된다.
- 이었고, WLRO균 중 비병원성 3 strain도 fluorescent pigment를 형성하였으며 다음 Table 2에 나타내었다. 발병 초기인 연한 갈변의 병징이 있던 버섯에서는 병원성 균주가 많았던 반면 조직 함몰과 변패취가 강했던 발병 후기의 버섯에서는 부생균과 비병원성 균주의 분리가 많았다. 분리된 병원성 45 strains를 버섯에 접종한 후 20분 이내에 brow ing, pitting 현상이 강하게 나타난 균주가 6 strains로 나타났으며 10시간 정도 경과하여 7 strains 이 두 가지 현상이 모두 나타났고 그 외의 25 strains는 연한 갈변~암갈색 병징을 나타냈다.
- 분리된 125 strains를 병원성 검정하기 위해 Fig. 1에서와 같이 browning pitting test를 실시하였고 그 결과 48 strains가 병원성이 있는 것으로 나타났다. 하지만 계대하는 중에 3 strains는 병원성을 잃었고 최종적으로 병원성 있는 균주는 45 strains 이었으며 이들 중 27 strains는 KB평판 배지에서 fluorescent pigment를 형 성 하는 Pseudomonas spp.
- 발병 초기인 연한 갈변의 병징이 있던 버섯에서는 병원성 균주가 많았던 반면 조직 함몰과 변패취가 강했던 발병 후기의 버섯에서는 부생균과 비병원성 균주의 분리가 많았다. 분리된 병원성 45 strains를 버섯에 접종한 후 20분 이내에 brow ing, pitting 현상이 강하게 나타난 균주가 6 strains로 나타났으며 10시간 정도 경과하여 7 strains 이 두 가지 현상이 모두 나타났고 그 외의 25 strains는 연한 갈변~암갈색 병징을 나타냈다.
- 3에 나타내었다. 신선한 버섯의 실모양으로 길게 이어진 개개의 균사(hypha)가 모여서 느슨한 다발모양으 로 배열된 균사체(mycelium)의 섬유균사조직(prosenchyma)이 선명하게 나타났으며, 또한 균사가 접합된 모습과 굵은 균사가 가는 균사에 엉켜있는 모습이 나타나있었다. 노쇠한 버섯의 조직은 Geels旳가 SEM으로 관찰한 결과와 같이 균사가 건조한 상태가 되고 균사의 부피가 많이 감소한 경향이 관찰되었다.
- 동정된 WLFO는 세포 배양 여과액을 신선한 버섯에 접종한 후 20 분내에 갈변 내지 흑변과 조직의 괴저를 나타내었다. 용혈 활성 실험에서도 대조구와의 흡광도 1.23를 비교했을 때 현저하게 낮은 수치인 0.8~0.9로 나타나 tolaasin의 적혈구 용혈 특성을 확인할 수 있었다. 하지만 WLRO의 경우 병원성을 나타내었던 3 strains 중 하나는 세포 배양 여과액의 접종시 48 시간이 지나도 아무런 증상이 나타나지 않았고 2 strains은 갈변의 병징을 나타내었다.
- 균을 접종하고 3 시간이 지나 대조구에서 연한 갈변의 증상을 나타났을 때 같은 시간의 처리구의 버섯 조직 관찰에서는 조직 변화에서는 신선한 버섯의 조직이나 2시간 동안 균 부착했을 때의 관찰 된 사진과 큰 차이가 보이지 않았다. 하지만 10시간이 지나 서 대조구의 버섯은 암갈색의 색택과 조직이 허물어지는 증상이 나타났고 CLSM에서의 관찰에서는 균사체의 엉겨있는 모습과 균사의 형태 모두가 희미해지고 균사의 그 부피가 신선한 상태에 비해 많이 감소하는 경향이 있었다. 그리고 접 종한 균은 조직내로 침투가 되어 관찰이 어려웠다.
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