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문제 정의
- 이러한 방법은 난자뿐만 아니라 배반포 배아에도 적용 가능하여 임상적 적용을 통한 임신 성공을 보고한 바 있다 (Choi 등, 2001). 따라서 본연구에서는 저자들에 의해 개발된 인간 난자동결법의 임상적 응용가능성을 확인하기 위해 시험관아기 시술과정에서 성숙난자의 수가 8개 이상인 경우 잉여의 난자를 환자의 동의하에 유리화 냉동보존을 실시하고 신선주기에서 임신에 실패하였을경우 이들 냉동보관된 난자를 해동하여 임신에 시도하는 연구를 실시하였다. 총 26명의 환자에 대해 370개의 잉여난자를 채취하여 유리화 냉동보존을 실하였는데 이를 해동한 결과 생존율은 43.
- 3%인 134개의 난자가 정상수정이 일어났다. 수정을 위해 ICSI 방법을 선택한 것은 일부의 연구보고에서 지적한 바와 같이 난자의 냉동과 해동과정에서 나타날 수 있는 과립 막 세포의 조기방출에 의한 투명대 경화현상에 따른 수정율 저하를 방지하기 위해 실시하였다. 수정이 이루어진 배아를 2〜3일간 추가배양하여 배 발생을 위도한 결과 8개의 배아를 제외한 126개의 배아가 적어도 2-세포기 이상 난할이 이루어져 배아 이식이 가능하였다.
- 저자 등은 기존의 완만동결법을 대신하는 유리화 난자동결보존법을 개발하여 보고한 바가 있고 또한 배반포 배아에 대해서도 임상적 적용을 시도하여 성공한 예가 있다 (Hong 등, 1999, Chung 등, 2000,Choi 등, 2001). 이에 본 연구에서는 저자들에 의해 보고된 유리화 난자동결보존법을 시험관아기시술을 실시한 불임환자를 대상으로 임상직용을실시하여 임신과 분만에 성공하였기에 보고한다.
제안 방법
- 골라 ICSI를 시행하였다. ICSI 시행후 12 〜18시간째에 난자를 관찰하여 수정여부를 판정하였으며 수정된 난자는 P-1 배양액 하에서 3일간 배양하여 난할을 유도하였다. 정상적인 난할이 이루어진2- 8세포기 배아는 acid Tyrode 용액을 이용한 보조부화술 (assisted hatching)을 시 행 한 다음 환자의자궁에 이식함으로써 임신을 유도하였다.
- 난자의 해동은 냉동보관중인 EM grid를 l.OM, 0.5M, 0.25M 및 0.125M sucrose (Sigma, USA) 가 함유된 DPBS용액에 각각 2.5분 간격으로 순차적으로침지한 다음 마지막으로 0M sucrose가 함유된 DPBS용액에 침지하고 pipetting방법을 통해 EM grid상에 부착되어 있는 난자-난구세포 복합체를 분리하였다. 분리된 난자 난구세포 복합체는 37℃ CO2 배양기에 넣어 30분-1시간동안 배양한 다음 현미 경하에서 난자의 상태를 확인하였고 0.
- 난자동결 보존을 위해서 유리화 난자동결법을이용하였다. 먼저 0.1% hylauronidase용액에 난자를 침지하고 pipetting을 실시하여 난자에 부착된난구세 포 3〜 5층 정 도만을 남기 도 나머 지 난구 세포를 제 거 하였다. 3〜5층의 난구세포에 둘러싸인난자-난구세포 복합체 (oocyte-cumulus cell com- plex)는 신선 P-1 배양액으로 세척한 다음 유리화 난자동결에 이용하였다.
- 3〜5층의 난구세포에 둘러싸인난자-난구세포 복합체 (oocyte-cumulus cell com- plex)는 신선 P-1 배양액으로 세척한 다음 유리화 난자동결에 이용하였다. 먼저 난자-난구세포 복합체는 1.5M ethylene glycol (이하 EG; Sigma, USA) 이 함유된 DPBS용액 (Gibco/BRL, USA)에 37℃ 에서 2.5분간 침지한 다음 이어 5.5M EG가 함유된 DPBS용액으로 옮겨 20초간 침지하므로서 항동해제 처리를 실시하였다. 이어 난자-난구복합체는 즉시 pipet을 이용하여 멸균 거어즈상에 있는 400mesh의 electron microscope grid (이하 EM grid;Gilder, USA)에 옮긴 다음 핀셑으로 난자-난구복합체와 함께 있는 동결용액을 제거하고 즉시 액체질소에 침지함으로써 유리화 동결을 실시하였다.
- 5분 간격으로 순차적으로침지한 다음 마지막으로 0M sucrose가 함유된 DPBS용액에 침지하고 pipetting방법을 통해 EM grid상에 부착되어 있는 난자-난구세포 복합체를 분리하였다. 분리된 난자 난구세포 복합체는 37℃ CO2 배양기에 넣어 30분-1시간동안 배양한 다음 현미 경하에서 난자의 상태를 확인하였고 0.1% hyaluronidase 용액에 침지하여 난구세포를 제거한 다음 난세포질 상태를 관찰하여 난자의 생존 여부를 확인하였다.
- 신선주기에서 성숙난자의 채취가 8개 이상인 환자로서 잉여난자에 대해 유리화 난자동결보존을 실시한 환자중 임신에 실패한 총 26명의 불임 환자로 부터 370개의 난자에 대해 유리화 난자동결 및 해동과 배아이시을 시행하였다. 총 370개의 유리화 냉동 난자를 해동한 결과 159개의 난자가 해동 후 형 태 학적으로 정상을 나타내 어 생존율은 43.
- 연구에 참여한 26명의 환자들의 난소자극은GnRH agonist (Buserilin acetate, Hoechst, Ger- many)와gonadotropin (FSH와 hMG)을 이용한 long protocol을 통해 난소자극을 시행하였으며 매일 초음파 검사와 혈중 E2 농도를 측정하면서 난포의 성장을 관찰하였다. 초음파상에 직경 17mm 이상의 dominat follicle이 2개 이상 관찰되었을 때 gonadotropin 투여를 중단한 다음 10, 000IU의 hCG를 주사한 다음 34〜36시간째에 난자채취를 시행하였다.
- 5M EG가 함유된 DPBS용액으로 옮겨 20초간 침지하므로서 항동해제 처리를 실시하였다. 이어 난자-난구복합체는 즉시 pipet을 이용하여 멸균 거어즈상에 있는 400mesh의 electron microscope grid (이하 EM grid;Gilder, USA)에 옮긴 다음 핀셑으로 난자-난구복합체와 함께 있는 동결용액을 제거하고 즉시 액체질소에 침지함으로써 유리화 동결을 실시하였다. 유리화 동결보존된 난자는 냉동보관용 용기 (cryo- vial, 1, 8ml; Nunc, Denmark)에 넣어 해동시 까지보관하였다.
- 정상적인 난할이 이루어진2- 8세포기 배아는 acid Tyrode 용액을 이용한 보조부화술 (assisted hatching)을 시 행 한 다음 환자의자궁에 이식함으로써 임신을 유도하였다. 임신의 확인은 배아이식후 12 74일경에 혈중 HCG 농도로 결 정 하였으며 임 신 4〜6주경 에 초음파상으로태낭과 심 장박동으로 재차 확인하였다.
- 경우 실시하였다. 자연주기 혹은 hormone replacement therapy (HRT)로서 자궁내막 주기를맞춘 환자에게 배란일에 난자를 해동하였다. 난자의 해동은 냉동보관중인 EM grid를 l.
- ICSI 시행후 12 〜18시간째에 난자를 관찰하여 수정여부를 판정하였으며 수정된 난자는 P-1 배양액 하에서 3일간 배양하여 난할을 유도하였다. 정상적인 난할이 이루어진2- 8세포기 배아는 acid Tyrode 용액을 이용한 보조부화술 (assisted hatching)을 시 행 한 다음 환자의자궁에 이식함으로써 임신을 유도하였다. 임신의 확인은 배아이식후 12 74일경에 혈중 HCG 농도로 결 정 하였으며 임 신 4〜6주경 에 초음파상으로태낭과 심 장박동으로 재차 확인하였다.
- 흡입된 난포액은 즉시 연구실로 보내져서 난구세포-난자 복합체를 선별하여 신선 P-1 배양액 (Irvine Scienctific, USA)으로 3회 세척한 다음 난자의 성숙상태를 관찰하고37℃ COj 배양기 (Heraeus, Germany)에 넣어 배양하였다. 채취된 난자중 성숙난자의 수가 8개 이상인 경우 환자의 동의하에 잉여의 난자는 유리화 난자동결보존을 실시 하였다.
- 성장을 관찰하였다. 초음파상에 직경 17mm 이상의 dominat follicle이 2개 이상 관찰되었을 때 gonadotropin 투여를 중단한 다음 10, 000IU의 hCG를 주사한 다음 34〜36시간째에 난자채취를 시행하였다.
- 해동이 완료된 난자는 현미경하에서 생존 여부를 확인함과 동시에 난자의 성숙정도를 관찰하여 성숙 난자의 경우2〜4시간내에 정자세포질내 직접주입법 (intracytoplasmic sperm injection; 이하ICSI)을 통해 수정을 유도하였으며 성숙과정 인 난자의 경우 8〜12시간 그리고 난핵포기 난자의 경우 24~48시 간 동안 추가배 양을 통해 체 외 성숙을 유도한 다음 저]1극체의 방출이 일어난 성숙 난자만을 골라 ICSI를 시행하였다. ICSI 시행후 12 〜18시간째에 난자를 관찰하여 수정여부를 판정하였으며 수정된 난자는 P-1 배양액 하에서 3일간 배양하여 난할을 유도하였다.
대상 데이터
- 1% hylauronidase용액에 난자를 침지하고 pipetting을 실시하여 난자에 부착된난구세 포 3〜 5층 정 도만을 남기 도 나머 지 난구 세포를 제 거 하였다. 3〜5층의 난구세포에 둘러싸인난자-난구세포 복합체 (oocyte-cumulus cell com- plex)는 신선 P-1 배양액으로 세척한 다음 유리화 난자동결에 이용하였다. 먼저 난자-난구세포 복합체는 1.
- 포천중문의 과대 학교 차병원 여성 의학연구소에 내원한 정상 난소기능을 나타내었던 불임환자 26 명을 대상으로 하였으며 이들 환자의 평균연령은 33.4세, 불임기간은 4.7년이었다.
이론/모형
- 난자동결 보존을 위해서 유리화 난자동결법을이용하였다. 먼저 0.
- 난자채취는 질식초음파를 이용한 난자흡입 방법으로 난포를 흡입하였다. 흡입된 난포액은 즉시 연구실로 보내져서 난구세포-난자 복합체를 선별하여 신선 P-1 배양액 (Irvine Scienctific, USA)으로 3회 세척한 다음 난자의 성숙상태를 관찰하고37℃ COj 배양기 (Heraeus, Germany)에 넣어 배양하였다.
성능/효과
- 3%)의 난자가 정상적인 수정을 나타내었으며 이중 배아의 형태가 극히 않좋거나 발생이 정지된 8개의 배아를 제외한 126개의 배아를 26명의 환자에 이식할 수 있었다. 배아이식후 혈중 HCG 및 초음파 검사등을 통해 임시을 확인한 결과 5명 (19.2%)에서 임신이 확인되었으며 착상율은 4.0% (5/126)로 나타났다. 2002년 1월 현재 임신된 5명의 환자중 4명은 정상적으로 건강한 아기를 출생하였으며 1명은 현재 임신 32주로서 특별한 이상징후 없이 건강한 상태로 임신중에 있다.
- 이전의 Hong등 (1999)의 결과와 비교할 때 다소 저조한 생존율이긴 하지만 잉여난자의 질과 상관없이 모두 냉동보존한 점을 고려한다면 그리 저조한 결과는 아니라고 판단된다. 생존한 냉동 배아를 남편의 정액을 채취하여 ICSI 방법으로 수정을 유도한 결과 생존한 난자의 84.3%인 134개의 난자가 정상수정이 일어났다. 수정을 위해 ICSI 방법을 선택한 것은 일부의 연구보고에서 지적한 바와 같이 난자의 냉동과 해동과정에서 나타날 수 있는 과립 막 세포의 조기방출에 의한 투명대 경화현상에 따른 수정율 저하를 방지하기 위해 실시하였다.
- 수정을 위해 ICSI 방법을 선택한 것은 일부의 연구보고에서 지적한 바와 같이 난자의 냉동과 해동과정에서 나타날 수 있는 과립 막 세포의 조기방출에 의한 투명대 경화현상에 따른 수정율 저하를 방지하기 위해 실시하였다. 수정이 이루어진 배아를 2〜3일간 추가배양하여 배 발생을 위도한 결과 8개의 배아를 제외한 126개의 배아가 적어도 2-세포기 이상 난할이 이루어져 배아 이식이 가능하였다. 배아이식 직전에.
- 0% 의 생존율을 나타내었다. 이들 난자에 대해 ICSI 방법을 이용하여 수정을 유도한 결과 134개 (84.3%)의 난자가 정상적인 수정을 나타내었으며 이중 배아의 형태가 극히 않좋거나 발생이 정지된 8개의 배아를 제외한 126개의 배아를 26명의 환자에 이식할 수 있었다. 배아이식후 혈중 HCG 및 초음파 검사등을 통해 임시을 확인한 결과 5명 (19.
- 배아이식 직전에.이식한 배아의 착상을 위해 acid Tyrode 용액을 이용한 보조부화술을 시행한 다음 실시하였고 총 26명의 이식환자 중 5명에서 혈중 HCG와 초음파상의 태낭과심박동이 관찰되어 19.2%의 임신성공율을 나타내었다. 이때 착상율은 임신 5명 모두에서 단태임신이 관찰되어 착상율은 4.
- 따라서 본연구에서는 저자들에 의해 개발된 인간 난자동결법의 임상적 응용가능성을 확인하기 위해 시험관아기 시술과정에서 성숙난자의 수가 8개 이상인 경우 잉여의 난자를 환자의 동의하에 유리화 냉동보존을 실시하고 신선주기에서 임신에 실패하였을경우 이들 냉동보관된 난자를 해동하여 임신에 시도하는 연구를 실시하였다. 총 26명의 환자에 대해 370개의 잉여난자를 채취하여 유리화 냉동보존을 실하였는데 이를 해동한 결과 생존율은 43.0%였다. 이전의 Hong등 (1999)의 결과와 비교할 때 다소 저조한 생존율이긴 하지만 잉여난자의 질과 상관없이 모두 냉동보존한 점을 고려한다면 그리 저조한 결과는 아니라고 판단된다.
- 배아이시을 시행하였다. 총 370개의 유리화 냉동 난자를 해동한 결과 159개의 난자가 해동 후 형 태 학적으로 정상을 나타내 어 생존율은 43.0% 의 생존율을 나타내었다. 이들 난자에 대해 ICSI 방법을 이용하여 수정을 유도한 결과 134개 (84.
후속연구
- 따라서 본연 구진에 의해 개발된 인간 유리화 동결법은 배아 동결보존의 대안으로 적절히 이용될 수 있다고 사료된다. 다소 저조한 생존율을 극복할 수 있는 세포골격 기관 안정제의 처리나 배발생 증진방안 등이 보완될 수 있다면 인간 및 동물 생식의학에 있어 매우 경제적이고 편리한 동결보존술이 될 것으로 예측된다.
- 2002년 1월 현재임신된 5명중 4명은 정상분만을 통해 건강한 아기가 출생하였으며 1명은 현재 임상적으로 아무런 이상 없이 임신 32주를 진행하고 있다. 따라서 본연 구진에 의해 개발된 인간 유리화 동결법은 배아 동결보존의 대안으로 적절히 이용될 수 있다고 사료된다. 다소 저조한 생존율을 극복할 수 있는 세포골격 기관 안정제의 처리나 배발생 증진방안 등이 보완될 수 있다면 인간 및 동물 생식의학에 있어 매우 경제적이고 편리한 동결보존술이 될 것으로 예측된다.
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