선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 PAP-U 가 지니고 있는 항바이러스능을 이용하기 위해 결손돌연변이를 제작하여 세포독성이 없는 유전자를 연초 내로 도입하여, PVY-VA에 대한 항 바이러스능의 발현을 나타내는 식물체를 생산하고자 하였다. 이를 위해 먼저 RT-PCR 방법으로 미국자리공 잎에서 PAP-n cDNA를 클로닝하고, 염기서열을 분석한 뒤, PAP-H cDNA 가닥을 식물발현벡터에 삽입시켜 미국자리 공의 항바이러스 단백질 유전자의 세포독성이 없는 유전자를 효모 발현벡터 시스템을 이용하여 확인한 후 Agrobacterium tumefacience LBA4404 균을 이용하여 연초 식물체에 형질전환시키고 바이러스 저항성이 발현되는지 여부를 알아보았다.
- 이렇게 항 바이러스능을 갖고 있는 식물체로부터 종자를 채종하여 보관하면서 재파종하여 후대 검정을 실시하고 있다. 이때 저항성이 돌연변이 PAP-Ⅱ cDNA의 도입에 의한 효과인지를 확인해 보고자 genomic Southern blot analysis를 실시 하였던 바, 본 연구에서 무독성으로 결정지어졌던 PAP-Ⅱ cDNA가 검출되었다.
제안 방법
- N-terminal 쪽으로부터 순차적으로 결손이 이루어진 PAP cDNA 가닥을 인위적으로 합성해내기 위한 5'쪽과 3'쪽에 대한 primer를 자체 design한 것을 사용하였으며, 이를 핵산합성기를 사용하여 합성 및 순수분리하였다. Immature PAP 상태의 C-terminal 쪽의 가닥을 지니고 있는 단백질과 mature PAP 상태의 C-terminal 쪽의 아미노산 서열을 지닐 수 있도록 제작된 cDNA 가닥들을 PCR 반응에 의하여 합성하였다. PCR에 의하여 합성된 가닥을 분리 정제하였으며, pBluescript Ⅱ SK-로 subcloning 하였다(Fig.
- N-terminal 쪽으로부터 순차적으로 결손이 이루어진 PAP cDNA 가닥을 인위적으로 합성해내기 위한 5'쪽과 3'쪽에 대한 primer를 자체 design한 것을 사용하였으며, 이를 핵산합성기를 사용하여 합성 및 순수분리하였다. Immature PAP 상태의 C-terminal 쪽의 가닥을 지니고 있는 단백질과 mature PAP 상태의 C-terminal 쪽의 아미노산 서열을 지닐 수 있도록 제작된 cDNA 가닥들을 PCR 반응에 의하여 합성하였다.
- 합성된 PAP-Ⅱ cDNA 가닥의 염기서열을 분석한 결과 PAP-Ⅱ cDNA를 클로닝하기 위해 사용한 primer 부위를 포함하여 974bp가 확인되었다.PAP-Ⅱ cDNA 가 성공적으로 클로닝 된 후에 mature PAP의 세포독성에 의해 식물체가 괴사하는 것을 방지하기 위하여 세포독성은 없애고 항바이러스능은 유지하는 클론을 얻기 위하여 N-terminal로부터 90 bp씩 순차적으로 deletion 된 돌연변이 cDNA를 얻었다.
- PAP-Ⅱ cDNA를 미국자리공(PhytoJacca americana) 잎으로부터 RT-PCR 방법으로 클로닝하였다.
- 미국자리공(F/iytoZacca americana) 잎으로부터 acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform 추출법을 사용하여 total RNA 를 분리하여 본 결과 PAP-I 과 비교하여 PAP-Ⅱ가 양적으로도 많은 차이가 나지 않음을 알 수 있었다.PAP-Ⅱ cDNA를 얻기 위하여 primer와 total RNA 로부터 cDNA synthesis kit를 이용하여 합성한 1st strand cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 합성된 PAP-Ⅱ cDNA 가닥의 염기서열을 분석한 결과 PAP-Ⅱ cDNA를 클로닝하기 위해 사용한 primer 부위를 포함하여 974bp가 확인되었다.
- Immature PAP 상태의 C-terminal 쪽의 가닥을 지니고 있는 단백질과 mature PAP 상태의 C-terminal 쪽의 아미노산 서열을 지닐 수 있도록 제작된 cDNA 가닥들을 PCR 반응에 의하여 합성하였다. PCR에 의하여 합성된 가닥을 분리 정제하였으며, pBluescript Ⅱ SK-로 subcloning 하였다(Fig. 6)
- SDS-PAGE analysis 및 Western blot analysis 를 통하여 단백질의 위치를 확인하였고 미국자리공의 total RNA를 분리하였으며 RT-PCR에 의해 PAP-Ⅱ cDNA 를 합성하였다. 합성된 PAP-Ⅱ cDNA의 subcloning 및 염기서열을 분석하였고 이 후 PCR에 의한 결손 돌연변이를 제작하여 PCR 산 물의 정제를 하였으며 PAP-n cDNA의 식물발현 벡터내로의 재조합 및 확인, 돌연변이 PAP-H 클론의 세포독성 검정등을 통하여 세포독성이 제거된 클론에 대하여 agrobacterium 형질전환을 하여 식 물체를 형질전환 하였다.
- 돌연변이 PAP-Ⅱ cDNA insert 를 포함하는 pKGTIOlBH 플라스미드 DNA를 A. tumefaciens에 형질전환하여 담배식 물의 형질전환에 이용하였다.A.
- 미국자리공 전체에서 생산되는 total protein을 대상으로 Western blot hybridization을 시행하여 항혈청이 immuno blot analysis에 성공적으로 사용 될 수 있음을 확인하였으며 미국자리공과 한국자생자리공의 PAP의 생산을 알아보았다.(Fig.
- 세포독성이 없어진 클론을 식물발현 벡터인 pKGTIOlBH 벡터에 삽입하여 Agrobacterium tumefacience를 이용하여 식물로 형질전환을 시도 하였다. 형질전환을 하여 실험실내에서 shoot와 뿌리의 생장이 양호한 식물체를 선발하여 온실과 자연상태에서 생육하며 발육상태를 관찰하여 본 결과 재배상에 문제가 없음을 확인하였다.
- 염기서열 결정에 의한 amino acid 분석을 gene bank를 통하여 분석하였다(Fig. 5).
- 본 연구에서는 PAP-U 가 지니고 있는 항바이러스능을 이용하기 위해 결손돌연변이를 제작하여 세포독성이 없는 유전자를 연초 내로 도입하여, PVY-VA에 대한 항 바이러스능의 발현을 나타내는 식물체를 생산하고자 하였다. 이를 위해 먼저 RT-PCR 방법으로 미국자리공 잎에서 PAP-n cDNA를 클로닝하고, 염기서열을 분석한 뒤, PAP-H cDNA 가닥을 식물발현벡터에 삽입시켜 미국자리 공의 항바이러스 단백질 유전자의 세포독성이 없는 유전자를 효모 발현벡터 시스템을 이용하여 확인한 후 Agrobacterium tumefacience LBA4404 균을 이용하여 연초 식물체에 형질전환시키고 바이러스 저항성이 발현되는지 여부를 알아보았다.
- SDS-PAGE analysis 및 Western blot analysis 를 통하여 단백질의 위치를 확인하였고 미국자리공의 total RNA를 분리하였으며 RT-PCR에 의해 PAP-Ⅱ cDNA 를 합성하였다. 합성된 PAP-Ⅱ cDNA의 subcloning 및 염기서열을 분석하였고 이 후 PCR에 의한 결손 돌연변이를 제작하여 PCR 산 물의 정제를 하였으며 PAP-n cDNA의 식물발현 벡터내로의 재조합 및 확인, 돌연변이 PAP-H 클론의 세포독성 검정등을 통하여 세포독성이 제거된 클론에 대하여 agrobacterium 형질전환을 하여 식 물체를 형질전환 하였다. 형질전환된 식물체에 virus를 인공접종하여 항바이러스능 검정을 하고 여기에서 저항성으로 나오는 개체에 대하여 genomic Southern blot analysis를 통하여 삽입여 부를 확인하였다.
- 합성된 PAP-Ⅱ cDNA의 subcloning 및 염기서열을 분석하였고 이 후 PCR에 의한 결손 돌연변이를 제작하여 PCR 산 물의 정제를 하였으며 PAP-n cDNA의 식물발현 벡터내로의 재조합 및 확인, 돌연변이 PAP-H 클론의 세포독성 검정등을 통하여 세포독성이 제거된 클론에 대하여 agrobacterium 형질전환을 하여 식 물체를 형질전환 하였다. 형질전환된 식물체에 virus를 인공접종하여 항바이러스능 검정을 하고 여기에서 저항성으로 나오는 개체에 대하여 genomic Southern blot analysis를 통하여 삽입여 부를 확인하였다.
- 효모를 이용한 세포독성 확인시스템에서 사용할 효모 발현벡터인 pAc55M 을 재조합하였는 너 h pAc55의 크기가 약 10 kb 정도 되므로 pBluscript n sk-와 재조합할 경우 크기가 커서 다루기 용이 하지 않은 이유로 pAc55에 원래 지니고 있는 multicloning site를 pBSⅡ SK-의 것으로 대체하여 재조합된 pAc55M을 재조합하게 되었다. 이에 대한 여러 가지 제한효소들을 사용하여 절단해 보았을 때 MCS가 기능을 하는 정상벡터가 합성되었음을 알 수 있었다(Fig.
대상 데이터
- tumefaciens에 형질전환하여 담배식 물의 형질전환에 이용하였다.A. tumefaciens의 균주로는 LBA4404를 이용하였 으며 담배품종 NC567에 접종하여 형질전환시켰다 (Fig. 9).
- 봄 철부터 싹이 트기 시작하여 여름에 왕성하게 성장 하였다가 가을이 되면 종자를 맺는 다년생 초본식 물이다. 균주는 INV a F', psyl, Agrobacterium tumefaciens LBA4404등을 사용하였으며 plasmid 는 pBluescript H SK-, pAc55, pAc55M, pKGTIOlBH, pBH21 을 사용하였다. 식물바이러스는 PVY-VN을 비롯하여 TMV-common, pepper, tomato, PVX, CMV-K등을 본 연구원 온실에서 식물을 길러 직접 순화정제하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 자리공식물체는 미국에서 자생하는 식물로서, 우리나라에 들어온 귀화식물인 미 국자리공 (Phytolacca americana) 은 잎이 넓고 길며 종자는 약 60° 전후로 아래를 향하고 있다. 봄 철부터 싹이 트기 시작하여 여름에 왕성하게 성장 하였다가 가을이 되면 종자를 맺는 다년생 초본식 물이다.
- 균주는 INV a F', psyl, Agrobacterium tumefaciens LBA4404등을 사용하였으며 plasmid 는 pBluescript H SK-, pAc55, pAc55M, pKGTIOlBH, pBH21 을 사용하였다. 식물바이러스는 PVY-VN을 비롯하여 TMV-common, pepper, tomato, PVX, CMV-K등을 본 연구원 온실에서 식물을 길러 직접 순화정제하여 사용하였다. 순화한 바이러스를 실험용 토끼 (New Zealand White, male)에 주사하여 항체생산을 하여 이를 Immunoblot analysis에 사용하였다.
이론/모형
- 미국자리공과 한국자생 자리공의 total RNA를 acid guanidium thiocyanate - phenol -chloroform 추출법을 사용하여 분리하고 전기영동을 실행하였다(Fig. 3).
- 식물바이러스는 PVY-VN을 비롯하여 TMV-common, pepper, tomato, PVX, CMV-K등을 본 연구원 온실에서 식물을 길러 직접 순화정제하여 사용하였다. 순화한 바이러스를 실험용 토끼 (New Zealand White, male)에 주사하여 항체생산을 하여 이를 Immunoblot analysis에 사용하였다.
성능/효과
- 12% SDS-PAGEf- 시행하여 미국자리공의 PAP 에 대한 생산부위별 전기영동을 실행하여 본 결과 PAP-I, Ⅱ, S 모두 약 29 KDa 의 크기를 보여주고 있으며 (Fig. 1) coomassie brilliant blue 250 R로- 염색한 후에 확인하여 이와 똑같은 g이을 Western blot hybridization에 사용하였다.
- 또한, PAP는 식물체가 성숙하였을 때 매우 독성이 강하여 동, 식물의 DNA 전사 과정에서 리보소 옴을 inactivation 시켜 세포증식이 되지 못하게 하는 독성 물질이다. PAP의 종류별로 많이 만들어지는 부위로는 첫째, PAP-I은 자리공의 식물체 전체에서, PAP-1I 는 뿌리 부분에서, PAP-S는 종자에서 각각 가장 많이 생산되고 있음이 확인되었다.
- PVY 고도 저항성 형질전환 식물체에서 genomic DNA를 분리한 후 primer를 사용하여 Southern blot analysis를 실행한 결과 저항성 식물체에 형질 전환한 mutant PAP-Ⅱ 유전자가 존재함을 확인하 였으며 이것은 deletion mutant가 삽입된 크기별로 다르게 나타났다.다(Fig.
- RT-PCR에 의해 합성된 PAP- n cDNA 가닥을 pBluescript Ⅱ SK- Smal 위치에 subcloning하고, dideoxy sequencing 방법에 의하여 염기서열을 분석한 결과, 개시 및 종결 codon을 합하여 933bp인PAP- Ⅱ open reading frame (ORF)을 포함하는 974bp의 PAP- n cDNA 가닥을 확인하였다(Fig. 4).
- (1996).미국자리공(F/iytoZacca americana) 잎으로부터 acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform 추출법을 사용하여 total RNA 를 분리하여 본 결과 PAP-I 과 비교하여 PAP-Ⅱ가 양적으로도 많은 차이가 나지 않음을 알 수 있었다.PAP-Ⅱ cDNA를 얻기 위하여 primer와 total RNA 로부터 cDNA synthesis kit를 이용하여 합성한 1st strand cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- sk-와 재조합할 경우 크기가 커서 다루기 용이 하지 않은 이유로 pAc55에 원래 지니고 있는 multicloning site를 pBSⅡ SK-의 것으로 대체하여 재조합된 pAc55M을 재조합하게 되었다. 이에 대한 여러 가지 제한효소들을 사용하여 절단해 보았을 때 MCS가 기능을 하는 정상벡터가 합성되었음을 알 수 있었다(Fig. 7, 8).
- PAP-Ⅱ cDNA를 얻기 위하여 primer와 total RNA 로부터 cDNA synthesis kit를 이용하여 합성한 1st strand cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 합성된 PAP-Ⅱ cDNA 가닥의 염기서열을 분석한 결과 PAP-Ⅱ cDNA를 클로닝하기 위해 사용한 primer 부위를 포함하여 974bp가 확인되었다.PAP-Ⅱ cDNA 가 성공적으로 클로닝 된 후에 mature PAP의 세포독성에 의해 식물체가 괴사하는 것을 방지하기 위하여 세포독성은 없애고 항바이러스능은 유지하는 클론을 얻기 위하여 N-terminal로부터 90 bp씩 순차적으로 deletion 된 돌연변이 cDNA를 얻었다.
- 세포독성이 없어진 클론을 식물발현 벡터인 pKGTIOlBH 벡터에 삽입하여 Agrobacterium tumefacience를 이용하여 식물로 형질전환을 시도 하였다. 형질전환을 하여 실험실내에서 shoot와 뿌리의 생장이 양호한 식물체를 선발하여 온실과 자연상태에서 생육하며 발육상태를 관찰하여 본 결과 재배상에 문제가 없음을 확인하였다. 재배에 어려움이 없는 식물체에 본 연구에서 원하는 PVY-VW에 대하여 저항성을 갖고 있는지 확인하기 위해 mechanical infection을 시켜 보았을 때 2개의 식물에서 고도의 저항성을 지니는 연초식물 이 탄생하게 되었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.