[논문]지렁이 꼬리재생시 재생아의 형태발생에 관한 연구

조성진; 이명식; 허소영; 신명주; 박순철

문제 정의

따라서 본 연구는 지렁이 꼬리재생시 진재생과정에서 필수적으로 일어나야 하는 재생아의 형성과정과 그 기원을 조직학적으로 규명하고자 한다.
지렁이가 재생기작을 연구하기 위한 새로운 모델로 제시되기 위해서는 이 동물이 수행하는 재생이 분화된 세포에서 이루어지는 것이 아니라 탈분화된 재생아세포로부터 이루어진다는 실험적 근거가 뒷받침되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 지렁이 꼬리재생시 탈분화된 재생아세포의 기원과 형태발생양상을 시간별로 관찰하였다. 그 결과 지렁이 꼬리 재생 시 재생 아세 포들의 기원은 체 강면의 종주근세포로부터 생성되기 시작한다는 것이 명확히 관찰되었다(Fig.

가설 설정

(x 40). (B) Migration of blastema cells (BL) were progressed and chloragogue tissue appeared to be relatively dissipated. (× 200).

제안 방법

시간 경과에 따른 재생조직을 면도칼로 절단하여 10% neutral-formalin (Sigma) 용액으로 24-26시간 고정 (fixation)한 후, 흐르는 수돗물에서 12시간 동안 세척하였다. 그 후, 70% 에탄올 (Merck)부터 100%에 탄올까지 농도 상승순으로 약 1시간 정도씩 탈수 (dehydration) 한 다음 xylene (Merck)으로 투명하게 하였고, 파라핀 침투를 위하여 58-59℃를 유지하는 배양기 안에서 12시간 정도 진공 침투하였다. 파라핀이 침투된 재생조직을 절편제 작하기 위하여 embedding center (Leica)에서 3.
박절된 절편을 slide glass (Fisher)에 올린 후, slide warmer위에서 부착시킨 다음, xylene으로 탈 파라핀 하고 함수과정 (hydration)을 거쳐 hematoxylin과 eosin (Sigma)용액으로 염색하였다. 그 후, permount로 봉입하여 광학현미경 (Vanox-s, Olympus)으로 관찰한 다음 사진 촬영하였다.
^1] (embedding) 후, microtome (Leica)을 이용하여 4-5 p, m 두께로 박절하였다. 박절된 절편을 slide glass (Fisher)에 올린 후, slide warmer위에서 부착시킨 다음, xylene으로 탈 파라핀 하고 함수과정 (hydration)을 거쳐 hematoxylin과 eosin (Sigma)용액으로 염색하였다. 그 후, permount로 봉입하여 광학현미경 (Vanox-s, Olympus)으로 관찰한 다음 사진 촬영하였다.
시간 경과에 따른 꼬리재생의 과정을 형태학적으로 관찰하기 위하여 다음과 같은 방법으로 관찰하였다. 절단 후 각각 1 일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 26일, 30일, 50일 및 80일이 경과하여 재생중인 지렁이를 채취하여 -70℃에서 10분간 급냉동시킨 후, 조직이 상하지 않게0.5% Triton X-100 이 포함된 완충용액 (2 mM, pH₇.0, Tris-HC₁)에 넣어 해동시켰다. 해동된 재생조직의 물기를 제거한 후 Photographic system (GD photographic system, UVP,US A) 에서 사진 촬영을 하였다.
지렁이 꼬리재생시 재생아의 기원과 형태발생양상을 시간별로 관찰하여 각 시기에 나타나는 형태적 특징을 관찰하였다. Fig.
지렁이의 재생과정을 관찰하기 위하여 절단 후 1일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 26일, 30일, 50일 및 80일이 경과하여 재생 중인 지렁이를 단계별로 관찰하였다 (Fig. 1). 꼬리재생과정시 1 일과 3일 단계에서는 절단시 돌출 되어나온 장과 상처회복(wound healing)의 완성된 형태가 관찰되었다.
그 후, 70% 에탄올 (Merck)부터 100%에 탄올까지 농도 상승순으로 약 1시간 정도씩 탈수 (dehydration) 한 다음 xylene (Merck)으로 투명하게 하였고, 파라핀 침투를 위하여 58-59℃를 유지하는 배양기 안에서 12시간 정도 진공 침투하였다. 파라핀이 침투된 재생조직을 절편제 작하기 위하여 embedding center (Leica)에서 3.^1] (embedding) 후, microtome (Leica)을 이용하여 4-5 p, m 두께로 박절하였다. 박절된 절편을 slide glass (Fisher)에 올린 후, slide warmer위에서 부착시킨 다음, xylene으로 탈 파라핀 하고 함수과정 (hydration)을 거쳐 hematoxylin과 eosin (Sigma)용액으로 염색하였다.
0, Tris-HC₁)에 넣어 해동시켰다. 해동된 재생조직의 물기를 제거한 후 Photographic system (GD photographic system, UVP,US A) 에서 사진 촬영을 하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용한 지렁이는 환형동물門 (Phylum Annelida), 빈모綱 (Class Oligochaeta), 신빈모目 (Order Neooligo- chaeta), 낚시 지렁이科 (Family Lumbricidae)에 속하는 Eisenia andrei로, 지 렁 이 농장 (고양시 내 덕동 소재)에서 구 입하여 환대가 잘 발달된 성숙한 개체만을 선택하여 마디 수가 90-110개 정도인 개체를 Park 등(1996)에 의한 방법으로 사육하였다. 선택된 지렁이는 증류수로 여러 차례 세척한 후 peat moss로 채워진 15x20x7 cm 크기의 플라스틱 용기에 약 200개체씩 넣어 배양기 (SANYO)에서 23± 1℃를 유지하며 암소에서 배양하였다.
배양시 습도는 주기적으로 증류수를 공급하여 80% 이 상을 유지하고, 양분으로는 우분을 매일 peat moss 위에 공급하였다. 지렁이는 최소한 일주일 정도 기초 배양한 후 실험에 사용하였다.

성능/효과

따라서 본 연구에서는 지렁이 꼬리재생시 탈분화된 재생아세포의 기원과 형태발생양상을 시간별로 관찰하였다. 그 결과 지렁이 꼬리 재생 시 재생 아세 포들의 기원은 체 강면의 종주근세포로부터 생성되기 시작한다는 것이 명확히 관찰되었다(Fig. 2). 이러한 사실은 지렁이의 꼬리재생이 재생아세포의 형 성을 수반하는 진재생기작에 의해 이루어지고 있다는 사실을 말해 주고 있다.
첫째, 지렁이는 다량의 개체를 손쉽게 구할 수 있으며 배양조건이 간단하여 실험동물로서의 경제성을 갖고 있다. 둘째, 지 렁이는 재생에 소요되는 기간이 매우 짧다. 본 연구의 실험 결과 꼬리재생의 경우 절단 후 24시간 이내에 재생아 세포가 나타나기 시작하여 일주일 이내에 재생아 (blastema)의 형성이 완성되고, 약 4주 정도가 지나면 절단된 부위가 거의 완전한 상태로 재생된다.
5는 절단 후 30일이 경과하여 새롭게 재생된 조직의 종단면을 관찰한 결과로 재생아의 재분화가 활발하게 진행되었다. 또한 각 체절에는 재생된 신관(nephridia), 강모(setae)들이 형성된 것을 관찰 수 있었다. 재생된 꼬리 끝 부분과 절단지역 바로 앞쪽에서 미분화된 재생 아세포가 관찰되었다(Fig.
4A는 절단 후 3일이 경과한 재생조직의 횡단면을 관찰한 결과로 재생아세포의 성장이 활발히 진행되었고 체강쪽으로의 이동이 더욱 진행된 것을 볼 수 있었다. 또한 고배율(X400)로 관찰하였을 때 재생 아는 장의 최외곽 조직인 chloragogue tissue와 장외 막 사이에도 나타났으며 재생아의 이동이 더욱 진행된 것을 볼 수 있었다. 재생아들은 더 발달된 형태를 가지고 체강과 typhlosolar region에서 관찰되었다 (Fig.
절단 후 24시간이 경과한 재생조직에서 탈분화가 진행되지 않은 조직들은 epidermis (EP), circularmuscle layer (CM), coelum (CO), chloragogue tissue (CH), 장의 epithelium (EP) 등이 관찰되었다. 또한 절단 후 24시간이 경과한 재생조직을 고배율(X400)에서 관찰한 결과 재 생아세포가 명확히 종주근 층에서부터 기원하는 모습이 관찰되었고 재생아세포는 전형적인 간충세포 모양인 세포 형태가 크고 불규칙한 모양과 단핵을 가지고 있는 것이 관찰되었다(Fig. 2B). Fig.
둘째, 지 렁이는 재생에 소요되는 기간이 매우 짧다. 본 연구의 실험 결과 꼬리재생의 경우 절단 후 24시간 이내에 재생아 세포가 나타나기 시작하여 일주일 이내에 재생아 (blastema)의 형성이 완성되고, 약 4주 정도가 지나면 절단된 부위가 거의 완전한 상태로 재생된다. 셋째, 지렁이는 양방 향성재생이 가능한 동물로 머리와 꼬리재생시 발생학적으로 그 기원이 매우 다양한 기관의 재생이 이루어져야 한다.
본 연구의 실험 결과 꼬리재생의 경우 절단 후 24시간 이내에 재생아 세포가 나타나기 시작하여 일주일 이내에 재생아 (blastema)의 형성이 완성되고, 약 4주 정도가 지나면 절단된 부위가 거의 완전한 상태로 재생된다. 셋째, 지렁이는 양방 향성재생이 가능한 동물로 머리와 꼬리재생시 발생학적으로 그 기원이 매우 다양한 기관의 재생이 이루어져야 한다. 즉, 두부재생을 위해서는 뇌 및 심장 등의 중추기관 재생이 필수적이며, 꼬리재생시에는 장, 신장(nephridium), 황 세포층(지렁이의 간장 기관에 해당) 및 giant axon 등의 재생 이 이루어져야 한다.
4). 재생은 10일 이후 빠르게 진행되며 재생이 거의 완성된 30일이 경과된 재생부위를 관찰한 결과 원위재생아 세포층은 잘 발달되었으며 절단면의 인접 부위에서도 재생 아세포층이 관찰되었다. 또한 재생중인 신 관과 강모의 형태도 관찰할 수 있었다(Fig.
2A의 화살표). 절단 후 24시간이 경과한 재생조직에서 탈분화가 진행되지 않은 조직들은 epidermis (EP), circularmuscle layer (CM), coelum (CO), chloragogue tissue (CH), 장의 epithelium (EP) 등이 관찰되었다. 또한 절단 후 24시간이 경과한 재생조직을 고배율(X400)에서 관찰한 결과 재 생아세포가 명확히 종주근 층에서부터 기원하는 모습이 관찰되었고 재생아세포는 전형적인 간충세포 모양인 세포 형태가 크고 불규칙한 모양과 단핵을 가지고 있는 것이 관찰되었다(Fig.
3). 절단 후 7일이 경과 된 재생조직에서는 wound epidermis 바로 아래에 형성된 재생아세포층이 보여지고 아직 분절의 명확한 형태는 관찰되지 않았다(Fig. 4). 재생은 10일 이후 빠르게 진행되며 재생이 거의 완성된 30일이 경과된 재생부위를 관찰한 결과 원위재생아 세포층은 잘 발달되었으며 절단면의 인접 부위에서도 재생 아세포층이 관찰되었다.
그러므로 좀 더 다양한 단계의 조직학적 관찰이 필요하다고 생각된다. 종주근세포에서 기원한 재생아세포는 절단 후 3일 이내에 성장이 활발히 진행되고 체강 안으로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 절단 후 7일이 경과 된 재생조직에서는 wound epidermis 바로 아래에 형성된 재생아세포층이 보여지고 아직 분절의 명확한 형태는 관찰되지 않았다(Fig.
또한 지렁이는 두부와 꼬리재생이 가능한 양방향성 재생동물 중 가장 고등한 동물로서 재생연구를 위한 새로운 모델시스템으로 여러가지 장점을 갖고 있다. 첫째, 지렁이는 다량의 개체를 손쉽게 구할 수 있으며 배양조건이 간단하여 실험동물로서의 경제성을 갖고 있다. 둘째, 지 렁이는 재생에 소요되는 기간이 매우 짧다.

후속연구

이러한 사실은 지렁이의 꼬리재생이 재생아세포의 형 성을 수반하는 진재생기작에 의해 이루어지고 있다는 사실을 말해 주고 있다. 또한 지렁이 꼬리재생시 재생아세포의 기원은 완전히 분화된 근육세포가 간충세포로 탈분화 된다는 사실을 뒷받침해주는 증거로 제시될 수 있다고 생각된다. 다른 재생 모델시스템에서 관찰된 재생 아세포의 기원은 다음과 같이 보고되어 졌다.
5). 이러한 관 찰결과 지렁이는 꼬리재생시 탈분화된 재생아세포에 의해 진재생과 다양한 기관의 재분화가 수행되므로 다른 실험 동물보다 다양한 기관의 분화 및 발생기작 연구에 유용한 재생시스템모델로서 제시될 수 있다고 사료된다.

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