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제안 방법
- 내열성 유전자인 BCHSP17.6를 갖도록 제작한 발현벡터 pBKH4를 Agrobacterium tumefaciens LBA 4404에 도입후, , 4grobacteri"m과 버 즈풋 트레포일캘러스의 공배양을 통해 감염시킨 캘러스를 100㎍/㎖의 kanamycin과 500㎍/㎖의 cefotaxim을 첨가한 SH-3-kc 배지에서 배양하며 형질전환된 캘러스를 선발하였다. 식물체 재분화는 BOi2Y 배지에서 2개월 이상 배양하며 재분화를 완성하였으며, 재분화된 버즈풋 트레포일의 genomic DNA를 분리한 후, PCR 분석 및 Southern blot 분석을 실시하여 버즈풋 트레포일의 형질전환을 확인하였다.
- 2, 4-D를 3 mg/ 첨가한 SH-3 배지에 소독한 버즈풋 트레포일 종자 (Empire 품종)를 치상하여 배양했을 때, 약 20일 지난후에 캘러스가 유도되었으며, 캘러스를 동일배지에서 20일 간격으로 2~3 회 계대배양하여 증식시켜 Agrobacterium으로 감염시킬 재료로 사용하였다. 캘러스유도 조건은 Kim 둥 (1999b)이 보고한대로 배지조건을 맞추어 줌으로써 쉽게 많은 양의 캘러스를 유도할 수 있었다.
- 확인하였다. Genomic DNA는 형질전환 버즈풋 트레포일로부터 추출하였으며, 추출한 genomic DNA를 RzmHI 제한효소를 이용하여 완전히 절단 후 전기영동을 실시한 다음, membrane에 transfer하여 Southern blot 분석을 실시하였다. a -32P 방사능으로 표지한 BcHSP17.
- pBKH4 벡터를 E. coli IIB101에 도입하여 증식한 다음, plasmid DNA를 분리하여 BamW I 제한효소로 절단 후 전 기영동으로 확인하였을 때, Fig. 2 에서와 같이 0.73kb 의 BcHSPI7.6 단편의 DNA band를 확인하였다(Lane 1과 Lane 4).
- ) 종자로부터 캘러스 유도 조건 및 식물체 재분화 조건을 확립하기 위한 식물재료로서 Empire 품종을 공시하였다. 버즈풋 트레포일 캘러스를 얻기 위해 Empire 품종의 종자를 70% 에탄올에서 1분, 0.1% SDS/ HgCl2 용액에서 15분, 1% NaOCl 용액에서 5분간 소독한 다음, 멸균수로 2회 씻어내었다.
- 버즈풋 트레포일의 형질전환 여부는 재분화된버즈풋 트레포일의 잎조직에서 genomic DNA를 분리하여 PCR 분석 및 Southern blot 분석을 실시하므로서 확인하였다. Genomic DNA는 형질전환 버즈풋 트레포일로부터 추출하였으며, 추출한 genomic DNA를 RzmHI 제한효소를 이용하여 완전히 절단 후 전기영동을 실시한 다음, membrane에 transfer하여 Southern blot 분석을 실시하였다.
- 본 연구에서는 버즈풋 트레포일에 외래의 유용 유전자를 도입하여 새로운 형질전환체를 얻는 기술을 확립하기 위해, 버즈풋 트레포일 종자로부터 캘러스를 유도하고, Kim과 Jo(1997)가 분리한 BcHSP 17.6 유전자로 버즈풋 트레포일 캘러스를 형질전환 시켜 항생제를 첨가한 배지에서 형질전환된 캘러스를 선발, 이들을 재분화배지에서 완전한 식물체로 재분화한 후, BcHSP 17.6 유전자 단편에 방사능을 표지하여 준비한 probe를 이용, Southern 비ot 분석을 통해 버즈풋 트레포일의 형질전환 여부를 확인하였다.
- 6를 갖도록 제작한 발현벡터 pBKH4를 Agrobacterium tumefaciens LBA 4404에 도입후, , 4grobacteri"m과 버 즈풋 트레포일캘러스의 공배양을 통해 감염시킨 캘러스를 100㎍/㎖의 kanamycin과 500㎍/㎖의 cefotaxim을 첨가한 SH-3-kc 배지에서 배양하며 형질전환된 캘러스를 선발하였다. 식물체 재분화는 BOi2Y 배지에서 2개월 이상 배양하며 재분화를 완성하였으며, 재분화된 버즈풋 트레포일의 genomic DNA를 분리한 후, PCR 분석 및 Southern blot 분석을 실시하여 버즈풋 트레포일의 형질전환을 확인하였다.
- 종자로부터 직접 캘러스를 유도하고 증식시키기 위한 배지로는, SH (Schenk 및 Hildebrandt, 1972) 배 지 에 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxy acetic acid) 3mg/£ 농도로 첨가한 SH-3 배지를 사용하였으며 (Kim 등, 1999b), 본 실험에 사용된 모든 조직배양용 배지는 pH 5.8, 0.8% agar 농도로 조절하였고, 유도된 캘러스는 20일 간격으로 계대 배양 하면 서 대량으로 증식하였다.
- 항생제 첨가배지에서 선발한 캘러스로부터 버즈풋 트레포일 식물체를 재분화하기 위해, 광조 건 하에서 BOi2Y 배지에서 2개월 이상 배양하여 재분화를 완성하였다. Fig.
- 형질전환된 캘러스를 선발하기 위해, 100㎍/㎖의 kanamycin고]' 500㎍/㎖의 cefotaxim을 첨가한 SH-kc 배지에서 감염된 캘러스를 배양하였으며, 20일 간격으로 새로운 배지에 옮겨 주면서 2개월간 배양한 다음, 이들 배지에서 살아남는 캘러스를 형질전환 캘러스로 선발하였다. 형질전환 캘러스는 Kim 등 (1999b)의 방법으로 BOi2Y 배지에서 20일 간격으로 지속적으로 계대배양하여 완전한 식물체로 재분화하였으며, 재분화된 식물체의 형질전환을 확인하기 위해 Murray 및 Thompson (1980)의 방법에 따라 genomic DNA를 분리하여, PCR 분석 및 Southern blot 분석 (Southern, 1975)을 실시하였다.
대상 데이터
- 버즈풋 트레포일의 형질전환을 위해, BcHSP 17.6 유전자를 가지는 pBKH4를 사용하였다. pBKH4는양 말단이 BamH I 을 갖도록 한 BcHSP 17.
이론/모형
- pBKH4 plasmid를 Holster 등 (1978)의 'freeze and thaw method'에 따라 Agrobacterium에 도입하였으며, 형질전환된 Agrobaclerium을 YEP 배지에서 2일간 배양하여 2배의 S니 액상배지에 현탁후, Agrobacterium 현탁액에 버즈풋 트레포일 캘러스를 3~ 10분간 담구었다가 멸균수로 2회 세척한 다음, 항생제가 첨 가되 지 않은 SH agar plate에서 2일 간 co-culture 하므로서 감염을 유도하였다.
- 캘러스로 선발하였다. 형질전환 캘러스는 Kim 등 (1999b)의 방법으로 BOi2Y 배지에서 20일 간격으로 지속적으로 계대배양하여 완전한 식물체로 재분화하였으며, 재분화된 식물체의 형질전환을 확인하기 위해 Murray 및 Thompson (1980)의 방법에 따라 genomic DNA를 분리하여, PCR 분석 및 Southern blot 분석 (Southern, 1975)을 실시하였다.
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