This study was conducted to obtain the transformed alfalfa (Medicago sativa L.) plants with thermotolerance gene (BcHSP17.6) using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 and we confirmed the transformed gene from the regenerated alfalfa plants. The expression vector, pBKH4, harboring BcHSP17.6 gene was u...
This study was conducted to obtain the transformed alfalfa (Medicago sativa L.) plants with thermotolerance gene (BcHSP17.6) using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 and we confirmed the transformed gene from the regenerated alfalfa plants. The expression vector, pBKH4, harboring BcHSP17.6 gene was used for production of transgenic alfalfa plants. In a process for transformation, the callus of alfalfa was cocultivated with Agrobacterium tumefaciens and transformed calli were selected on kanamycin-containing SH-3-kc medium to regenerate into into the plant. The complete transgenic alfalfa plants were produced by cultivation for about 4 months on several regeneration media, SH-nk-c, SH-l lb-c, SH-sp-c, and SH-IBA. The transgenic alfalfa plants were analyzed by isolation of genomic DNA and PCR/Southem blot.
This study was conducted to obtain the transformed alfalfa (Medicago sativa L.) plants with thermotolerance gene (BcHSP17.6) using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 and we confirmed the transformed gene from the regenerated alfalfa plants. The expression vector, pBKH4, harboring BcHSP17.6 gene was used for production of transgenic alfalfa plants. In a process for transformation, the callus of alfalfa was cocultivated with Agrobacterium tumefaciens and transformed calli were selected on kanamycin-containing SH-3-kc medium to regenerate into into the plant. The complete transgenic alfalfa plants were produced by cultivation for about 4 months on several regeneration media, SH-nk-c, SH-l lb-c, SH-sp-c, and SH-IBA. The transgenic alfalfa plants were analyzed by isolation of genomic DNA and PCR/Southem blot.
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제안 방법
2, 4-D를 3 mg/g 첨가한 SH-3 배지에 소독한 알팔파 종자를 치상하여 배양했을때, 15〜20일이 지난후에 캘러스가 유도되었으며, 캘러스를 동일배지에서 20일 간격으로 2〜3회 계대배양하여 증식시켜 Agrobacterium으로 감염시킬 재료로 사용하였다. 캘러스유도 조건은 Kim 등 (1999)이 보고한대로 배지조건을 맞추어 줌으로써 쉽게 많은 양의캘러스를 유도할 수 있었다.
확인하였다. Genomic DNA는 형 질전환 알팔파와 형질전환 시키지 않은 알팔파 모두로부터 추출하였으며, 추출한 genomic DNA를 BarM I 제한효소를 이 용하여 완전히 절단후 전기영 동한 뒤 , membrane에 transfer 하여 Southern blot 분석을 실시하였다. # 방사능으로 표지한 BeHSP)7.
pBKH4 벡터를 E. coll HB101 에 도입하여 증식한 다음, plasmid DNA를 분리하여 BaM I 제한효소로 절단후 전기영동으로 확인하였을 때, Fig. 2 에서와같이 0.73kb 의 BcHSPI7.6 단편의 DNA band를 확인하였다 (Lane 1과 Lane 4).
그래서 본 연구에서는 알팔파 종자로부터 캘러스를 유도하고, 내열성 유전자 (8cHSP/7.6)를 갖는형질전환용 벡터 pBKH4를 제작하여, pBKH4를 도입한 Agrobacterium LBA4404로서 알팔파 캘러스를감염시킨 다음, 항생제를 첨가한 배지에서 형질전환된 캘러스를 선발, 이들을 재분화배지에서 완전한 식물체로 재분화한 후, genomic DNA를 분리하여 PCR 분석 및 Southern blot 분석을 통해 알팔파의 형질전환을 확인하였다.
내열성 유전자인 BCHSP17.6를 갖도록 제작한 발현벡터 pBKH4를 Agrobacterium tumefaciens LBA 4404에 도입후, Agrobacterium과 알팔파 캘러스의공배양을 통해 감염 시 킨 캘러 스를 100μg/㎖의 kanamycin과 500μg/㎖의 cefotaxim을 첨가한 SH-kc배지에서 배양하며 형질전환된 캘러스를 선발하였다. 식물체 재분화는 SH- nk-c, SH-sp-c, SH-llb-c, SH-IBA 배지에서 약 4개월간 배양하여 재분화를완성하였으며, 재분화된 알팔파의 genomic DNA를분리한 후, PCR 분석 및 Southern blot 분석을 실시하여 알팔파의 형질전환을 확인하였다.
6를 갖도록 제작한 발현벡터 pBKH4를 Agrobacterium tumefaciens LBA 4404에 도입후, Agrobacterium과 알팔파 캘러스의공배양을 통해 감염 시 킨 캘러 스를 100μg/㎖의 kanamycin과 500μg/㎖의 cefotaxim을 첨가한 SH-kc배지에서 배양하며 형질전환된 캘러스를 선발하였다. 식물체 재분화는 SH- nk-c, SH-sp-c, SH-llb-c, SH-IBA 배지에서 약 4개월간 배양하여 재분화를완성하였으며, 재분화된 알팔파의 genomic DNA를분리한 후, PCR 분석 및 Southern blot 분석을 실시하여 알팔파의 형질전환을 확인하였다.
알팔파 종자로부터 직접 캘러스를 유도하고 증식시키기 위한 배지로는, SH (Schenk 및 Hilde brandt, 1972) 배지에 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxy acetic acid) 3 mg/« 농도로 첨가한 SH-3 배지를 사용하였으며 (Kim 등, 1999), 본 실험에 사용된 모든 조직배양용 배지는 pH 5.8, 0.8% agar 농도로 조절하였고, 유도된 캘러스는 20일 간격으로 계대배양 하면서 대량으로 증식하였다.
알팔파의 형질전환 여부는 재분화된 알 팔 파의 잎 조직에서 genomic DMA를 분리하여 PCR 분석 및 Southern blot 분석을 실시하여 확인하였다. Genomic DNA는 형 질전환 알팔파와 형질전환 시키지 않은 알팔파 모두로부터 추출하였으며, 추출한 genomic DNA를 BarM I 제한효소를 이 용하여 완전히 절단후 전기영 동한 뒤 , membrane에 transfer 하여 Southern blot 분석을 실시하였다.
형질전환 식물체를 얻기 위해서는 무엇보다도식물체 재분화기술이 확립되어야 하는데, 알팔파의 경우 Kim 등 (1999)이 SH 배지에서 재분화를성공한 보고가 있기 때문에 동일한 방법으로 재분화실험을 진행하였다. 알팔파에 도입하고자 하는 내 열성 유전자 (Bc/ZSP/7.
형질전환된 캘러스를 선발하기 위해, SH-3 배지에 100μg/㎖의 kanamycin과 500μg/㎖의 cefotaxim을첨가한 SH-3-kc 배지에서 감염된 캘러스를 배양하였으며, 20일 간격으로 새로운 배지에 옮겨 주면서 2개월간-배양한 다음, 이들 배지에서 살아남는 캘러스를 형질전환 캘러스로 선발하였다.
대상 데이터
형질전환체을 위한 식물재료로는 알팔파 (Medi- cago sativa L.)의 Vernal 품종을 공시하였으며, 알팔파 종자를 70% 에탄올에서 1분, 0.1% SDS/ HgCh 용액에서 15분, 1% NaOCl 용액에서 5분간 소독한 다음, 멸균수로 2회 씻어내어 조직배양 재료로 사용하였다.
이론/모형
pBKH4 plasmid를 Holster 등 (1978)의 "freeze and thaw method'에 따라 Agrobacterium에 도입하였으며, 형질전환된 Agrobacteriimt을 YEP 배지에서 2일간 배양하여 2배의 SH 액상배지에 현탁후, Agro bacterium 현 탁액 에 알팔파 캘 러 스를 3~10분간 담구었다가 멸균수로 2회 세척한 다음, 항생제가 첨가되지 않은 S너 agar plate에서 2일간 co-culture 하므로서 감염을 유도하였다.
진행하였다. SH-3-kc 배지에서 선발한 캘러스를 SH-nk-c 배지에서 28일간 배양, SH-llb-c 배지에서 3일간 배양, SH-sp-c 배지에서 21일간 배양한 다음, 줄기를 잘라1μg/㎖의 IBA를 첨가한 SH-IBA 배지에서 배양하여 뿌리를 유도함으로서 완전한 식물체로 재분화하였으며, 재분화된 식물체의 형질전환을 확인하기 위해 Murray 및 Thompson (1980)의 방법에 따라 genomic DNA 를 분리하여, PCR 분석 및 Southern blot 분석 (Southern, 1975)을 실시하였다.
알팔파의 형질전환을 위해, BcHSP17.6 유전자를가지는 pBKH4 를 형질전환 벡터로 사용하였다 (Kim 등, 1993). pBKH4는 양 말단이 BamH I 을 갖도록 한 BcHSP17.
형질전환 캘러스로부터 식물체를 재분화하기 위해 Kim 등 (1999)의 방법으로 실험을 진행하였다. SH-3-kc 배지에서 선발한 캘러스를 SH-nk-c 배지에서 28일간 배양, SH-llb-c 배지에서 3일간 배양, SH-sp-c 배지에서 21일간 배양한 다음, 줄기를 잘라1μg/㎖의 IBA를 첨가한 SH-IBA 배지에서 배양하여 뿌리를 유도함으로서 완전한 식물체로 재분화하였으며, 재분화된 식물체의 형질전환을 확인하기 위해 Murray 및 Thompson (1980)의 방법에 따라 genomic DNA 를 분리하여, PCR 분석 및 Southern blot 분석 (Southern, 1975)을 실시하였다.
성능/효과
Genomic DNA는 형 질전환 알팔파와 형질전환 시키지 않은 알팔파 모두로부터 추출하였으며, 추출한 genomic DNA를 BarM I 제한효소를 이 용하여 완전히 절단후 전기영 동한 뒤 , membrane에 transfer 하여 Southern blot 분석을 실시하였다. #방사능으로 표지한 BeHSP)7.6 gDNA 단편을 probe로 해서 분석한 결과, 형질전환시키지 않은 알팔파에서는 band가 나타나지 않은 반면, 형질전환 알팔파에서는 약 0.7kb 위치에 band가 나타난 것으로 보아서 PCR 분석에서 확인된 band는 BcHSP17.6 유전자 단편이 확실하며, 재분화된 알팔파는 BcHSP 17.6 유전자로 형질전환되었음이 확인되었다 (Rg. 4).
따라서 본실험에서 BcHSP17.6 유전자의 도입에 의해 형 질전환된 알팔과는 35S promoter에 의해 식물 체내에서 항상적으로 발현하므로, 형 질전환되 지 않은 알팔파에 비해 하고에 견디는 힘이 더 강할 것으로 예상된다. BcHSP!7.
후속연구
진행하였다. 알팔파에 도입하고자 하는 내 열성 유전자 (Bc/ZSP/7.6)는 Kim 등 (1997)이 이미 담배에 도입하여 형질전환된 담배가 내열성을획득하는 것으로 보고하였으며, 세계 유전자은행에 등록되어 있는 유전자로서 (GenBank AF022217, Kim 및 Jo, 1997), 내 열성 유전자 (BcHS07.6)를 알팔파에 도입할 경우 형질전환된 알팔파는 내하고성 및 내재해성이 증진될 것으로 예상되며, 한국기후에 적응하는 알팔파 신품종을 확보하는 동시에 국내 조사료의 증산에도 기여하리라 기대된다.
coli (Kim 등, 1998a) 및 모델식물인 담배 (Kim 등, 1997)으] 내열성을 향상시킨다는 것은 이미 보고되었다. 이 후의 연구에서 형질전환 알팔파의 내하고 성을 조사하고, 이늘이 내하고성이 강한 우량품종으로 육성할 가치가 있는지를 확인하는 실험을계속적으로 수행할 계획이다.
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