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문제 정의
- 본 연구는 비스페놀 A 및 DES의 유전독성 기전을 확인하기 위해 염색체이상, 자매염색분체교환, 소핵형성 및 단일 세포 겔 전기영동을 통한 DNA 손상을 분석하고자 한다.
- 본 연구에서는 최근 주변 생활환경에서 人]용되어 주목을 받고 있는 비스페놀A와 DES를 대상으로 이들의 세포유전 학적 독성효과를 구명하고자 한다.
- 본 연구의 목적은 최근 그 위해성이 부각되고 있는 내분 비장애물질 중 비스페놀A와 DES(diethylstilbestrol)의 유전 독성을 평가하기 위해 사람 림프구를 대상으로 염색체이상 분석, 자매염색분체교환 분석, 소핵 분석 및 단일세포겔전기 영동 분석을 시행하고 유전독성물질 노출의 생물학적 지표로의 활용 가능성을 구명하고자 한다.
제안 방법
- 4 M Tris로 5분간 3회 중화시켰으며, DNA가 슬라이드에 침착되도록 적어도 1시간 동안 100% 에탄올에 담가 두었다. 관찰은 슬라이드를 건조시킨 후 Ethidium bromide(20 |ig/ml) 60 田로 형광염색하고, G2A filter。15-560 nm의 excitation, 590 nm의 barrier filter)를 이용하여 400배율로 관찰하였다. 한 농도에서 60개의 세포 를 무작위로 선택하여 이미지 분석 프로그램(Image-Pro Plus 4.
- 세포배양 44시간 후에 Cytochalasin B(3 를 처리하고 다시 28시간 배양한 다음 염색체 슬라이드를 작성하였다. Giemsa 염색후 핵이 두 개인 경우만 분석하였고 소핵은 본 핵의 1/3 이하의 크기인 경우에만 인정하였으며 각 농도당 2000개의 세포를 관찰함을 원칙으로 하였다.
- Perry(1984)의 방법에 준해 사람 말초혈액에 비스페놀 A 또는 DES 각각을 농도별로 처리하고 3시간 후에 인산완충 용액으로 2번 세척하고 10% 우태아 혈청과 PHA가 들어있는 RPMI 1640에 10 “M의 5-Bromo-2-deoxyuridine을 추 가로 첨가하여 72시간 배양한 후 염색체 표본을 작성하였다. 염색체표본을 암실에서 건조시킨 후 Fluorescent plus Giemsa 방법에 의해 5 μg/ml의 Hoechest 33258(SIGMA) 로 13분간 염색하고, black light로 10분간 조사한 다음 5% Gurr's Giemsa 용액으로 염색하였다.
- 사람의 말초혈액에 비스페놀 A(SIGMA) 또는 diethyl- stilbestrol(SIGMA) 각각을 0, 10, 20, 50, 100, 300 |1M 농도로 처리하고 3시간 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 10% 우태아 혈청(GIBCO)이 포함된 RPMI 1640 배지 (GIBCO) 에 penicilin, streptomycin, PHA(phytohemagglutinin, SIGMA)를 첨가한 다음 5% CO?가 공급되는 항온기에서 염색체이상, 자매염색분체교환 및 소핵분석 방법에 따라 각기 시간을 달리하여 배양하였다. 비스페놀A와 DES (diethylstilbestrol)는 DMSO(dimethylsulfonate)에 용해한 후 적정농도로 희석하여 사용하였다.
- 건강한 사람 말초혈액으로부터 Ficoll을 이용 림프구를 분리하여 배지에 넣고 비스페놀 A 또는 DES 각각을 0, 10, 20, 50, 100, 300μM로 처리한 후 CO27} 공급되는 37℃ 항온기에서 3시간 동안 배양하였다. 이를 인산완충용액으로 세척하고, PHA가 포함된 새로운 배지에 넣고 48시간 추가 배양한 후 Tryphan blue exclusion 방법에 의해 혈구계수기를 이용하여 생존한 세포수를 측정하였다.
- 6% normal melting agarose gel을 130 |X1 도말 하여 24X50 mm coverslip으로 덮어준 후 4℃에서 10분간 굳힌 다음 coverslip을 제거하였다. 그 위에 림프구와 0.5% low melting agarose gel의 혼합물 75 를 도말하여 coverslip으로 덮어준 후, 다시 4℃에서 10분간 굳히고 coverslip을 제거한 후 0.5% low melting agarose gel 110 111를 도말하여 세포가 agarose 층에 묻히도록 하였다. 이층이 굳으면 coverslip을 제거흐}고 슬라이드를 차가운 lysis solution(2.
- 사람 림프구에서 세포독성을 유발하는 것으로 나타났던 농도를 기준으로 비스페놀A와 DES 를 10, 20, 50, 100, 300 pM의 농도로 각각 처리하였다. 비스페놀 A의 경우에는 100卜iM까지는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나 100~300 nM의 농도에서 뚜렷한 증가양상을 보였으며 염색분체형 이상만을 관찰할 수 있었다(Table 1).
- 사람의 말초혈액에 비스페놀 A(SIGMA) 또는 diethyl- stilbestrol(SIGMA) 각각을 0, 10, 20, 50, 100, 300 |1M 농도로 처리하고 3시간 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 10% 우태아 혈청(GIBCO)이 포함된 RPMI 1640 배지 (GIBCO) 에 penicilin, streptomycin, PHA(phytohemagglutinin, SIGMA)를 첨가한 다음 5% CO?가 공급되는 항온기에서 염색체이상, 자매염색분체교환 및 소핵분석 방법에 따라 각기 시간을 달리하여 배양하였다.
- 염색체이상 분석을 위해서 사람 말초혈액에 비스페놀 A 또는 DES 각각을 농도별로 처리하고 3시간 후에 인산완충 용액으로 2번 세척하고 10% 우태아 혈청과 PHA가 포함된 RPMI 1640에 48시간 추가 배양하였다. 염색체 표본작성 3 시간 전에 세포 배양액에 Colcemid(2X 10~7 M)를 첨가한 후 3시간 후에 저장액 (0.075M KCD을 거쳐 Canoy 고정 액(metanol:acetic acid=3:l)을 2회 처리하는 일반적인 방법에 의해 염색체 표본을 작성하였다.
- 염색체이상 분석을 위해서 사람 말초혈액에 비스페놀 A 또는 DES 각각을 농도별로 처리하고 3시간 후에 인산완충 용액으로 2번 세척하고 10% 우태아 혈청과 PHA가 포함된 RPMI 1640에 48시간 추가 배양하였다. 염색체 표본작성 3 시간 전에 세포 배양액에 Colcemid(2X 10~7 M)를 첨가한 후 3시간 후에 저장액 (0.
- Perry(1984)의 방법에 준해 사람 말초혈액에 비스페놀 A 또는 DES 각각을 농도별로 처리하고 3시간 후에 인산완충 용액으로 2번 세척하고 10% 우태아 혈청과 PHA가 들어있는 RPMI 1640에 10 “M의 5-Bromo-2-deoxyuridine을 추 가로 첨가하여 72시간 배양한 후 염색체 표본을 작성하였다. 염색체표본을 암실에서 건조시킨 후 Fluorescent plus Giemsa 방법에 의해 5 μg/ml의 Hoechest 33258(SIGMA) 로 13분간 염색하고, black light로 10분간 조사한 다음 5% Gurr's Giemsa 용액으로 염색하였다. 자매염색분체교환 은 각 농도별로 60개의 세포를 무작위로 관찰하여 하나의 세포 당 평균 염색분체 교환빈도로 분석하였다.
- 염색체표본을 암실에서 건조시킨 후 Fluorescent plus Giemsa 방법에 의해 5 μg/ml의 Hoechest 33258(SIGMA) 로 13분간 염색하고, black light로 10분간 조사한 다음 5% Gurr's Giemsa 용액으로 염색하였다. 자매염색분체교환 은 각 농도별로 60개의 세포를 무작위로 관찰하여 하나의 세포 당 평균 염색분체 교환빈도로 분석하였다.
- 관찰은 슬라이드를 건조시킨 후 Ethidium bromide(20 |ig/ml) 60 田로 형광염색하고, G2A filter。15-560 nm의 excitation, 590 nm의 barrier filter)를 이용하여 400배율로 관찰하였다. 한 농도에서 60개의 세포 를 무작위로 선택하여 이미지 분석 프로그램(Image-Pro Plus 4.0>을 통해 DNA의 손상정도를 head 중심에서 tail로 의 DNA 단편의 이동거리로 분석하였다.
데이터처리
- 1) 비스페놀A와 DES의 염색체이상 및 소핵형성 관계를 보기 위해 Kendall's T rank test를 시행하였다.
- 2) 비스페놀A와 DES의 자매염색분체 교환빈도 간의 양- 반응 관계는 Chi-Square를 이용한 Trend test와 paired t- tes를 병행하여 시행하였다.
- 3) 비스페놀 A, DES의 농도에 따른 DNA 손상을 보기 위하여 Mann-Whitney test를 시행하였다.
이론/모형
- Fenech(1993)의 방법에 준해 수행하였다.
- Singh 등(1988)의 방법에 준해 수행하였다.
- } 공급되는 37℃ 항온기에서 3시간 동안 배양하였다. 이를 인산완충용액으로 세척하고, PHA가 포함된 새로운 배지에 넣고 48시간 추가 배양한 후 Tryphan blue exclusion 방법에 의해 혈구계수기를 이용하여 생존한 세포수를 측정하였다. 세포생존률은 대조군에서의 생존 세포수에 대한 처리군에서의 생존 세포수 의 비로 나타내었다.
성능/효과
- 또한 본 연구에서 소핵에서는 비스페놀 A가 DES보다 높은 수치를 보였으며 자매염색분체교환과 DNA손상에서는 반 대양상을 보였다. 소핵은 염색체이상이 있었음을 의미하기도 하지만 그보다는 방추체의 손상으로 인해 형성되는 경우가 많기 때문에 DES가 DNA 자체 또는 염색체상의 손상을 더 일으키는 것에 반해 비스페놀A는 DES 보다 방추체의 손상을 더 유발하는 것으로 보인다.
- 대조군과 비스페놀 A 10, 20, 50, 100, 300 gM의 농도에서 2000개의 binucleated cell당 소핵발생은 각각 5, 12, 12, 14, 32, 31이었고, DES의 경우에는 같은 농도에서 2000개의 BN에서 각각 5, 3, 6, 6, 13, 21이었다(Table 5, Table 6). 또한 비스페놀A와 DES에 의한 소핵발생은 통 계적으로 유의한 양-반응관계를 보였다.
- Pfeiffer E(1997) 등에 의하면 비스페놀A는 잠재 적으로 이수성을 유발하는 물질로 분류되고 있다. 본 연구에서 비스페놀A는 소핵의 빈도를 증가시키는 것으로 확인되 었으며 염색체의 구조적 이상도 유발하는 것2로 나타났다. 즉 소핵은 염색체의 수적 이상 뿐만 아니라 구조적 이상도 반영해 줄 수 있기 때문에 비스페놀 A는 aneuploidogen 및 clastogen으로도 작용하는 것을 알 수 있다(Hilliard et al.
- , 1987)도 있어 일 관성 있는 연구결과가 보고되지 않고 있다. 본 연구에서는 DES의 농도에 따라 자매염색분체 교환빈도가 증가되는 양상 을 보였으며 특히 100 pM이상에서는 통계적으로 유의한 결과를 보여주었다. 또한 본 연구결과 DES는 낮은 농도에 서도 DNA 단일가닥 절단을 유발하였으며 Anderson 등 (1997)도 같은 결과를 보고한 바 있다.
- 비스페놀 A, DES를 3시간 처리한 후 세척하고, 48시간 동안 추가 배양한 다음 세포수를 측정한 결과 10, 20, 50, 100, 300pM에서 상대생존률이 비스페놀 A의 경우 86.0%, 97.7%, 82.2%, 62.6% 및 49.4%로 나타났으며 DES의 경우에는 83.7%, 99.4%, 72.2%, 68.3%, 31.7%로 나타났다 (Fig. 1).
- 사람 림프구에서 세포독성을 유발하는 것으로 나타났던 농도를 기준으로 비스페놀A와 DES 를 10, 20, 50, 100, 300 pM의 농도로 각각 처리하였다. 비스페놀 A의 경우에는 100卜iM까지는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나 100~300 nM의 농도에서 뚜렷한 증가양상을 보였으며 염색분체형 이상만을 관찰할 수 있었다(Table 1). DES역시 100 哄의 농도까지는 이상빈도의 뚜렷한 증가를 볼 수 없었으 나 50 皿 이상에서는 이동원염색체와 같은 염색체형 이상 을 볼 수 있었다(Table 2).
- 비스페놀A와 DES를 농도를 달리하여 3시간 처리 하였을 때 Table 7, 8에서 보는 바와 같이 300 pM에서만 비스 페놀 A에 의한 DNA 손상이 유의하게 높았으며 DES의 경우에는 10〃 M을 제외하고는 모든 농도에서 유의하게 DNA 손상을 증가시켰다. 전체적으로는 비스페놀 A 보다 DES가 DNA 손상을 더 많이 일으키는 것으로 나타났다.
- 비스페놀A와 DES를 농도를 달리하여 3시간 처리 하였을 때 Table 7, 8에서 보는 바와 같이 300 pM에서만 비스 페놀 A에 의한 DNA 손상이 유의하게 높았으며 DES의 경우에는 10〃 M을 제외하고는 모든 농도에서 유의하게 DNA 손상을 증가시켰다. 전체적으로는 비스페놀 A 보다 DES가 DNA 손상을 더 많이 일으키는 것으로 나타났다.
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