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문제 정의
- 본 연구에서는 안정적으로 유지되는 오이배 발생 캘러스의 현탁배양계와 Agrobacterium과의 공동 배양법으로 bar, 유전자를 도입하여 제조제 저항성 오이를 대량 생산하는 효율적인 형질전환 시스템을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- cefotaxime 300 mg/L이 첨가된 액체배지(MS1D)에서 3일간 현탁배양 후, 액체 선발배지 (MS + 1 mg/L 2, 4-D + 300 mg/L cefotaxime + 100 mg/L kanamycin + 20 mg/L PPT)에서 1주일 간격으로 계대 배양하였다. 2주간 선발하여 고사하지 않고 왕성하게 분열하는 배 발생 현탁배 양 세포를 2, 4-D가 제거된 동일한 고체 배지에 평판 배양하여 체세포배를 유도하였다. 현미경 하에서 제초제에 저항성을 가지는 체세포배를 선발하여 성숙배지(1/2 MS + ABA 1 mg/L + GA3 0.
- bar 유전자의 도입 및 발현이 확인된 오이순화개체를 중앙종묘 오산연구소에서 온실시험을 하였다. 온실에서 빠르게 생장하는 형질전환 오이식물체에 농가에서 사용되는 상업적 제초제(Basta; 경농) 3 mL/L를 1개월 간격으로 전신에 2회 살포하였다.
- Agrobacferium과 48시간 공동배양한 오이 배발생현탁배 양 세포를 Agrobacterium을 제거하는 항생제인 cefotaxime 이 800 mg/L이 첨가된 액체배지 (MS 1D)로 1회 세척한 후, 점차 cefotaxime 농도를 낮추어주면서 2~3회 세척하였다. cefotaxime 300 mg/L이 첨가된 액체배지(MS1D)에서 3일간 현탁배양 후, 액체 선발배지 (MS + 1 mg/L 2, 4-D + 300 mg/L cefotaxime + 100 mg/L kanamycin + 20 mg/L PPT)에서 1주일 간격으로 계대 배양하였다. 2주간 선발하여 고사하지 않고 왕성하게 분열하는 배 발생 현탁배 양 세포를 2, 4-D가 제거된 동일한 고체 배지에 평판 배양하여 체세포배를 유도하였다.
- 온실에서 빠르게 생장하는 형질전환 오이식물체에 농가에서 사용되는 상업적 제초제(Basta; 경농) 3 mL/L를 1개월 간격으로 전신에 2회 살포하였다. 약제 처리 10일 이후 제초제 저항성 유무를 관찰하였다.
- bar 유전자의 도입 및 발현이 확인된 오이순화개체를 중앙종묘 오산연구소에서 온실시험을 하였다. 온실에서 빠르게 생장하는 형질전환 오이식물체에 농가에서 사용되는 상업적 제초제(Basta; 경농) 3 mL/L를 1개월 간격으로 전신에 2회 살포하였다. 약제 처리 10일 이후 제초제 저항성 유무를 관찰하였다.
- 형질전환된 배 발생 캘러스를 선발하기 위하여 항생제 내성 유전자가 사용되는데, 먼저 이들 항생제에 대한 오이 배발생 캘러스의 생육 저해 정도를 조사하였다. 이를 위해 각각kanamycin 0, 50, 100, 500, 1,000 mg/L, geneticin 0, 3, 10, 30, 100 mg/L, PPT 0, 2, 10, 20, 100 mg/L 농도로 항생제가 첨가된 배지 20mL을 150 mL Erlenmeyer flask에 넣고, 오 이 배발생 캘러스 5mL (v/v)를 첨가하여 1주일간 배양 후 시험관에 옮겨 관찰하였다.
- 잎에서의 total RNA 분리는 guanidinium isothiocyanate (GIBCO, BRL)를 이용한 Chomaczynski과 Sacchi (1987) 방법을 약간 변형하여 추출하였고, 그 양을 spectrophotome- ter로 측정하였다. 20 μg의 total RNA를 agarose gel 상에서 전기영동하여 전개하고 Nytran membrane에 capillary transfer 방법으로 전이시켰다.
- 제초제 저항성 오이 (Cucumis sativus L. cv Green angel) 를 생산하기 위하여 배 발생 현탁배양세포와 binary vector pGA-Zw을 지닌 Agrobacterium tumefacians (LBA4404)를 공동 배양하였다. 형질전환 벡터의 T-DNA 부분에는 kana- mycin 에 저항성을 나타내는 neomycin phosphotrans ferase (npt][) 유전자와 phosphinothricin (PPT)에 저항성을 나타내는 phosphinothricin acetyltransferase (bar) 유전자를 지니고 있다.
- 2주간 선발하여 고사하지 않고 왕성하게 분열하는 배 발생 현탁배 양 세포를 2, 4-D가 제거된 동일한 고체 배지에 평판 배양하여 체세포배를 유도하였다. 현미경 하에서 제초제에 저항성을 가지는 체세포배를 선발하여 성숙배지(1/2 MS + ABA 1 mg/L + GA3 0.1 mg/L + cefotaxime 300 mg/L + PPT 20 mg/L + gelrite 6g/L)에서 2주간 광조건으로 배양하고, 발아배지(1/2 MS + cefotaxime 300 mg/L + PPT 40 mg/L + gelrite 6 g/L) 에서소식물체를 재생하였다. 멸균된 토양에서 순화하여 뿌리를 발달시킨 후 포장에 이식하였다.
- 현탁배양 중인 오이배발생 캘러스에 kanamycin, gene- ticin과 phosphinothricin을 처리하여 생장 저해 정도를 조사하였다. kanamycin 처리에는 형질전환세포를 구별하기 위한 고사 현상이 전체 처리구에서 나타나지 않았다.
- 형질전환된 배 발생 캘러스를 선발하기 위하여 항생제 내성 유전자가 사용되는데, 먼저 이들 항생제에 대한 오이 배발생 캘러스의 생육 저해 정도를 조사하였다. 이를 위해 각각kanamycin 0, 50, 100, 500, 1,000 mg/L, geneticin 0, 3, 10, 30, 100 mg/L, PPT 0, 2, 10, 20, 100 mg/L 농도로 항생제가 첨가된 배지 20mL을 150 mL Erlenmeyer flask에 넣고, 오 이 배발생 캘러스 5mL (v/v)를 첨가하여 1주일간 배양 후 시험관에 옮겨 관찰하였다.
대상 데이터
- Fi 잡종오이 (Cucumis sativus L. cv Green angle)에서 유래한 배 발생 현탁 배양세포 (Jeong et aL 1999; Kim et al. 1998)를 1주일 간격으로 1 mg/L 2, 4-D가 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962) 액체배지(MSID)에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 현재까지 식물체에 외래유전자 도입을 위한 형질전환 기술이 개발되어 왔으나 그 중 대부분은 npt n 유전자로 형질전환체를 선발하였다. 기존에 보고된 오이형질전환 연구에서도 동일한 선발 유전자를 이용하였고 선발 물질로서는 kana- mycin만을 사용하였다. 본 연구에서 사용된 오이배발생 캘러스는 kanamycin에 의한 증식 저해는 크게 나타나지 않았다.
- 본 실험에 사용된 bar 유전자를 가진 binary vector (pGA- bar)는 충남대학교 임용표 교수에게서 분양받아 사용하였다. YEP agar 배지에서 2일간 배양하여 콜로니를 선발하고, 동일한 액체 배지에서 2일 동안 배양하여 접종원으로 사용하였다.
- 48시간의 공동배양 후 배 발생 캘러스는 20 mg/L PPT 가 함유된 성숙 배지에서 배양하였다. 약 200개체의 형질전환 유식물체를 40mg/LPPT가 첨가된 호르몬이 없는 배지에서 생산하였다. 5개의 오이형질전환 식물체의 염색체에 bar 유 전자가 도입되어 발현되는 것을 northern blot 분석을 통하여 확인하였다 형질전환 오이식물체가 토양에서 성숙되었다.
이론/모형
- 잎에서의 total RNA 분리는 guanidinium isothiocyanate (GIBCO, BRL)를 이용한 Chomaczynski과 Sacchi (1987) 방법을 약간 변형하여 추출하였고, 그 양을 spectrophotome- ter로 측정하였다. 20 μg의 total RNA를 agarose gel 상에서 전기영동하여 전개하고 Nytran membrane에 capillary transfer 방법으로 전이시켰다. 이때 bar 유 전자의 probe는 random priming 방법 (Maniatis et al, 1989)으로 [a-32P] dCTP로 표지하였다.
- 순화 과정 이후 포장에서 3개월 이상 생장한 잎 절편 재료에서 DNA를 분리하고 PCR 분석를 실시한 결과, pGA-bar 벡터를 주형으로 증폭한 것과 동일한 위치에 bar 와 전자의 band가 확인되었다. PCR 증폭산물이 bar 유전자임을 Southern blot 분석을 통하여 재확인하였다 (사진 미제시).
- 20 μg의 total RNA를 agarose gel 상에서 전기영동하여 전개하고 Nytran membrane에 capillary transfer 방법으로 전이시켰다. 이때 bar 유 전자의 probe는 random priming 방법 (Maniatis et al, 1989)으로 [a-32P] dCTP로 표지하였다. Membrane 에 probe를 첨가하여 60℃ 에서 16시간 동안 반응하였다.
성능/효과
- 약 200개체의 형질전환 유식물체를 40mg/LPPT가 첨가된 호르몬이 없는 배지에서 생산하였다. 5개의 오이형질전환 식물체의 염색체에 bar 유 전자가 도입되어 발현되는 것을 northern blot 분석을 통하여 확인하였다 형질전환 오이식물체가 토양에서 성숙되었다. 성숙한 오이식물체는 PPT가 함유된 상업적 제초제(Basta) 를 일반적인 사용 농도(3ml/L)처리시에도 저항성을 나타내며 생장하였다
- PPT 처리에는 다른 항생제의 처리보다 낮은 농도의 처리구에서도 배 발생 캘러스의 증식이 강하게 저해되었으며, 처리구 중 가장 낮은 2 mg/L에서도 배 발생 캘러스가 거의 증식되지 않아서 대조구의 14.6%를 나타내었다 (Figure. 1C). 전체 처리구에서 배 발생 캘러스의 갈변과 증식의 저해가 뚜렷하게 관찰되었다.
- 단백질의 활성을 확인하기 위하여 인공배양실에서 자라는 대조구와 형질전환 오이에 bialaphos 또는 PPT가 함유된 상업적으로 판매되는 제초제(Basta; 경농)를 3 mL/L 농도로 처리한 결과, 대조구는 처리 3일 이후부터 갈변되면서 고사하는 현상이 나타났으나 bar 유전자가 도입된 형질전환 오이는 제초제 2회 살포에서도 저항성을 보이며 왕성하게 생장하였다 (Figure. 4). 이후 온실로 옮긴 형질전환 오이는 열매를 맺으면서 정상적으로 생장하였다.
- 배양 7일째에는 대조구에 비해서 증식 속도는 낮았으나 일부 노란색의 캘러스가 독립적으로 또는 갈변된 캘러스와 혼합된 상태로 발생하였다. 따라서 선발 배지에서 배양 7일째부터 형질전환 유무를 잠정적으로 확인할 수 있었다. 액체배지 내에서 선발된 배 발생 캘러스를 2, 4-D가 첨가되지 않은 고체 배지에 평판 배양 후, 4주부터 캘러스의 표면에서 체세포배가 발생하였다 (Figure.
- 본 연구방법을 통해 생산된 형질전환 오이에서 bar 유전자가 전사 수준에서 발현되고 있음을 RNA분석을 통하여 확인하였으며, 또한 포장에서 제초제의 저항성을 나타냄으로써 단백질 수준에서도 정상적으로 작용함을 확인하였다 한편 오이의 형질전환을 위하여 현탁배양계를 이용하고 한 flask 내에서 Agrobacterium의 접종 및 선발 과정을 동시에 수행한 방법은 보고되어 있지 않다. 이와 같이 분열능과 재분화 능이 강한 배 발생 캘러스의 현탁배양계에 직접 Agrobacterium 접종을 통한 형질전환 방법은, 기존의 배 발생 캘러스를 이용한 particle bombardment 방식의 형질전환 및 배 발생 캘러스의 원형질체를 이용한 형질전환 방법에서 나타나는, 낮은 형질전환 효율, 외래유전자의 여러 copy 도입에 의한 gene silence, 형질전환 시 기술적 어려움 등의 문제점을 보완할 것으로 보 여진다.
- 기존에 보고된 오이형질전환 연구에서도 동일한 선발 유전자를 이용하였고 선발 물질로서는 kana- mycin만을 사용하였다. 본 연구에서 사용된 오이배발생 캘러스는 kanamycin에 의한 증식 저해는 크게 나타나지 않았다. 이는 현탁배양 중인 벼캘러스에 다양한 항생물질을 처리하여 생육저해 정도를 조사한 Dekeyser 등(1989)의 결과와 매우 유사하며, 벼를 포함하는 화본과 식물체는 이미 kana- mycin에 높은 저항성을 나타내고 있다는 점이 보고된 바 있다.
- 순화 과정 이후 포장에서 3개월 이상 생장한 잎 절편 재료에서 DNA를 분리하고 PCR 분석를 실시한 결과, pGA-bar 벡터를 주형으로 증폭한 것과 동일한 위치에 bar 와 전자의 band가 확인되었다. PCR 증폭산물이 bar 유전자임을 Southern blot 분석을 통하여 재확인하였다 (사진 미제시).
- 본 연구방법을 통해 생산된 형질전환 오이에서 bar 유전자가 전사 수준에서 발현되고 있음을 RNA분석을 통하여 확인하였으며, 또한 포장에서 제초제의 저항성을 나타냄으로써 단백질 수준에서도 정상적으로 작용함을 확인하였다 한편 오이의 형질전환을 위하여 현탁배양계를 이용하고 한 flask 내에서 Agrobacterium의 접종 및 선발 과정을 동시에 수행한 방법은 보고되어 있지 않다. 이와 같이 분열능과 재분화 능이 강한 배 발생 캘러스의 현탁배양계에 직접 Agrobacterium 접종을 통한 형질전환 방법은, 기존의 배 발생 캘러스를 이용한 particle bombardment 방식의 형질전환 및 배 발생 캘러스의 원형질체를 이용한 형질전환 방법에서 나타나는, 낮은 형질전환 효율, 외래유전자의 여러 copy 도입에 의한 gene silence, 형질전환 시 기술적 어려움 등의 문제점을 보완할 것으로 보 여진다.
- 이후 형질전환 식물체에서 bar 유전자의 발현을 조사하기 위하여 bar probe-g- 이용하여 northern blot 분석을 실시한 결과, 대조구를 제외한 5개의 형질전환 오이 개체 전체에서 예상되는 약 0.5 Kb 위치에 bar-mRNA 밴드가 표지되어 있음을 확인하였다 (Figure. 3).
- 1C). 전체 처리구에서 배 발생 캘러스의 갈변과 증식의 저해가 뚜렷하게 관찰되었다.
후속연구
- 한편 본 제초제 저항성 오이는 교배를 통한 육종에서 Fi 잡 종종자 확인에 지표 유전자로 이용이 가능하므로 순도 향상에 사용될 수 있을 것이다.
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