난자와 난구세포간 Cell-to-Cell Communication이 난자에 미치는 영향 Effects of the Cell-to-Cell Communication between Oocyte and Cumulus Cells on the Quality of Oocytes원문보기
난자와 난포세포는 gap junction channel을 통해 긴밀한 연락을 주고받음으로써 난자의 발달이나 난포의 성장에 영향을 미친다. 본 연구는 같은 크기의 난포에서 나온 난자라고 하여도 cumulus cell(난구세포)들이 붙어있는 상태가 다르다는 것을 관찰, 이렇게 난구세포와의 서로 다른 연결상태를 갖는 난자의 재질에 차이가 있을 것으로 가정하고, 난자의 competence와 이때 난자와 난구세포 사이의 cell-to-cell communication에 관여하는 gap junction protein인 connexin(CX) 37과 CX 43의 발현 정도가 어떤 상관관계가 있는지를 알아보고자 수행하였다. 생후 3주일 된 생쥐에 PMSG를 주입하고 48시간 후에 난소를 적출하여 난포를 450 $\mu\textrm{m}$ 이상(large)의 난포와 200～400 $\mu\textrm{m}$(small) 난포로 분리하여 그 난자를 얻었다. 난자에 난구세포가 compact하게 붙어있는 것은 intact로(L1, Sl), 난구세포가 어느 정도 붙어 있거나, 하나도 붙어있지 않은 것은 partial/denuded로 그룹을 나누었다(LPD. SPD). 각 그룹의 난자를 체외에서 성숙시키고, 수정시켜서 발달율을 비교하였다. 각각의 CX의 mRNA 발현을 RT-PCR과 in situ hybridization으로 비교하였다. intact와 denuded 난자의 비율은 큰 난포의 경우는 55%와45%의 비율로, 작은 난포의 경우는 30%와 70%의 비율로 난포가 작을수록 denude상태의 난자가 많이 나왔다. 어떤 경우의 난자는 체외 성숙율은 차이가 없이 모두 97%이상 성숙하였다. 그러나, 수정률에서는 차이를 보여서 intact한 난자에서 높은 수정율을 보였으며, SPD의 경우, 가장 낮은 수정ㆍ발달율을 보였다. 난자의 경우, 주로 발현되는 것은 CX 37이었으며, CX 43은 발현되지 않았다. 난구세포의 경우, CX 43이 가장 높게 발현하였고, 그 다음으로 CX 37이 관찰되었다. 본 실험 결과, 같은 발달크기의 난포라고 하더라도 그 안에 존재하는 난자의 상태는 난구세포와 얼마나 밀접한 cell-to-cell communication을 이루고 있느냐에 따라 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 본 연구결과 다음과 같이 결론 내릴 수 있었다. 1)아직 발달이 끝나지 않은 난포에서 나온 미성숙난자라고 하여도 난구세포와 밀접한 연결을 갖는 경우 성숙난자와 거의 같은 능력을 갖고 있으며, 2) 난자와 난구세포간의 gap junctional communication은 heterotypic channel로 이루어지고, 3) 본 연구에서 관찰한 CX 43과 CX 37 두 종류만으로는 intact와 denuded의 차이점을 설명할 수 없었다.
난자와 난포세포는 gap junction channel을 통해 긴밀한 연락을 주고받음으로써 난자의 발달이나 난포의 성장에 영향을 미친다. 본 연구는 같은 크기의 난포에서 나온 난자라고 하여도 cumulus cell(난구세포)들이 붙어있는 상태가 다르다는 것을 관찰, 이렇게 난구세포와의 서로 다른 연결상태를 갖는 난자의 재질에 차이가 있을 것으로 가정하고, 난자의 competence와 이때 난자와 난구세포 사이의 cell-to-cell communication에 관여하는 gap junction protein인 connexin(CX) 37과 CX 43의 발현 정도가 어떤 상관관계가 있는지를 알아보고자 수행하였다. 생후 3주일 된 생쥐에 PMSG를 주입하고 48시간 후에 난소를 적출하여 난포를 450 $\mu\textrm{m}$ 이상(large)의 난포와 200～400 $\mu\textrm{m}$(small) 난포로 분리하여 그 난자를 얻었다. 난자에 난구세포가 compact하게 붙어있는 것은 intact로(L1, Sl), 난구세포가 어느 정도 붙어 있거나, 하나도 붙어있지 않은 것은 partial/denuded로 그룹을 나누었다(LPD. SPD). 각 그룹의 난자를 체외에서 성숙시키고, 수정시켜서 발달율을 비교하였다. 각각의 CX의 mRNA 발현을 RT-PCR과 in situ hybridization으로 비교하였다. intact와 denuded 난자의 비율은 큰 난포의 경우는 55%와45%의 비율로, 작은 난포의 경우는 30%와 70%의 비율로 난포가 작을수록 denude상태의 난자가 많이 나왔다. 어떤 경우의 난자는 체외 성숙율은 차이가 없이 모두 97%이상 성숙하였다. 그러나, 수정률에서는 차이를 보여서 intact한 난자에서 높은 수정율을 보였으며, SPD의 경우, 가장 낮은 수정ㆍ발달율을 보였다. 난자의 경우, 주로 발현되는 것은 CX 37이었으며, CX 43은 발현되지 않았다. 난구세포의 경우, CX 43이 가장 높게 발현하였고, 그 다음으로 CX 37이 관찰되었다. 본 실험 결과, 같은 발달크기의 난포라고 하더라도 그 안에 존재하는 난자의 상태는 난구세포와 얼마나 밀접한 cell-to-cell communication을 이루고 있느냐에 따라 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 본 연구결과 다음과 같이 결론 내릴 수 있었다. 1)아직 발달이 끝나지 않은 난포에서 나온 미성숙난자라고 하여도 난구세포와 밀접한 연결을 갖는 경우 성숙난자와 거의 같은 능력을 갖고 있으며, 2) 난자와 난구세포간의 gap junctional communication은 heterotypic channel로 이루어지고, 3) 본 연구에서 관찰한 CX 43과 CX 37 두 종류만으로는 intact와 denuded의 차이점을 설명할 수 없었다.
Production of a mature oocyte is a complex process that requires the close association between oocyte and follicular cells. The present study was conducted to investigate the difference between oocytes with and without close junctional communication with cumulus cells and the involvement of two conn...
Production of a mature oocyte is a complex process that requires the close association between oocyte and follicular cells. The present study was conducted to investigate the difference between oocytes with and without close junctional communication with cumulus cells and the involvement of two connexins(CXs) in the interactions. Follicles at different sizes(small: 200～400 ㎛; large:>450 ㎛) were mechanically isolated from PMSG-primed mouse ovaries, and punctured to get cumulus-oocyte complex(COC). Oocytes were released themselves(denuded), with partially attached(partial), or with tightly attached(intact) cumulus cells. Maturation and fertilization capacity of the COCs were measured. Expression of CX 37 and CX 43 was examined by RT-PCR and in situ hybridization. The ratio between intact COC and denude/partial oocytes was 30％(SI) and 70％(SPD) in small follicles, while 55％(LI) and 45％(LPD) in large follicles, respectively. Maturation and fertilization rates of the released oocytes were similar among SI, LPD, LI groups, but those were significantly lower in SPD oocytes. In oocytes, CX 37 was the major CX and CX 43 was not expressed, whereas in the cumulus cells, CX 43 was the major, and CX 37 was the next. Results of the present study suggest that 1) immature oocytes from small follicles with intact cell-to-cell communication with cumulus have the similar quality to that of the oocytes from larger follicles, 2) gap junction between oocyte and cumulus cells may be the heterotypic channel, and 3) we could not explain the difference in the cell-to-cell communication between intact and partial/denuded COCs through the expression of the two CXs.
Production of a mature oocyte is a complex process that requires the close association between oocyte and follicular cells. The present study was conducted to investigate the difference between oocytes with and without close junctional communication with cumulus cells and the involvement of two connexins(CXs) in the interactions. Follicles at different sizes(small: 200～400 ㎛; large:>450 ㎛) were mechanically isolated from PMSG-primed mouse ovaries, and punctured to get cumulus-oocyte complex(COC). Oocytes were released themselves(denuded), with partially attached(partial), or with tightly attached(intact) cumulus cells. Maturation and fertilization capacity of the COCs were measured. Expression of CX 37 and CX 43 was examined by RT-PCR and in situ hybridization. The ratio between intact COC and denude/partial oocytes was 30％(SI) and 70％(SPD) in small follicles, while 55％(LI) and 45％(LPD) in large follicles, respectively. Maturation and fertilization rates of the released oocytes were similar among SI, LPD, LI groups, but those were significantly lower in SPD oocytes. In oocytes, CX 37 was the major CX and CX 43 was not expressed, whereas in the cumulus cells, CX 43 was the major, and CX 37 was the next. Results of the present study suggest that 1) immature oocytes from small follicles with intact cell-to-cell communication with cumulus have the similar quality to that of the oocytes from larger follicles, 2) gap junction between oocyte and cumulus cells may be the heterotypic channel, and 3) we could not explain the difference in the cell-to-cell communication between intact and partial/denuded COCs through the expression of the two CXs.
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문제 정의
2). 각 난자의 발생능력과 이때 난자와 난구세포 사이의 cell -to-cell communication0, ] 관여하는 gap junctional protein CX 43과 CX 37의 발현 정도가 어떤 상관관계를 갖는지 알아보고자 본 연구를 수행하였다.
, 1999). 본 연구에서 SI 그룹의 난자가 미성숙난자이면서도 성숙난자를 이용할 때와 같은 결과를 가져올 수 있는 능력을 갖고 있다는 것을 간접적으로 보여주는 결과라고 생각되며 이 또한 난자의 능력을 결정하는데 난구세포와의 결합이 중요함을 시사해준다.
본 연구에서는 발달상태가 비슷한 같은 크기의 난포로부터 나온 난자라고 하여도 난포내에서 난자와 난구세포가 연결되어 있었던 상태에 따라서 난자의 능력도 달라질 것이라는 가설을 증명하기 위하여 수행되었으며, 실제로 난구세포와의 결합정도에 따라서 난자의 능력이 결정된다는 것을 확 인하였다.
본 연구에서는 위에서 언급한 바와 같이 folliculogenesis 동안 그 역할이 매우 중요한 것으로 알려져 있는 CX 43과 CX 37의 유전자 발현을 알아보고자 네 그룹의 난자와 그 곁을 싸고 있는 난구세포를 각각 분리하여 RT-PCR을 수행하였고, 분포를 다시 한 번 확인하기 위하여 in situ hybridization을 수행하였다. 이제까지 보고된 많은 연구들이 모두 난자와 과립 세포에 초점을 맞추고 있는 반면 본 연구팀은 난구세포에 초점을 두었다.
본 연구팀은 난소로부터 난포를 물리적으로 분리해 낸 다음, 각각의 크기별로 난포를 터뜨려 난자를 얻어내는 과정에서 같은 크기의 난포에서 나온 난자라고 하여도 난구세포가 붙어 있는 상태가 다르다는 것을 관찰하게 되었다(Fig. 1). 이렇게 난구세포와의 서로 다른 연결상태를 갖는 경우 즉, 난구세포와 밀접하게 연결되어 있던 난자와 그렇지 못한 난자는 서로 주고받는 물질교환의 성격에 달라지고, 따라서 그 난자의 능력에 차이가 있을 것으로 가정하게 되었다(Fig.
가설 설정
1). 이렇게 난구세포와의 서로 다른 연결상태를 갖는 경우 즉, 난구세포와 밀접하게 연결되어 있던 난자와 그렇지 못한 난자는 서로 주고받는 물질교환의 성격에 달라지고, 따라서 그 난자의 능력에 차이가 있을 것으로 가정하게 되었다(Fig. 2). 각 난자의 발생능력과 이때 난자와 난구세포 사이의 cell -to-cell communication0, ] 관여하는 gap junctional protein CX 43과 CX 37의 발현 정도가 어떤 상관관계를 갖는지 알아보고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
RNA probe의 생산을 확인하기 위하여 반응물 1 ㎕이를 1% agarose gel에 전기영동하여 band를 조사하였다. DNA 양을 확인한 후 probe 반응물을 G-50 Columns(Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Piscataway, NJ)으로 정제한 후 DNA 농도가 iOO/zg/ml이 되도록 Hybe buffer(50% formamide, 5X SSC, 1mg/ml Torula yeast RNA, lOOpg/ml heparin, IX Denhardt's solution, 0.1% Tween-20, 0.1% CHAPS, 0.5mM EDTA)로 희석하였다.
In Situ Hybridization에 사용되는 RNA probe를 제작하기 위하여, RNA in vitro transcription PNA vitro transcription kit, Promega) 반응을 시켰다. 이때 1 ㎍/㎕ 1 DNA template(l ^1), 5X Trans buffer(4 //I), RNAsin(2㎕), T7 또는 SP6 RNA poly- merase(2 //I), DIG RNA labeling mix(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 2㎕), lOOmM DTT(2㎕) 및 DEPC-H2O를 전체 20㎕가 되도록 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 RNase-free DNase I(Gibco BRL)을 처리하였다.
여분의 용액을 제거하고 anti-DIG antibody(Boehringer Mannheim)를 blocking reagent가 포함된 MAB 용액으로 i000배 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. MAB 용액으로 10분씩 4회 수세하고 BCIP-NBT(Sigma)로 실온에서 1시간 발색시켰다. 발색 후 PBS로 수세하고, Nuclear Fast Red로 counter stain 한 후 Aqueous mounting medium(DAKO, Carpinteria, CA)으로 봉입 하였다.
5% agarose gel에 전기영동한 후에 ethidium bro- mide로 염색하여 확인하였다. PCR reaction에서 cDNA의 존재를 확인하고 RT-PCR을 통한 상대적인 양을 비교하고자 GAPDH 발현을 positive cormol로 사용하였다. 상대적인 CX 37, CX 43의 발현 정도를 알아보기 위하여 전기영동한 결과를 Image Analyzer(Vilber Loumiat, France)를 이용하여 정량분석하고, GAPDH의 발현에 대한 CX 37, CX 43발현 정도를 arbitrary unit(AU)로 환산하였다.
이때 예상되는 PCR 결과는 각각 446bp, 437bp, 461bp이었다. PCRe 75mM Tris-HCI(pH8.8), 20mM (NH4)2SO4, 1.5mM MgCl2, 0.01% Tween 20, 0.2mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0.625 Unit Taq DNA polymerase가 포함된 PCR master mixture (ABgene, Survey, UK)를 전체 25 ㎕ 반응으로 하여 시행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation 반응한 후에 94℃ 에서 40초간 denaturation, 60℃ 에서 40초간 annealing, 72 ℃ 에서 1분간 extension을 40회 반복하였고 postelongation 반응을 72C에서 10분간 실시하였다.
이때 1 ㎍/㎕ 1 DNA template(l ^1), 5X Trans buffer(4 //I), RNAsin(2㎕), T7 또는 SP6 RNA poly- merase(2 //I), DIG RNA labeling mix(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 2㎕), lOOmM DTT(2㎕) 및 DEPC-H2O를 전체 20㎕가 되도록 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 RNase-free DNase I(Gibco BRL)을 처리하였다. RNA probe의 생산을 확인하기 위하여 반응물 1 ㎕이를 1% agarose gel에 전기영동하여 band를 조사하였다. DNA 양을 확인한 후 probe 반응물을 G-50 Columns(Amersham Pharmacia Biotech Ltd.
상대적인 CX 37, CX 43의 발현 정도를 알아보기 위하여 전기영동한 결과를 Image Analyzer(Vilber Loumiat, France)를 이용하여 정량분석하고, GAPDH의 발현에 대한 CX 37, CX 43발현 정도를 arbitrary unit(AU)로 환산하였다. RT-PCR을 통해 얻어진 productfe- CX의 염기서열임을 sequencing을 실시하여 확인하였고, 원하는 유전자의 염기서열임이 입증된 클론은 In situ hybridization을 시행하기 위하여 보관하였다.
각 그룹의 난자는 1.5% hyaluronidase를 포함한 배양액에 넣어 37C에서 1시간 동안 기다렸다가, 효소 처리되어 느슨해 진 COC를 난자의 직경과 같게 뽑은 이ass micropipette 을 통과시킴으로서 난자로부터 난구세포를 물리적으로 떼어내어 denuded 난자를 만들었고, 한 번 실험에 6~8개의 난소를 사용하여 얻어지는 난자의 수는 LI, LPD, SI, SPD 각 그룹에 38, 28, 22, 67개의 비율로 얻어졌으며, 다섯 번 실험을 반복하였다. 이때 모아진 각 그룹의 난구세포들은 효소가 들어 있지 않은 새로운 배양액으로 2번 washing하여 사용하였다.
001g/ml와 BSA 가 포함된 배지에서 37℃에서 2시간 동안 capacitation시킨 정자를 난자와 함께 4시간 동안 incubation하였다. 그 이후 난자의 발달은 P1 배양액에 fetty acid-free BSA(3mg/ml), modified Eagle medium nonessential(0.5 %), 그리고 essential amino acid solution(l%), hemoglobin(l ㎍ /ml), EDTA(O.lmM)를 첨가하여 배양하였다.
난자의 in vitro maturatione TCM 199에 10% FBS(Hyclone, Logan LIT), PMSG(Folligon; Intervet, Boxmeer, Holland) 100 IU, HCG(Chorulon; Intervet, Boxmeer, Holland)가 첨가된 배지 에서 배양하였다. 난자의 MH stage까지의 상태를 확인하고 IVF(in vitro fertilization) 를 진행하였다. IVF는 Pl (Irvine Scientific Co.
난자의 in vitro maturatione TCM 199에 10% FBS(Hyclone, Logan LIT), PMSG(Folligon; Intervet, Boxmeer, Holland) 100 IU, HCG(Chorulon; Intervet, Boxmeer, Holland)가 첨가된 배지 에서 배양하였다. 난자의 MH stage까지의 상태를 확인하고 IVF(in vitro fertilization) 를 진행하였다.
MAB 용액으로 10분씩 4회 수세하고 BCIP-NBT(Sigma)로 실온에서 1시간 발색시켰다. 발색 후 PBS로 수세하고, Nuclear Fast Red로 counter stain 한 후 Aqueous mounting medium(DAKO, Carpinteria, CA)으로 봉입 하였다.
PCR reaction에서 cDNA의 존재를 확인하고 RT-PCR을 통한 상대적인 양을 비교하고자 GAPDH 발현을 positive cormol로 사용하였다. 상대적인 CX 37, CX 43의 발현 정도를 알아보기 위하여 전기영동한 결과를 Image Analyzer(Vilber Loumiat, France)를 이용하여 정량분석하고, GAPDH의 발현에 대한 CX 37, CX 43발현 정도를 arbitrary unit(AU)로 환산하였다. RT-PCR을 통해 얻어진 productfe- CX의 염기서열임을 sequencing을 실시하여 확인하였고, 원하는 유전자의 염기서열임이 입증된 클론은 In situ hybridization을 시행하기 위하여 보관하였다.
생후 21일 된 ICR 생쥐에 5 IU의 PMSG를 주사하고 48시간 후에 경추탈골시킨 후 난소를 얻어 해부현미경 하에서 FBS와 dbcAMP가 들어있는 TCM-199(Gibco, Grand Island, NN)에서 난포를 크기별로 분리하였다. 새 배양액으로 옮겨 세척한 후 450/zm 이상의 난포(large)와 200~400㎛(small) 난포로 나누어 난포를 터뜨려 난자를 얻었다. 이때 난자는 난구세포가 밀접하게 둘러싸고 있는 상태로 나오거나(intact), 혹은 난구세포가 성글게 붙어 있는 경우(partial), 그리고 전혀 동반된 난구세포 없는 상태(denuded)로 방출된다.
생쥐의 난소조직을 4% paraformaldehyde에 고정시킨 후 paraffin block을 제작하였으며, 5 ㎛ 두께의 절편을 silanized glass slide에 부착하여 보관하였다. Paraffin 절편 슬라이드를 xylene에 처리하여 paraffin을 제거하고, 알코올 처리과정을 거쳐 PBS 용액으로 세척한 후 4% paraformaldehyde 용액으로 실온에서 10분간 재고정 하였다.
생후 21일 된 ICR 생쥐에 5 IU의 PMSG를 주사하고 48시간 후에 경추탈골시킨 후 난소를 얻어 해부현미경 하에서 FBS와 dbcAMP가 들어있는 TCM-199(Gibco, Grand Island, NN)에서 난포를 크기별로 분리하였다. 새 배양액으로 옮겨 세척한 후 450/zm 이상의 난포(large)와 200~400㎛(small) 난포로 나누어 난포를 터뜨려 난자를 얻었다.
위와 같은 가정 하에서 우선 난자의 체외성숙정도, 수정능력, 그리고 2서]포기로 발달하는 정도를 비교하였다. 아직 덜 발달한 작은 난포로부터 나온 난자라고 하여도 3% 정도의 난자만 GV 상태로 남아 있었을 뿐, 대부분 핵성숙이 일어났다.
In Situ Hybridization에 사용되는 RNA probe를 제작하기 위하여, RNA in vitro transcription PNA vitro transcription kit, Promega) 반응을 시켰다. 이때 1 ㎍/㎕ 1 DNA template(l ^1), 5X Trans buffer(4 //I), RNAsin(2㎕), T7 또는 SP6 RNA poly- merase(2 //I), DIG RNA labeling mix(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; 2㎕), lOOmM DTT(2㎕) 및 DEPC-H2O를 전체 20㎕가 되도록 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 후 RNase-free DNase I(Gibco BRL)을 처리하였다. RNA probe의 생산을 확인하기 위하여 반응물 1 ㎕이를 1% agarose gel에 전기영동하여 band를 조사하였다.
PCR 조건은 94℃에서 5분간 predenaturation 반응한 후에 94℃ 에서 40초간 denaturation, 60℃ 에서 40초간 annealing, 72 ℃ 에서 1분간 extension을 40회 반복하였고 postelongation 반응을 72C에서 10분간 실시하였다. 이를 통해 얻어진 PCR product는 1.5% agarose gel에 전기영동한 후에 ethidium bro- mide로 염색하여 확인하였다. PCR reaction에서 cDNA의 존재를 확인하고 RT-PCR을 통한 상대적인 양을 비교하고자 GAPDH 발현을 positive cormol로 사용하였다.
역전사(reverse transcription) 반응에는 RNA suspension 5 ㎕ 를 사용하여 SuperScript Preaniplification System(Gibco)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 총 반응 용액을 20㎕로 하여 SuperScript ]J RNase H- reverse transcriptase 200U, oligo(dT) 12-18 primer 0.5을 사용하여 cDNA를 합성하였고 negative contr이로는 reverse transcriptase 없이 반응한 것을 cDNA 대신 사용하였다.
대상 데이터
이때 난자는 난구세포가 밀접하게 둘러싸고 있는 상태로 나오거나(intact), 혹은 난구세포가 성글게 붙어 있는 경우(partial), 그리고 전혀 동반된 난구세포 없는 상태(denuded)로 방출된다. Large fbl- licle과 small fbllicle에서 나온 난자를 다시 intact한 난자를 한 그룹으로, 그리고 partial과 denuded 난자를 합쳐서 다른 한 그룹으로 하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
체외배양되는 난자의 성숙정도 및 정상적인 2-세포기 형성 성적의 비교는 ANOVA로 분석하였다. 유의차에 대한 수준은 p 값이 0.
성능/효과
4A). 그러나 이들 난자의 체외수정 후 정상적 인 2서]포기 배아로의 발달율을 비교하여 보면 LI, LPD, SI 난자에서 75.9%, 62.4%, 68.6%를 보인 반면, SPD 난자는 32.2 %로 통계적으로 유의하게 낮은 발달율을 보였다(Fig. 4B).
따라서 난구세포와 난자의 결합력도 난포의 성장과 함께 증가할 것으로 생각되었다. 그러나, 450 ㎛ 이상의 충분히 자란 antral follicle 즉, preovulatory 난포로부터 얻어진 난자의 경우에도, 난구세포와 밀접하게 붙어 있는 intact한 상태의 난자가 의외로 적어서 55% 정도였고, 난구세포와 느슨한 cell-to-cell 결합을 갖는 난자가 기대 밖으로 많아서 45%나 되었다. 반면에 작은 난포로부터도 30%의 난자는 난구세포와 매우 밀접하게 결합한 채로 얻어지는데, 성숙한 난포로부터 나온 intact한 난자와 외형적으로 다를 것이 없었다.
그러나, preovulatoiy 난포에서 나온 성숙한 난자의 경우에는 충분한 시간을 두고 정상적인 발생을 한 난자, 즉 preovulatoiy 난포의 경우에는 거의 같은 수준의 발생 능력을 보유하게 된 것으로 생각된다. 그러나, 두 군간의 차이가 통계학적으로는 의미가 없었지만, 역시 intact한 난구세 포를 가졌던 난자(LI)의 능력이 그렇지 못한 난자(LPD)보다 좋은 경향을 보였다. 이와 같이 난포의 크기가 충분히 발달 하는 동안 그 안의 난자는 충분한 발생능력을 갖게 된다는 점은 여러 종류의 동물에서 난포를 크기별로 비교한 연구논문에서 잘 알려져 있다(Lonergan et al.
아직 덜 발달한 작은 난포로부터 나온 난자라고 하여도 3% 정도의 난자만 GV 상태로 남아 있었을 뿐, 대부분 핵성숙이 일어났다. 그러나, 이렇게 체외에서 성숙한 난자를 수정시키고 2-세 포기까지 발달시켜 봤을 때에는 그 능력의 차이가 나타나기 시작하여 각각의 크기의 난포에서 비교해 볼 때, intact한 난 구세포를 갖는 난자가 그렇지 못한 난자에 비해 높은 수정과 발생률을 보였다. 그러나, preovulatoiy 난포에서 나온 성숙한 난자의 경우에는 충분한 시간을 두고 정상적인 발생을 한 난자, 즉 preovulatoiy 난포의 경우에는 거의 같은 수준의 발생 능력을 보유하게 된 것으로 생각된다.
이렇게 난포가 자라는 동안 난자도 함께 성장하는데, 난포의 성장이 진행되는 동안 난자는 난포 표면으로부터 멀어지게 되므로 주위의 난구세포와 과립세포 등과 밀접하게 결합함으로써 난포 밖으로부터 공급되는 여러가지 물질의 원활한 수송을 꾀할 수 있게 된다. 따라서 난구세포와 난자의 결합력도 난포의 성장과 함께 증가할 것으로 생각되었다. 그러나, 450 ㎛ 이상의 충분히 자란 antral follicle 즉, preovulatory 난포로부터 얻어진 난자의 경우에도, 난구세포와 밀접하게 붙어 있는 intact한 상태의 난자가 의외로 적어서 55% 정도였고, 난구세포와 느슨한 cell-to-cell 결합을 갖는 난자가 기대 밖으로 많아서 45%나 되었다.
본 연구결과로는 서로 다른 강도를 갖는 난자와 난구세포 간의 cell-to-cell communication에 관여하는 CX의 종류를 알아낼 수 없었으나 난구세포와의 연결 정도가 서로 다른 난자는 확실히 서로 다른 능력을 갖는다는 생리학적 사실을 확인할 수 있었다. 또한, 난자와 난구세포간의 gap junctione 서로 다른 종류의 CX로 이루어져서 heterotypic할 것이라는 것을 알 수 있었다. 따라서 이 후의 연구는 이렇게 같은 발달단계라도 난구세포와의 결합정도에 따라 서로 다른 능력을 갖는 난자간의 실제 능력의 차이점이 무엇인지 난자 자체의 유전자 발현의 차이점에 초점을 맞추어서 연구할 필요가 있을 것으로 사료된다.
본 연구결과로는 서로 다른 강도를 갖는 난자와 난구세포 간의 cell-to-cell communication에 관여하는 CX의 종류를 알아낼 수 없었으나 난구세포와의 연결 정도가 서로 다른 난자는 확실히 서로 다른 능력을 갖는다는 생리학적 사실을 확인할 수 있었다. 또한, 난자와 난구세포간의 gap junctione 서로 다른 종류의 CX로 이루어져서 heterotypic할 것이라는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서도 미발달된 작은 난포로부터 나온 미성숙 난자들 중에서 난구세포와 밀접한 결합을 갖지 못하였던 난자 (SPD)는 2세포기 배아를 형성한 것이 32.2%로 그 성적이 다른 세 그룹의 난자보다 월등히 낮았다. 그러나, 이때에 예상치 못했던 결과를 얻은 것은 아직 덜 발달한 작은 난포로부터 나온 난자 중 30%의 난자, 난구세포와 밀접한 결합을 갖고 있던 미성숙난자(S1)의 능력이었다.
여성의 정상적인 배란은 난포가 20mm 이상으로 자랐을 때 일어나는데, 위 연구에서는 폐기되는 난소로부터 2~5mm 정도 크기의 난포로부터 미성숙난자를 얻어, 체외성숙과 시험관아기 방법을 통해 임신과 출산에 성공하게 된 것이다. 이 연구로부터 미성숙 난자로부터도 정상적인 아기가 탄생할 수 있다는 사실이 밝혀지게 되었고, 이는 그 시기의 작은 난포라고 하여도 그 안의 미성숙 난자는 성숙한 난자와 같은 능력을 갖고 있음을 시사해주는 결과였다. 또한 미성숙난자를 이용한 시험 관아기 연구결과에서도 체외수정 성적은 성숙한 난자와 거의 차이가 없으나 임신률의 성적은 매우 낮아서 성숙한 난자와의 차이점이 분명히 있다는 것을 알 수 있다(Cha et al.
그러나, 이때에 예상치 못했던 결과를 얻은 것은 아직 덜 발달한 작은 난포로부터 나온 난자 중 30%의 난자, 난구세포와 밀접한 결합을 갖고 있던 미성숙난자(S1)의 능력이었다. 이들로부터 2-세포기의 배아가 만들어진 성적은 68.6%로서 이는 큰 난포로부터 얻어진 성숙한 난자로부터 얻어진 결과와 차이가 없었으며, 비록 통계적으로 유의한 차이는 없었으나 LPD 그룹의 난자 (62.4%)보다 오히려 높은 경향을 보인 것이었다. 즉, 충분히 발달한 난포로부터 얻은 성숙한 난자에 비하여 통계적으로 유의한 차이가 없이 좋은 성적이었다.
3). 이렇게 회수된 난자를 체외에서 배양하면서 체외성숙을 유도하였을 경우 어느 난포에서 나왔던 상관없이 intact COC의 경우 LI에서 100%, SI에서 98.6% 핵성숙이 일어났으며, partia 1/denuded의 경우에도 96.6%(LPD), 96.7%(SPD)의 핵성숙율 을 보였다(Fig. 4A). 그러나 이들 난자의 체외수정 후 정상적 인 2서]포기 배아로의 발달율을 비교하여 보면 LI, LPD, SI 난자에서 75.
즉, 충분히 발달한 난포로부터 얻은 성숙한 난자에 비하여 통계적으로 유의한 차이가 없이 좋은 성적이었다. 이와 같이 작은 난포로부터 나온 난자는 체외배양에서 거의 모두 핵성숙을 이루었으나, 수정능력과 배발달 능력에는 차이를 보이는 것으로 보아서 난포발달 과정 중 함께 진행되는 난자의 발달과정 중에 난구세포를 통한 물질교환이 난자의 능력을 결정하는데 매우 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
4%)보다 오히려 높은 경향을 보인 것이었다. 즉, 충분히 발달한 난포로부터 얻은 성숙한 난자에 비하여 통계적으로 유의한 차이가 없이 좋은 성적이었다. 이와 같이 작은 난포로부터 나온 난자는 체외배양에서 거의 모두 핵성숙을 이루었으나, 수정능력과 배발달 능력에는 차이를 보이는 것으로 보아서 난포발달 과정 중 함께 진행되는 난자의 발달과정 중에 난구세포를 통한 물질교환이 난자의 능력을 결정하는데 매우 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
후속연구
또한, 난자와 난구세포간의 gap junctione 서로 다른 종류의 CX로 이루어져서 heterotypic할 것이라는 것을 알 수 있었다. 따라서 이 후의 연구는 이렇게 같은 발달단계라도 난구세포와의 결합정도에 따라 서로 다른 능력을 갖는 난자간의 실제 능력의 차이점이 무엇인지 난자 자체의 유전자 발현의 차이점에 초점을 맞추어서 연구할 필요가 있을 것으로 사료된다.
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