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문제 정의
- 또한 체 외 수정을 위한 정자의 처리에 있어서 신선 난포액과 비활성화된 난 포액을 이용하는 문제와 채취된 난포액 모두가 정자의 유인 능 및 운동성에 같은 영향을 미치는 지는 아직 밝혀지지 않 았다. 이에 본 연구에서는 모세관을 이용함으로써 정자들이 난관내로 이동하는 것을 모방하여 기존 연구들과는 다른 방 법으로써 난포액 sample 및 처리 방법 사이에 사람 정자에 대한 유인능과 운동성에 난포액의 영향 및 난포액의 처리 방법 에 의한 정자의 유인능 및 운동성을 조사하였다.
제안 방법
- 시험관 아기 시술을 위한 과배란 유도는 follicle stimulating hormone(FSH)/human menopausal gonadotrophin(hMG)과 gona dotrophin-releasing hormone(GnRH, Superfact, Serono, USA)agonist를 병용하여 사용한 환자들을 대상으로 난포의 크기 가 18 mm이상의 난포가 적어도 2개 이상이 자란 환자에서human chorionic gonadotrophin(hCG, Profaci, Serono, USA) 투여 36시간 후 질식 초음파 유도하에 난자와 함께 채취된 난 포액 중에서 육안적으로 혈액이 포함되어 있지 않은 두 sam- ple을 골랐다. 27세의 여성의 난관 장애(tubal factor)로 내원한 환자에서 채취한 sample A 및 29세의 남성 측의 불임요인 (male factor)으로 내원한 환자에서 채취한 sample B의 난포액 을 각각 2000 xg에서 30분간 원심분리하여 부유물질을 제 거 하였다. 이 들 sample을 각각 두 부분으로 나누어 절반은 56°C 에서 30분 동안 불활성화 처리를 하였는데 신선 난포액과 불 활성화 처리 난포액 모두 0.
- 시험관 아기 시술을 위한 과배란 유도는 follicle stimulating hormone(FSH)/human menopausal gonadotrophin(hMG)과 gona dotrophin-releasing hormone(GnRH, Superfact, Serono, USA)agonist를 병용하여 사용한 환자들을 대상으로 난포의 크기 가 18 mm이상의 난포가 적어도 2개 이상이 자란 환자에서human chorionic gonadotrophin(hCG, Profaci, Serono, USA) 투여 36시간 후 질식 초음파 유도하에 난자와 함께 채취된 난 포액 중에서 육안적으로 혈액이 포함되어 있지 않은 두 sam- ple을 골랐다. 27세의 여성의 난관 장애(tubal factor)로 내원한 환자에서 채취한 sample A 및 29세의 남성 측의 불임요인 (male factor)으로 내원한 환자에서 채취한 sample B의 난포액 을 각각 2000 xg에서 30분간 원심분리하여 부유물질을 제 거 하였다.
- 이렇게 준비된 모세관을 60 mm 배 양접시(Coming, USA) 에 놓은 후, 10 ml 의 m-HTF를 채운 다음 세척된 정자괴를 wax로 봉해진 모세관에 가까운 배양접시의 가장자리에 조심스럽게 주입하였다. 이 배양접시 를 1, 2 및 4시간 동안 37°C, 5% CO2 배 양기에서 배 양한 다음 tube 속에 있는 각각의 sample을 10 “1씩 gel loading pipette으 로 채취 하여 Markler counting chamber에 서 정 자의 수와 운동 성을 조사하였다. 활발한 직 진 혹은 곡선 운동적을 보이는 정 자를 운동성을 가진 정자로 분류하였는데, 각각의 처리군들 은 5명의 환자 정액을 사용하여 적어도 5번 이상 반복하였다.
- 5 cm로 균일하게 잘랐다. 이것의 한 쪽 부분 을 wax로 봉한 다음 반대편 끝에서 m-HTF 혹은 hFF를 wax로 봉한 지점으로부터 2 cm 지점까지 미세유리관을 사용하 여 조심스럽게 주입하였다. 이어 모든 모세관의 나머지 부분 을 m-HTF로써 입구까지 채웠다.
- 정액검사를 위하여 병원에 내원한 환자로 부터 채취한 정 액을 37°C warm plate에서 액화한 다음, 현미경하에서 Makler counting chamber(Sefi Medical Instruments, Israel)로써 정자의수와 운동성을 계산하였다. WHO(1999)의 규정에 의거하여 정상 소견을 보이는 환자의 정액을 10 ml의 hepes-buffered human tubal fluid에서 500 xg로 10분 동안 원심분리 하여 세척 한 다음, 분리된 정자괴를 실험에 사용하였다.
- 이 배양접시 를 1, 2 및 4시간 동안 37°C, 5% CO2 배 양기에서 배 양한 다음 tube 속에 있는 각각의 sample을 10 “1씩 gel loading pipette으 로 채취 하여 Markler counting chamber에 서 정 자의 수와 운동 성을 조사하였다. 활발한 직 진 혹은 곡선 운동적을 보이는 정 자를 운동성을 가진 정자로 분류하였는데, 각각의 처리군들 은 5명의 환자 정액을 사용하여 적어도 5번 이상 반복하였다.
대상 데이터
- 그리고Sodium dodecyl sulfete-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS- PAGE)는 Laemmli(1970)의 방법에 의해 수행하였다. Separa ting gel은 7.7% acrylamide(Bio-rad, USA), 그리고 stacking gel 은 4% acrylamide로써 제조하여 사용하였다. Sample lysis buf1는 0.
- 정액검사를 위하여 병원에 내원한 환자로 부터 채취한 정 액을 37°C warm plate에서 액화한 다음, 현미경하에서 Makler counting chamber(Sefi Medical Instruments, Israel)로써 정자의수와 운동성을 계산하였다. WHO(1999)의 규정에 의거하여 정상 소견을 보이는 환자의 정액을 10 ml의 hepes-buffered human tubal fluid에서 500 xg로 10분 동안 원심분리 하여 세척 한 다음, 분리된 정자괴를 실험에 사용하였다. 2
- 본 실험의 방법은 Fig. 1에서 보는 바와 같이 우선 내경 1.1 〜 1.2 mm, 외경 1.5〜 1.6 mm의 헤파린 미처리 모세관(Chase, U.S.A.)을 길이 4.5 cm로 균일하게 잘랐다. 이것의 한 쪽 부분 을 wax로 봉한 다음 반대편 끝에서 m-HTF 혹은 hFF를 wax로 봉한 지점으로부터 2 cm 지점까지 미세유리관을 사용하 여 조심스럽게 주입하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계학적 분석은 Microsta computer statistical program package를 사용하여 운동성을 가진 정자의 비율은 Chi-square test로, 유인된 정자의 수는 Student's t-test를 실시하여 처리군 간의 유의성을 검정하였다.
- 3에 나타난 바와 같다. 유인된 정자의 증가 비율 기준은 m-HTF를 함유하고 있는 모세 관을 1시 간 동안 배 양하였 을 때 모세관내 정자수를 기준(100%)으로 계산하였다. m- HTF 가 함유된 모세관에서 2 및 4시간 동안 정자의 증가된 비율은 각각 100, 140 및 144%를 나타내었다.
이론/모형
- 또한 총단백질량은 DADE(Dimension, USA)를 이 용하여 측정하였으며 Table 1에 나타난 바와 같다. 그리고Sodium dodecyl sulfete-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS- PAGE)는 Laemmli(1970)의 방법에 의해 수행하였다. Separa ting gel은 7.
- 난포액 내 leteinizing hormone(LH), FSH 농도는 ACS: 180 (Ciba coming, USA)를 이용하여 분석하였고, estradiol-17 0 및 progesterone은 radioimmunoassay(RIA) 방법을 사용하여 분 석하였다. 또한 총단백질량은 DADE(Dimension, USA)를 이 용하여 측정하였으며 Table 1에 나타난 바와 같다.
성능/효과
- 1에 나타난 바와 같다. LH, FSH 및 총단백질은 여성의 난관 장애(tubal factor)로 내원한 환자에서 채취한 sample A에서 높게 나타났으나 유의적인 (P<0.05) 차이가 없었으며, estradiol-17/9 및 progesterone은 남 성 측의 불임요인(male factor)으로 내원한 환자에서 채취한 sample B에 서 유의 적으로(PV0.05) 높게 나타났다. 또한 estra- diol-178에 대한 progesterone의 비 율은 sample A 및 sample B 에서 각각 14.
- 유인된 정자의 증가 비율 기준은 m-HTF를 함유하고 있는 모세 관을 1시 간 동안 배 양하였 을 때 모세관내 정자수를 기준(100%)으로 계산하였다. m- HTF 가 함유된 모세관에서 2 및 4시간 동안 정자의 증가된 비율은 각각 100, 140 및 144%를 나타내었다. 난포액 sample A에서는 배양 1, 2 및 4시간 후 유인된 정자 비율은 각각 332, 450 및 412%로 증가된 반면, 난포액 sample B에서는 120, 220 및 196%, 가열 처리된 난포액에서는 108, 133 및 150%의 증가율을 보여 m-HTF, 난포액 sample B 및 가열 처 리한 난포액 A보다 난포액 sample A에서 유인된 정자 비율 이 유의적으로(PV0.
- 4에 나타난 바와 같 다. m-HTF를 함유하고 있는 모세관에서는 1, 2 및 4시간 후 유인된 정자 중에서 운동성을 가진 정자의 비율은 각각 36, 36.5 및 20%를 나타냈다. 난포액 sample A에서는 79.
- 5 및 20%를 나타냈다. 난포액 sample A에서는 79.3 84.2 및 80.1%의 정자가 운동성을 가지고 있는 반면에, 난포액 sample B에서는 41.5, 42.8, 39.1%, 가열처리된 난포액에서는 44.1, 38.1 및 24.0%의 정자가 운동성을 가지고 있어, m-HTF 배양액, 난포액 sample B 혹은 가열 처리한 난포액 A보다 난 포액 sample A에서 운동성을 가진 정자의 비율이 유의적으 로(PV0.05) 높게 나타났으며, 1시간 동안 배양한 것 보다 2시 간 및 4시간에서 운동성 정자의 비율이 유의적으로(PV0.05) 높게 나타났다.
- m- HTF 가 함유된 모세관에서 2 및 4시간 동안 정자의 증가된 비율은 각각 100, 140 및 144%를 나타내었다. 난포액 sample A에서는 배양 1, 2 및 4시간 후 유인된 정자 비율은 각각 332, 450 및 412%로 증가된 반면, 난포액 sample B에서는 120, 220 및 196%, 가열 처리된 난포액에서는 108, 133 및 150%의 증가율을 보여 m-HTF, 난포액 sample B 및 가열 처 리한 난포액 A보다 난포액 sample A에서 유인된 정자 비율 이 유의적으로(PV0.05) 높았다.
- (1990)은 사람 난포액 내 존재하는 60〜70 kDa의 단백질 이 정자의 운동성을 자극한다고 보고하였다. 본 실험에서도 100 에서 5분 동안 가열처리된 난포액 sample A에서 정자의 유인능 및 운동성 이 현저히 감소함을 보여주고 있다. 이 역시 가열 처리로 인한 난포액 성분 중 정자를 유인 및 운동성에 영향을 주는 성분의 변성이 일어난 것으로 사료된다.
- 6%이었다. 신선 또는 불활성화 처리 난포액 그리고 0.22 또는 0.8/zm 의 filter 크기에 따른 난포액 처리간에 정자에 대한 유인 능 및 운동성에는 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 이상의 결과에서 난포액이 정자를 유인하는 주화성 물질 뿐만 아니라 정자의 운동성에 영향을 미치는 성분이 포함되 어 있다고 사료되며 난포액 sample 간에 정자에 대한 유인능 및 운동성에 미치는 영향은 차이가 있었다. 난포액내 proge- sterone의 농도보다는 어떤 다른 성분이 정자의 유인능 및 운 동성에 영향을 주는 것으로 판단되나, 난포액내에 어떤 성분 이 이러한 특성에 영향을 미치는지는 더욱 연구되어야 할 부 분이며, 난포액의 불활성화 처리는 정자의 유인능 및 운동성 에 영향을 주지 않았다.
후속연구
- 이상의 결과에서 난포액이 정자를 유인하는 주화성 물질 뿐만 아니라 정자의 운동성에 영향을 미치는 성분이 포함되 어 있다고 사료되며 난포액 sample 간에 정자에 대한 유인능 및 운동성에 미치는 영향은 차이가 있었다. 난포액내 proge- sterone의 농도보다는 어떤 다른 성분이 정자의 유인능 및 운 동성에 영향을 주는 것으로 판단되나, 난포액내에 어떤 성분 이 이러한 특성에 영향을 미치는지는 더욱 연구되어야 할 부 분이며, 난포액의 불활성화 처리는 정자의 유인능 및 운동성 에 영향을 주지 않았다. 그리고 체외 수정시 정자의 처리로 사용하는 난포액은 사전에 그 영향들을 조사한 후 사용하는 것이 바람직하다고 사료된다.
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