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문제 정의
- 본 연구는 손상된 골조직을 재생시키기 위해 생분해성과 기계적 물성을 동시에 갖는 천연 고분자 지지체를 합성할 목적으로, 세포간질 성분인 HA와 해조류에서 추출한 천연고분자인 sodium alginate (SA) 를 원료로 하여 model drug을 함입시킨 고분자 미립 구를 제조한 다음, 광가교 과정을 거친 후 이롤 압축 성형한 디스크를 제작하였다. 이들 디스크로부터의 시간 변화에 따른 약물 방출 특성과 생분해 특성을 실험실적으로 관찰하여 골조직 재생용 기능성 지지체로서의 웅용 가능성을 검토하였다.
- 디스크를 제작하였다. 이들 디스크로부터의 시간 변화에 따른 약물 방출 특성과 생분해 특성을 실험실적으로 관찰하여 골조직 재생용 기능성 지지체로서의 웅용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- , Tokyo, Japan)5. 350 nm 이상의 장파장이 제외된 UV 광을 조사하여 , 분자간 가교반응을 유발시킨 다음 (Fi용- ure 1(c)), 2일간 pH 7.0 PBS 용액에 침적시켜 잔존 미가교분을 제거하고 동결 건조한 후 스폰지 구조를 갖는 고분자 지지체를 얻었다. 다공성을 확인하기 위하여 디스크를 파단시켜 단면구조와 표면구조를 SEM으로 관찰하였다.
- 개질된 HA(CHT)와 SA(CSA)를 혼합비율울 10:0, 10 : 1, 9 : 1, 8 : 2로 하여 각각 1, 2, 5, 6 wt%의 수용액을 만들고 20분간 초음파로 처리하였다. CHT와 CSA/게 적용된 분무건조기 (Buchi Mini Spraydryer B-190, Swiss)의 운전조건을 다음교 같이 유지하여개잘된 HA 미립자들울 얻었다. 압축공기의 flow rate는 650과 800 NL/mm의 두 가지로 설정하였고, 용액의 inlet, temperature는 185 7C, outlet temperature는 110 °C, aspirator control 및 pump control은 각기 13과 4의 값으로 고정하였다.
- 개질된 HA 유도체들은 FT-IR, ultraviolet spectrometer (UNICAM UV/ Vis spectrometer UV 2, USA)와 4LNMR 측정으로 cinnamoyl기의 도입을 확인하였다. Cinnamoyl 기로 개질된 정도는 기지 농도의 cinnamoyl chlo ride 용액으로 UV 흡수도에 대한 농도별 검정 곡선을 이용하여 구하였다.
- Tetrabutylammonium hydroxide에 떨어뜨린 HA는 즉시 회수하여 동결 건조하였다. Fourier transformed infrared spectro meter (FT-IR) (Mattson 5000 FT-IR, Mattson In struments Inc., WI, USA)과 proton nuclear mag netic resonance spectrometer (!H-NMR) (Varian Unity Inova, 500 MHz, Germany) 측정으로 HA에 존재하던 -COOH가 염으로 치환되었음을 확인한 다음, 합성된 tetrabutylammonium hyaluronate 1 g 을 DMF (100 mL)와 pyridine (20mL)의 흔합용액에 녹인 뒤, 질소분위기 하에서 cinnamoyl chloride 5 mL를 20 mL의 DMF에 희석시켜 적하하였고, 8 시간 이상 빛을 차단한 채 4 P에서 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 최종 산물은 메틸알코올에 침전시키고 여과한 뒤 하룻밤 동안 진공건조기에서 건조시켰다 (Figure 1(a)).
- Model drug 으로서 NS AID 의 일종으로 현재 관절염 치료에 사용되고 있는 indomethac- ine을 선택하였다. Indomethacine은 다옴의 세 가지 방법으로 loading 하고 각각의 방출 특성을 비교 검토하였다,
- 개질된 HA 및 SA를 이용한 미립자의 제조. 분무건조법을 이용하면, 최적의 분무조건에서는 입경의 차이가 크지 않는 구형의 입자로 제조 가능하였다 (Figure 2).
- 건조시켜 얻은 백색 분말을 물에 녹여 분획 분자량이 8000인 투석튜브를 이용하여 18MQ의 탈이온수로 3일간 투석하여 미반응물을 제거한 다음, 동결 건조하여 최종적으로 백색 분말 (cinnamoylated tetrabutylammonium hyalu ronate; CHT)을 얻었다. 개질된 HA 유도체들은 FT-IR, ultraviolet spectrometer (UNICAM UV/ Vis spectrometer UV 2, USA)와 4LNMR 측정으로 cinnamoyl기의 도입을 확인하였다. Cinnamoyl 기로 개질된 정도는 기지 농도의 cinnamoyl chlo ride 용액으로 UV 흡수도에 대한 농도별 검정 곡선을 이용하여 구하였다.
- 개질된 HA(CHT)와 SA(CSA)를 혼합비율울 10:0, 10 : 1, 9 : 1, 8 : 2로 하여 각각 1, 2, 5, 6 wt%의 수용액을 만들고 20분간 초음파로 처리하였다. CHT와 CSA/게 적용된 분무건조기 (Buchi Mini Spraydryer B-190, Swiss)의 운전조건을 다음교 같이 유지하여개잘된 HA 미립자들울 얻었다.
- 반응이 끝난 뒤 최종 산물은 메틸알코올에 침전시키고 여과한 뒤 하룻밤 동안 진공건조기에서 건조시켰다 (Figure 1(a)). 건조시켜 얻은 백색 분말을 물에 녹여 분획 분자량이 8000인 투석튜브를 이용하여 18MQ의 탈이온수로 3일간 투석하여 미반응물을 제거한 다음, 동결 건조하여 최종적으로 백색 분말 (cinnamoylated tetrabutylammonium hyalu ronate; CHT)을 얻었다. 개질된 HA 유도체들은 FT-IR, ultraviolet spectrometer (UNICAM UV/ Vis spectrometer UV 2, USA)와 4LNMR 측정으로 cinnamoyl기의 도입을 확인하였다.
- 0 PBS 용액에 침적시켜 잔존 미가교분을 제거하고 동결 건조한 후 스폰지 구조를 갖는 고분자 지지체를 얻었다. 다공성을 확인하기 위하여 디스크를 파단시켜 단면구조와 표면구조를 SEM으로 관찰하였다.
- 7, 1mm인 디스크 형태로 제작하였다. 디스크 앞뒷면에 각각 10, 20, 30분간 자체 제작한 400 W UV lamp를 광원으로 하여 UV-D33S filter (Toshiba Co., Tokyo, Japan)5. 350 nm 이상의 장파장이 제외된 UV 광을 조사하여 , 분자간 가교반응을 유발시킨 다음 (Fi용- ure 1(c)), 2일간 pH 7.
- 지지체의 가수분해 특성. 모든 재료가 37 °C, pH 7.0의 PBS 용액내에서 완전히 분해될 때까지 시간을 측정하였다. CHT10을 40분간 광에 노출시켜 동일한 구조를 갖게 한 시료는 2개월 동안 형태를 유지하고 있었고 질량감소율은 30±5%에 이르렀다.
- 40 "C에서 녹인 cinnamoyl chloride 20 mL를 동량의 DMF로 희석시킨 다음, 소량씩 적하하여 4 P예서 빛을 차단한 채 8시간 동안 반웅을 진행시켰다. 반응 후 반옹용액을 감압하에서 농축하고 과량의 아세톤으로 cinnamoylated SA (CSA)를 침전시켜 희수하였다. 여과 후 에틸알코올로 세척하고 진공건조기에서 하롯밤 동안 건조시켜 백색의 분말을 얻었다 (Figure 1 (b)).
- 이용한 고분자 지지체의 제조. 분무 건조로 얻어진 CHT 미립자를 압축 성형하여 디스크 형태로 제조할 때, 디스크의 두께를 0.5 mm 이하로 만들면 미가교 부분 없이 젼체가 가교된 디스크를 얻을 수 있었고 (Figure 7(a)), 이를 물속에 장시간 침적 시켜 잔존 가능한 미가교분을 제거하고.건조시켜 얻은 지지체는 스폰지 구조를 나타내었고, pore size는 10〜30 ㎛임을 알 수 있었다 (Figure 7(d)).
- CHT에 CSA와 SA를 첨가하여 제조한 미립자는 균일한 크기와 형태를 갖게 되는데, 이는 긴 CHT 분자 사슬 사이로 짧은 사슬의 SA 혹은 CSA 가 끼어 들어가 더 조밀한 형태의 구조를 형성할 수 있기 때문으로 사료된다. 분사 nozzle의 온도, 농도와 압축공기 유입속도에 의해서도 미립자들이 갖는 크기 및 형태에 변화가 나타났으나, 본 연구에서는 최적 조건을 선정하여 수행하였다.
- CHT와 CSA/게 적용된 분무건조기 (Buchi Mini Spraydryer B-190, Swiss)의 운전조건을 다음교 같이 유지하여개잘된 HA 미립자들울 얻었다. 압축공기의 flow rate는 650과 800 NL/mm의 두 가지로 설정하였고, 용액의 inlet, temperature는 185 7C, outlet temperature는 110 °C, aspirator control 및 pump control은 각기 13과 4의 값으로 고정하였다. 얻어진 미립자의 형태는 주사형 전자현미경 (SEM) (Hitachi S-2200, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- 압축공기의 flow rate는 650과 800 NL/mm의 두 가지로 설정하였고, 용액의 inlet, temperature는 185 7C, outlet temperature는 110 °C, aspirator control 및 pump control은 각기 13과 4의 값으로 고정하였다. 얻어진 미립자의 형태는 주사형 전자현미경 (SEM) (Hitachi S-2200, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 압측성 형으로 CHT/CSA 미립자로부터 디스크의 제작.
- 압측성 형으로 CHT/CSA 미립자로부터 디스크의 제작. 제조한 미립자들을 단독 또는 블렌딩하여 유압 프레스 (Cravor Co., USA)로 상온에서 15 metric ton의 압력을 가하여 두께가 0.5, 0.7, 1mm인 디스크 형태로 제작하였다. 디스크 앞뒷면에 각각 10, 20, 30분간 자체 제작한 400 W UV lamp를 광원으로 하여 UV-D33S filter (Toshiba Co.
- 이는 tetrabutylammonium기로의 치환이 HAH DMF에 대한 용해도를 향상시키므로, 수분이 존재하지 않는 조건에서 반웅이 진행되어 cinnamoyl chloride기 가미 치환된 HA에 비해 tetrabutylammonium 기로 치환된 HA에 더 많이 첨가되는 조건이 제공되기 때문이다. 한편, HA만으로는 얻어진 고분자 지지체는 본연의 특성상 충분한 기계적인 물성을 나타내기 어려우며, 광반응기를 도입하여 HA를 광가교 시키더라도 체내에서 hyaluronidase에 의해 분해될 수 있기 때문에, 얻어지는 광이량화 고분자가 중분한 기계적인 물성을 갖도록 하기 위해 HA와 구조적으로 유사하며 지금까지 세포배양용 기재로 사용되어져왔던21-25 SA로 고분자를 보강하였다. SA도 동일한 조건하에서 cinnamoyl chloride로 개질하였으나, SA의 경우 HA 와는 다소 다른 반응양상을 나타내었다.
대상 데이터
- , Seoul, Korea)으로부터 제공받았다. 제공받은 HA는 분획 분자량이 12000인 투석막 율사 용하여 18 MQ 탈이온수로 3일간 투석하여, 저분자량의 펩티드를 제거한 후, -70 "C에서 동결건조 하였다. Gel permeation chromatography (GPC) (Dynamax Co.
- Cinnamoyl chio- ride는 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, USA) 와동경화성 (Tokyo, Japan)에서 구입한 것울 정제 없이 사용하였다. N, TV^dimethylformamide (DMF)는 (주)대정 (Daejung Chemicals and Metals Co.
- 약를 함입. Model drug 으로서 NS AID 의 일종으로 현재 관절염 치료에 사용되고 있는 indomethac- ine을 선택하였다. Indomethacine은 다옴의 세 가지 방법으로 loading 하고 각각의 방출 특성을 비교 검토하였다,
- (Milwaukee, USA) 와동경화성 (Tokyo, Japan)에서 구입한 것울 정제 없이 사용하였다. N, TV^dimethylformamide (DMF)는 (주)대정 (Daejung Chemicals and Metals Co., Seoul, Korea)에서 구입하였다. Pyridine는 시약 급으로 TEDIA (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
- , Seoul, Korea)에서 구입하였다. Pyridine는 시약 급으로 TEDIA (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. Tetrabutyl ammonium hydroxide (12.
- 70000이었다. Sodium alginate (SA)는 약리 화학(주) (Yacuri Chemicals Co. Ldt., Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. Cinnamoyl chio- ride는 Aldrich Chemical Co.
- Pyridine는 시약 급으로 TEDIA (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. Tetrabutyl ammonium hydroxide (12.5% solution in methanol)는 Merck (New Jersey, USA) 에서구입하였다. 실험에 사용한 non-steroidal anti-in flammatory drug (NSAID)인 indomethacine (1- p-chloro-benzoyl-5 - methoxy-2-methylindole -3- acetic acid)은 Aldrich Chemical Co.
- 시약 및 재료. 히아루론산 (HA)은 (주)태평양 (Pacific Co., Seoul, Korea)으로부터 제공받았다. 제공받은 HA는 분획 분자량이 12000인 투석막 율사 용하여 18 MQ 탈이온수로 3일간 투석하여, 저분자량의 펩티드를 제거한 후, -70 "C에서 동결건조 하였다.
성능/효과
- 이는 압축공기의 유입속도가 빠르면 분무건조기의 분사구에서 고분자용액과 압축공기간의 혼합에 의한 미세분산 (atomization)이 더 잘 일어나기 때문이다. 한편, 분무건조시 공정변수를 고정시키고 압축 공기 주입속도, 시료용액의 농도를 변화시키면 (Figure 3 (e), (f) and (i), (j)) 다양한 크기의 미립자를 얻을 수 있었고 주어진 조건에서 얻어진 모든 미립자는 10 pm를 넘지 않는 입경을 가지고 있었다 (Table 2). CHT에 CSA와 SA를 첨가하여 제조한 미립자는 균일한 크기와 형태를 갖게 되는데, 이는 긴 CHT 분자 사슬 사이로 짧은 사슬의 SA 혹은 CSA 가 끼어 들어가 더 조밀한 형태의 구조를 형성할 수 있기 때문으로 사료된다.
- CHT/CSA 블렌드가 나타내는 pH 감응성은 SA가 가지는 pH 민감성에서2627 유래한 것으로 사료된다. 가공한 미립자에 세 가지 방법, 1) CHT solution과 약물용액을 혼합하여 분무 건조하는 방법, 2) 분무 건조로 얻은 미립자와 약물을 함께 섞은 후 압축 성형하는 법, 3) 압축 성형법으로 HA의 디스크를 만든 뒤 메틸알코올에 용해시킨 indomethacine용액에 담가 약물을 흡수시키는 방법으로 약물을 도입하였는데, 약물용액과 함께 분무 건조하면 약물의 손실 없이 높은 약물농도를 갖는 미립자를 얻을 수 있었고, SA와 CSA가 소량 함유된 미립자를 만든 뒤 약물을 흡수시키는 경우는 CSA가 메틸알코올에 팽윤되는 성질을 가지고 있어 같은 무게의 시료 내에 더 많은 약물을 함유할 수 있었다. 가장 방출 특성이 좋았던 시료는 약물용액과 CHT 용액을 혼합하여 분무 건조시킨 후, 광가교시킨 시료였다.
- 0 mm 이상의 두께로 만들면 표면에서만 가교 반응이 일어나, 2일 정도 물 속에 침적시켜 미가 교분을 제거하면 가운데가 비어있고 폭이 25 pm 정도인 sack 구조의 고분자 지지체가 얻어짐을 확인할 수 있었다(Figure 7(b), 7(c)). 손상된 골조직을 대체하기 위해 조직공학의 방법으로 골아세포을 배양하려면 다공성 지지체가 필요한데, 2%3。CHA와 CHT 미립자로서 다양한 pore size를 가지는 지지체를 만들 수 있음을 확인하였다.
- HA와 SA를 광반응성기인 cinnamoyl chloride로 각각 화학개질한 CHT와 CSA재료로 성형한 고분자 지지체는 pH 7.0의 PBS내에서 2개월에 걸쳐 본연의 형태를 유지하는 거동을 보였다. 이 고분자 지지체는 손상된 골조직이 재생될 동안에 구조유지가 가능하며 함입 약물 (성장인자 등)의 서방성을 지니는 등, 지지체로 역할을 수행하다가 궁극에는 체내에서 효소에 의해 분해되어 새로이 형성된 생체조직으로 완전하게 대체할 수 있는 가능성을 보여준다.
- Cinnamoyl chloride와 HA 및 SA와의 반웅에 따른 개질도의 차이를 반응시간에 따른 수율과 개질도의 변화로 표시한 결과를 Table 1에 나타내었다. HA와 tetrabutylammonium 기로 치환된 HA는 같은 시간 동안 같은 양의 cinnamoyl chloride로 개질시키더라도 개질도의 차이가 4.2%에서 8.3%로 두배 가량 높았다. 이는 tetrabutylammonium기로의 치환이 HAH DMF에 대한 용해도를 향상시키므로, 수분이 존재하지 않는 조건에서 반웅이 진행되어 cinnamoyl chloride기 가미 치환된 HA에 비해 tetrabutylammonium 기로 치환된 HA에 더 많이 첨가되는 조건이 제공되기 때문이다.
- 처음 도입한 약물의 50%가 방출될 때까지의 시간과 pH의 상관관계에 관해 Figure 6에서 나타내었다. SA와 CSA 를 함유한 재료는 pH에 따라서 미립자 디스크의 팽윤 거동이 달라지는데 pH가 낮아질수록 팽윤이 더 적게 일어나 약물방출이 지연되었으며 pH 9.0에서 미립자의 SA와 CSA부분의 용해성이 증가하여 빠른 속도로 약물방출이 일어났다. 팽윤 거동과 약물 방출 거동은 비례하기 때문에 50% 방출까지의 시간이 가장 긴 것을 각각의 pH에서 약물방출이 가장 지연되는 것이라고 설명할 수 있다.
- 한편 CSA와 CHT를 혼합하여 분무 건조한 고분자 미립자는 CHT만으로 분무처리한 미립자 (Figure 3(a)) 에 비해 크기가 작아졌고 동시에 균일한 형태를 지님을 알 수 있었다 (Figure 3(g), (h), (i), (j)). 결과로부터 분무건조법에 의해 일정한 입경을 갖는 고분자 미립자의 형성을 확인 가능하였으며, 아울러 압축공기 유입속도가 빠를수록 더 작은 입경을 갖는 미립자가 얻어짐을 알 수 있었다 (Table 2). 이는 압축공기의 유입속도가 빠르면 분무건조기의 분사구에서 고분자용액과 압축공기간의 혼합에 의한 미세분산 (atomization)이 더 잘 일어나기 때문이다.
- 이는 미립자를 압축성형하여 제작한 디스크를 약물 함입을 위하여 메틸알코올/물 공용매에 용해시킨 indomethacine용액에 담글 때, CSA부분이 메틸알코올에서 팽윤되어 용이하게 약물을 흡수할 수 있을 뿐 아니라, CHT에 비해서 소수성 분자인 CSA가 시료에 포함되면 소수성인 indomethacine의 함입을 촉진시킬 수 있기 때문이다. 분무 건조하지 않은 CHT 는 분무 건조하여 얻은 미립자보다 공극간격 (void volume)이 커서 더 많은 약물이 함입되기는 하지만, 약물의 초기 방출량이 많아지기 때문에 조직 재생용의 지지체에 요구되는 성장인자의 서방성이라는 측면에서는 적당하지 않음을 알 수 있었다 (Figure 5). Figure 4는 mdomethacme을 도입한 CHT10 미립자로부터 시간에 따른 약물의 방출거동을 보여주고 있으며, 2시간에서 6시간 사이에 약물 방출이 급격히 이루어지고 있음을 알 수 있다.
- 약물용액과 함께 분무 건조시킨 시료는 약물의 손실 없이 용액내의 약물을 미립자에 분산시킬 수 있었다. 분무 건조하지 않은 CHT를 이용한 디스크 형태의 고분자 지지체가 가장 많은 약물 함입량을 보였고, 분무 건조로 얻어진 CHT 미립자에서는, CSA의 함량이 증가할수록 약물 함입량이 증가하였다 (Table 3). 이는 미립자를 압축성형하여 제작한 디스크를 약물 함입을 위하여 메틸알코올/물 공용매에 용해시킨 indomethacine용액에 담글 때, CSA부분이 메틸알코올에서 팽윤되어 용이하게 약물을 흡수할 수 있을 뿐 아니라, CHT에 비해서 소수성 분자인 CSA가 시료에 포함되면 소수성인 indomethacine의 함입을 촉진시킬 수 있기 때문이다.
- 0의 PBS내에서 2개월 동안 서서히 분해되는 거동을 보였으며, CSA 와 혼합하면 분해는 더욱 지연되는 결과를 나타내었다. 이로부터 CHT/CSA 재료는 손상된 골조직이 재생될 동안에 충분히 본연의 구조를 유지 가능하고 궁극에는 분해되어 완전히 주위의 골조직으로 대체 가능한* 지지체로도 사용할 수 있을 것으로 보이며 분무 건조법을 이용하여 손쉽게 세포의 성장을 도울 수 있는 약물 및 성 장인자의 도입이 가능한 좋은 재료로 평가할 수 있었다.
- CHT10을 40분간 광에 노출시켜 동일한 구조를 갖게 한 시료는 2개월 동안 형태를 유지하고 있었고 질량감소율은 30±5%에 이르렀다. 즉 CHT 재료는 pH 7.0의 PBS내에서 2개월 동안 서서히 분해되는 거동을 보였으며, CSA 와 혼합하면 분해는 더욱 지연되는 결과를 나타내었다. 이로부터 CHT/CSA 재료는 손상된 골조직이 재생될 동안에 충분히 본연의 구조를 유지 가능하고 궁극에는 분해되어 완전히 주위의 골조직으로 대체 가능한* 지지체로도 사용할 수 있을 것으로 보이며 분무 건조법을 이용하여 손쉽게 세포의 성장을 도울 수 있는 약물 및 성 장인자의 도입이 가능한 좋은 재료로 평가할 수 있었다.
- SA도 동일한 조건하에서 cinnamoyl chloride로 개질하였으나, SA의 경우 HA 와는 다소 다른 반응양상을 나타내었다. 즉, cinnamoyl chloride 와의 반응은 8시간이 지나면 개질되는 정도가 감소하는 결과를 표출하였으며, 광 가교에 적용 가능한 개질도는 HA 경우 8%이상이나, SA는 4% 이상이면 광가교가 가능하였다. 이는 두 물질의 분자량 차이에 기인한 분자쇄간 운동의 용이성 때문으로 사료된다.
- Figure 4는 mdomethacme을 도입한 CHT10 미립자로부터 시간에 따른 약물의 방출거동을 보여주고 있으며, 2시간에서 6시간 사이에 약물 방출이 급격히 이루어지고 있음을 알 수 있다. 한편 CHT/CSA 의 복합형 미립자는 용액의 pH가 팽윤 거동에 영향을 미치는데, CHT 디스크는 pH의 변화에 무관한 약물 방출거동을 보이나 CHT/CSA 블렌드 디스크의 경우 pH가 증가할수록 팽윤이 잘되어 약물 방출이 빨리 일어났다. CHT/CSA 블렌드가 나타내는 pH 감응성은 SA가 가지는 pH 민감성에서2627 유래한 것으로 사료된다.
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