[논문]북방대합, Spisula sachalinesisr 유생의 발생단계별 냉동-해동후 생존율

김영신; 최윤희; 이정용; 장영진

북방대합, Spisula sachalinesisr 유생의 발생단계별 냉동-해동후 생존율
Survival Rates of Frozen-thawed Surf Clam, Spisula sachalinensis Larvae in Five Developmental Stages 원문보기

동해안산 북방대합의 유생을 냉동보존하기 위한 적절한 유생단계를 선택하기 위해, 담륜자, 초기 D상 유생, 후기 B상 유생, 초기 각정기, 후기 각정기 유생에 대한 냉동실험을 실시하였다. 동해방지제로는 dimethyl sulfoxide와 ethylene g1yco1를 사용하였다. 동해방지제에 각 단계의 유생을 10분간 두어 평형상태에 달하게 한 다음, 냉동하여 액체질소에 보존하였다. 해동결과, 가장 높은 생존율을 나타낸 유생은 담륜자로서 동해방지제 2.0 M BMSO와 2.0 M ethylene glycol에서 생존율은 각각 97.4%와 85.0%였다. 발생이 진행된 유생일수록 생존율이 낮아지는 경향을 보였다.

This study was peformed to find out the optimum larval stage among trochophore, early Dshaped larva, late D-shaped larva, early umbo and late umbo stages for cryopreservation of surf clam, Spisula sachalinensis larvae. Dimethyl sulfoxide (DMSO)and ethylene glycol were used as cryoprotectant, The larvae were immersed to cryoprotectants for 10 minutes and thereafter, cryopreserved in liquid nitrogen. Survival rates of trochophores frozen-thawed in 2.0 M dimethyl sulfoxide and 2.0 M ethylene glycol were the highest as 97.4% and 85.0%, respectively and post-thaw survival rates were decreased with the larval growth.

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문제 정의

본 연구에서는 북방대합, Spisula sachalinensis 유생의 냉동보존에 적합한 발생단계를 파악하기 위하여 담륜자기부터 후기 각정기까지 5단계로 나누어 냉동하고, 해동 후 생존율을 조사하였다.

제안 방법

이어서, 냉동률 T℃/분으로 -12℃ 까지 냉동한 후 -12℃ 에서 10분동안 식빙 (seed-ing)한 다음, 앞과 동일한 냉동률로 -35℃까지 냉동하였다. 냉동된 유생은 -196℃ 의 액체질소통 (USA, MVE)에 옮겨 보관하였으며, 보관 1시간 후 25℃의 담수에서 급속해동하여 인공해수로 희석한 다음, 광학현미경에 의해 섬모운동과 심장박동 여부로 생존율을 조사하였다.
북방대합의 알은 난핵포 붕괴 (germinal vesicle breakdown) 이전이라도 수정이 가능한 종이므로, 성숙한 암수의 생식소 부위를 절개하여 암수 3:1의 비율로 각각 채란·채정하였다. 채취한 알과 정자를 미리 준비해 둔 여과해수 (17℃, 34%)에 넣어 수정 후 세란하였다.
이후, 실험을 위해 담휸자 (수정 후 19.5시간), 초기D상 유생 (수정 후 25.5시간), 후기 D상 유생 (수정 후 2일), 초기 각 정기 (수정 후 5일), 후기 각정기 (수정 후 15일)에 달한 유생을 각각 재료로 하여 실험하였다 (Fig. 1). 냉동보존에 사용한 희석액으로는 인공해수(NaCl 2.
2 M sucrose를, 동해 방지 제로는 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol을 사용하였다. 희석액으로 사용한 0.2 M sucrose에 2가지 동해방지제를 각각 첨가하여 최종농도가 2.0 M어되도록 한 다음 냉동보존 실험을 실시하였다 발생단계별 냉동을 위한 5종류의 유생을 실온 (23℃)에서 각 용액에 10분 동안 침지한 후 0.5 mL straw (Japan, FHK)에 봉입하여 최초온도 0℃로 설정되어 있는 프로그램냉동기 (Samwon Freezing Engineering Co., Korea)로 옮겼다. 이어서, 냉동률 T℃/분으로 -12℃ 까지 냉동한 후 -12℃ 에서 10분동안 식빙 (seed-ing)한 다음, 앞과 동일한 냉동률로 -35℃까지 냉동하였다.

대상 데이터

1). 냉동보존에 사용한 희석액으로는 인공해수(NaCl 2.7g, KC₁ 0.07g, NaHCO₃ 0.05g, CaCl₂ 0.12g, MgCh 0.46g, 증류수 lOOmL)에 녹여 만든 0.2 M sucrose를, 동해 방지 제로는 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol을 사용하였다. 희석액으로 사용한 0.
실험에 사용한 자연산 북방대합은 산란기인 6월에 채집하여 유수식 수조에서 사육하면서 안정된 것만을 사용하였다. 채란·채정용 어미의 크기는 각장 100.

데이터처리

모든 자료는 Computer Program Statistix 3.1 (Analytical Software, St. Paul, Min. USA)로 ANOVA를 실시하여 최소 유의차 검정으로 평균간의 유의차 유무를 판정하였다.

성능/효과

0.2 M sucrose가 첨가된 2.0 M DMSO를 사용하여 각각의 발생단계에 따라 냉동보존한 결과, 담륜자 97.4+0.5%, 초기 D상 유생 78.9±9.4%, 후기 D상 유생 61.3 ±12.0%, 초기 각 정기 유생 24.4+1.9%, 후기 각정기 유생 13.9±6.3%의 순으로 발생단계가 진행될수록 낮아지는 해동후 생존율을 보였다. 이중 담륜자가 다른 발생단계에 비해 생존율이 유의하게 높은 것으로 나타났다 (P < 0.
0.2 M sucrose에 첨가 된 2.0 M ethylene glycol을 사용하여 냉동 보존한 경우, 각각의 발생단계에 따라 유의한 차이가 나타났으며, D상 유생과 각정기 유생에서는 유의한 차이를 보이지 않았다. 담륜자는 85.
본 연구에서는 북방대합 후기 발생배인 담륜자와 유생을 이용하여 냉동실험을 실시한 결과, 발생단계에 따라 생존율에 유의한 차이가 나타났으며, 발생이 진행될수록 생존율이 낮아지는 경향을 보였다. 이는 변태과정에 있는 유생이 점차 세포 수가 증가하고 외골격의 형성이 진행됨으로써, 개체 내외부의 냉동속도가 다른 데에 기인한 것으로 추정되는 바, 냉동보존시 고려해야 하는 요인들 중 이 부분에 관한 보다 세밀한 연구가 필요할 것으로 보인다.
3%의 순으로 발생단계가 진행될수록 낮아지는 해동후 생존율을 보였다. 이중 담륜자가 다른 발생단계에 비해 생존율이 유의하게 높은 것으로 나타났다 (P < 0.05) (Fig. 2). 또한 동일한 발생단계에서의 초기와 후기 유생은 서로 유의한 생존율 차이를 보이지 않았다 (P > 0.

후속연구

경향을 보였다. 이는 변태과정에 있는 유생이 점차 세포 수가 증가하고 외골격의 형성이 진행됨으로써, 개체 내외부의 냉동속도가 다른 데에 기인한 것으로 추정되는 바, 냉동보존시 고려해야 하는 요인들 중 이 부분에 관한 보다 세밀한 연구가 필요할 것으로 보인다. 특히, 생존율에 큰 영향을 미친다고 보고하고 있는 발생배의 질, 발생단계와 냉동률과의 관계, 동해방지제의 투과성 여부와 관련한 평형시간 등 복합요인의 작용에 대한 보다 세밀한 검토도 이루어져야 할 것이다.
이는 변태과정에 있는 유생이 점차 세포 수가 증가하고 외골격의 형성이 진행됨으로써, 개체 내외부의 냉동속도가 다른 데에 기인한 것으로 추정되는 바, 냉동보존시 고려해야 하는 요인들 중 이 부분에 관한 보다 세밀한 연구가 필요할 것으로 보인다. 특히, 생존율에 큰 영향을 미친다고 보고하고 있는 발생배의 질, 발생단계와 냉동률과의 관계, 동해방지제의 투과성 여부와 관련한 평형시간 등 복합요인의 작용에 대한 보다 세밀한 검토도 이루어져야 할 것이다.

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