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문제 정의
- 우리나라 남해안에서 매년 유해 편모조류인 Cochlodinium poly krikoides 적조가 발생하고 있으며 많은 수산피해를 일으키고 있다. 본 연구는 본 종에 대한 적조발생기구를 구명하는데 있어 생물학적인 기초를 확립하기 위해 실시되었다. 실험실 배양실험을 통해 물리 · 화학적 환경요인에 대한 C.
- 해양에서 발생하는 C. polykrikoides 자연군집의 동역학중에서 물리 · 화학적 환경요인의 상대적인 중요성을 평가하기 위해 수온, 염분, pH, 조도 조건별로 무균배양을 통한 본 종의 성장을 조사하였다. 그 결과는 25℃ 40‰, pH 7.
제안 방법
- polykri- koides는 개량 f/2-Si 배지로 영양염 기아처리를 한 세포를 무균 배양용기 (Nunclon)에 접종하여 실험하였다. 5일마다 배양액 150 mL 를 폴리에틸렌 용기에 분취하여 membrane filter (공경, 0.45 μM)로 여과하였고 그 여과액을 즉시 영양염 분석하였다. 즉시 실험하지 않은 경우는 냉동 보관하였다.
- 6A). C. poiykrikoides의 반연속배양시 배지내 영양염 초기농도는 암모니아질소, 질산질소, 인산인이 각각 14.214, 11.696, 0.542 μM의 농도였고, 배지내 영양염 농도를 매일 10, 2, 0.2 μM씩 주입하였다. 그리고, 성장에 의해 흡수된 후 배지 내에 남아있는 영양염을 2일에 한 번씩 세포의 계수와 함께 측정하였으며 그 결과를 Fig.
- C. polykrikoides는 무기태 질소원 중에서 성장시 어떤 물질을 유효한 물질로 선택하는지를 알아보기 위하여 각 농도구간별로 NaNO3와 NH4CI을 같은 양으로 C. polykrikoides의 성장과 영양염 흡수를 살펴보았으며 그 결과는 다음과 같다.
- C. polykrikoides를 f/2-Si 배지에 1주일 정도 전배양시켜 대수증식기에 있는 세포를 시험관 (cap test tube, 25 mmX150mm, pyrex)에 접종하였다. 그리고, 접종시 환경변화로 인하여 성장 유도기가 길어지는 것을 최소화하기 위해 실험에 사용한 배양주들은 접종하기 전 그 환경에서 최소한 2세대 정도 적응시킨 후 사용하였다.
- C. polykrikoides의 영양요구량을 파악하기 위해 조류성장이 더 이상 증가하지 않고 포화되는 영양염 농도를 전후해서 보다 조밀한 구간에서 실험을 실시하였다. 질소원으로 NaNO3> NH4Cl을 사용하였고 인원으로 IGHPQ를 사용하였다.
- , Model *G)로 측정하였다. pH에 대한 성장실험은 0.05N NaOH와 0.1 N HC1 을 사용하여 pH. 5.5=9.5까지- pH 0.5 구간으로 설정하였고 (23℃, 7, 500 lux), pH는 pH meter (Fisher Scientific, 825MP)로 측정하였다. 조도에 대한 성장실험은 배양기 내의 조도차를 이용하여 50~7, 500Iux로 설정하였고(23℃), 조도는 조도측정기 (Digital Lux Meter, DXT00)로 측정하였다.
- poly- krikoides의 최적 성장조건을 바탕으로 해서 기본적으로 사용하는 f/2-Si 배지의 농도를 변형하여 실험하였다. 기본적인 f/2-Si 배지에는 질소와 인이 고농도로 존재하기 때문에 f/20-Si 배지에서 최소한 2세대 이상 계대배양시킨 후, N 그리고 (또는) P가 결핍된 배지에 1주일 정도 기아처리한 후 실험을 실시하였다.
- 5C의 결과는 어느 한쪽의 영양염 고갈로 인한 배양후 10일째 이후의 경우로 이것은 실험실조건의 결과로만 해석될 수 있다. 따라서, 매일 일정량의 영양염을 배지에 연속적으로 공급하여 실험한 반연속배양 (semi-continuous culture)을 통한 C. polykrikoides의 성장과 영양염 흡수를 다시 살펴보았다. 그 결과, 접종 후 2일째에 암모니아질소, 질산질소, 인산인은 각각 21.
- 영양염 농도와 성장속도의 정량적 관계를 밝히는 것은 적조발생기구를 연구하는데 있어 매우 중요한 일이라 할 수 있을 것이다. 따라서, 실험실 배양실험을 통하여 C. polykrikoides^ 성장에 관한 물리 · 화학적 환경요인을 파악하고, 무기태질소와 인의 이용능력 및 영양염 제한하의 증식동력학을 조사하여 적조발생기구에 관련된 영양염의 영향을 확인하였다.
- 무기태 영양염인 질소원으로 질산질소와 암모니아질소를, 인원으로 인산인을 이용하여 C. polykrikoides의 영양염에 대한 성장실험을 하였다. 그 결과, C.
- 물리 · 화학적 환경요인 (수온, 염분, pH, 조도)에 대한 C. poly- krikoides의 최적 성장조건을 바탕으로 해서 기본적으로 사용하는 f/2-Si 배지의 농도를 변형하여 실험하였다. 기본적인 f/2-Si 배지에는 질소와 인이 고농도로 존재하기 때문에 f/20-Si 배지에서 최소한 2세대 이상 계대배양시킨 후, N 그리고 (또는) P가 결핍된 배지에 1주일 정도 기아처리한 후 실험을 실시하였다.
- 배양주의 초기 배양 조건은 온도 23t, 염분 34℃, pH 7.8 그리고 조도 7,500 lux이었고, 초기 접종밀도는 200cells/mL 이었으며, 명암주기는 14hr light: 10hr dark로 일정하게 두고 각각의 환 경요인별로 실험하였다. 세포의 성장조사는 2~3일에 한 번씩 배양용기를 잘 흔들어 배양액내 세포를 균일하게 섞은 뒤 0.
- , 1990). 성장속도와 영양염 농도와의 관계를 아래의 Monad식을 이용하여 반포화상수 (Ks, μM)를 구하였으며 Ks 값은 직선식으로 변형하여 계산하였다 (Eppley et al., 1969b).
- 8 그리고 조도 7,500 lux이었고, 초기 접종밀도는 200cells/mL 이었으며, 명암주기는 14hr light: 10hr dark로 일정하게 두고 각각의 환 경요인별로 실험하였다. 세포의 성장조사는 2~3일에 한 번씩 배양용기를 잘 흔들어 배양액내 세포를 균일하게 섞은 뒤 0.1 mL씩 subsampling한 후, 루골용액으로 세포를 고정하여 광학현미경하 에서 counting chamber를 사용하여 계수하였다. C.
- 실제 해양에서는 적은 양의 영양염일지라도 연속적으로 공급되기 때문에 실험실에서의 batch culture에 대한 한계점을 보완하기 위하여 반연속배양을 통한 성장실험을 실시하였으며 그 결과는 다음과 같다. C.
- 본 연구는 본 종에 대한 적조발생기구를 구명하는데 있어 생물학적인 기초를 확립하기 위해 실시되었다. 실험실 배양실험을 통해 물리 · 화학적 환경요인에 대한 C. polykrikoides의 성장을 조사하였고, 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 온도의 변화에 따른 성장실험은 온도구배 배양기 (EYELA, MTI-201)에서 실시하였고, 16~31℃까지 구간으로 설정하였다 (조도 7,500lux).염분에 대한 성장실험은 증류수와 해수를 적당한 비율로 혼합하여 10~50℃까지 5%o 구간으로 설정하였고 (23℃, 7,500lux), 염분은 염분측정기 (T.S-Digital Lab., Model *G)로 측정하였다. pH에 대한 성장실험은 0.
- 온도의 변화에 따른 성장실험은 온도구배 배양기 (EYELA, MTI-201)에서 실시하였고, 16~31℃까지 구간으로 설정하였다 (조도 7,500lux).염분에 대한 성장실험은 증류수와 해수를 적당한 비율로 혼합하여 10~50℃까지 5%o 구간으로 설정하였고 (23℃, 7,500lux), 염분은 염분측정기 (T.
- 5 구간으로 설정하였고 (23℃, 7, 500 lux), pH는 pH meter (Fisher Scientific, 825MP)로 측정하였다. 조도에 대한 성장실험은 배양기 내의 조도차를 이용하여 50~7, 500Iux로 설정하였고(23℃), 조도는 조도측정기 (Digital Lux Meter, DXT00)로 측정하였다.
- 질산질소와 암모니아질소, 인산인을 무균 배양용기에 배양중인 C. polykrikoidesS] 배양액에 각각 2, 10, 0.2 μM씩 매일 같은 양으로 주입하여 시간의 경과에 따른 C. po/yknkoides의 성장과 영양염 흡수를 살펴보았다.
- 를 사용하였다. 질소 및 인에 대한 실험 구간은 각각 0-364.5pM, 0~36.45μM이었고, 질소원에 대한 실험에는 KzHPO, 를, 또한 인원의 실험에는 NaNQ을 각각 f/2-Si 배지의 기본조성대로 첨가하였다 (N: 883pM, P: 36.3pM).
대상 데이터
- 단일 질소원으로서는 NaNO3, NH4Cl을 사용하였고, 단일 인원으로는 무기인인 K2HPO4를 사용하였다. 질소 및 인에 대한 실험 구간은 각각 0-364.
- 배지 제조용 해수는 국립수산진흥원 연안해수를 membrane filter (공경, 0.45/m)로 여과한 후 가압 멸균하고 실온에서 방냉시킨 후 미리 제조 , 멸균해 놓은 stock solutions을 첨가하여 배양배지로 사용하였다.
- 실험에 사용한 C. polykrikoides는 국립수산진홍원 적조연구과에서 보유하고 있는 배양주 CPT으로 1996년에 우리 나라 남해안에서 채집 , 분리한 것으로서 f/2-Si 배지 (Guillard and Ryther, 1962)에서 계대 배양 (sub-culture)하였다.
- Cl을 사용하였고, 첨가량은 양자 모두 0~70μM이었으며, 본 실험에는 KzHPQ와 미량금속 및 비타민은 f/2-Si 배지의 기본조성대로 첨가하였다. 접종에 사용한 C. polykri- koides는 개량 f/2-Si 배지로 영양염 기아처리를 한 세포를 무균 배양용기 (Nunclon)에 접종하여 실험하였다. 5일마다 배양액 150 mL 를 폴리에틸렌 용기에 분취하여 membrane filter (공경, 0.
- 질소원으로 NaNO3, NH4Cl을 사용하였고, 첨가량은 양자 모두 0~70μM이었으며, 본 실험에는 KzHPQ와 미량금속 및 비타민은 f/2-Si 배지의 기본조성대로 첨가하였다. 접종에 사용한 C.
- polykrikoides의 영양요구량을 파악하기 위해 조류성장이 더 이상 증가하지 않고 포화되는 영양염 농도를 전후해서 보다 조밀한 구간에서 실험을 실시하였다. 질소원으로 NaNO3> NH4Cl을 사용하였고 인원으로 IGHPQ를 사용하였다. 질소 및 인에 대한 실험 구간은 각각 0~70 μM, 0~7 μM이 었다.
이론/모형
- 1 mL씩 subsampling한 후, 루골용액으로 세포를 고정하여 광학현미경하 에서 counting chamber를 사용하여 계수하였다. C. polykrikoides 의 일간성장률 (specific growth rate, SGR)은 Stein (1973)식으로 계산하였다.
성능/효과
- 072div./day로 거의 성장하지 않았고, 0~40.5 μM 범위에서는 질산질소 농도가 증가할수록 일간성장률도 급격히 증가하였다. 40.
- C. poiykrikoides 적조발생 기간과 밀도는 1990년대부터 발생기간이 장기화되고 그 밀도 또한 고밀도로 변화하고 있다는 것을 나타내고 있다 (Table 1).
- 실제 해양에서는 적은 양의 영양염일지라도 연속적으로 공급되기 때문에 실험실에서의 batch culture에 대한 한계점을 보완하기 위하여 반연속배양을 통한 성장실험을 실시하였으며 그 결과는 다음과 같다. C. poiykrikoides는 성장시 유도기 (lag phase)가 거의 없고 바로 대수성장기에 접어들어 접종 후 14일째에 최대세포밀도인 2,700cells/mL에 도달하였고, 그 이후는 점차 성장률이 떨어지는 결과를 나타내었다 (Fig. 6A). C.
- C. polykrikoides는 무기태 영양염 중에서 질산질소보다 암모니아질소를 성장시 보다 유효한 영양염으로 선택하여 성장에 소비하였으며, 암모니아질소를 거의 대부분 흡수한 이후에는 남아있는 질산질소의 흡수로 성장이 이루어졌다. 이것은 Paasche (1971)와 Harvey (1953)의 보고와 일치한 결과이다.
- 20 μM로 나타났으며, 10~30 μM의 구간에서 보다 높은 질산질소의 흡수가 이루어졌다. Fig. 5D는 C. polykrikoides의 성장이 지수성장기에 해당하는 접종 후 15일이 경과했을때의 영양염 농도를 나타낸 것으로, 남아있는 질산질소의 소비로 다소 성장이 이루어졌고, C. polyknkoides의 사체에 의한 암모니아질소의 증가가 모든 구간에서 관찰되었다.
- polykrikoides의 영양염에 대한 성장실험을 하였다. 그 결과, C. polykrikoides의 영양요구량은 질산질소, 암모니아질소, 인산인에 대해 각각 40, 50, 5 μM이었고, 성장에 의한 반포화상수 (Ks)값은 각각 2.10, 1.03, 0.57 μM로 확인되었다. 이러한 결과로부터 C.
- polykrikoides의 성장과 영양염 흡수를 다시 살펴보았다. 그 결과, 접종 후 2일째에 암모니아질소, 질산질소, 인산인은 각각 21.428, 7.365, 0.579씩 흡수되어 초기성장에는 모든 영양염이 성장에 소비되었다. 그 이후에는 암모니아질소와 인산인은 공급한 양에 상당하는 홉수가 배양 18일까지 꾸준히 일어났지만, 질산질소는 거의 흡수되지 않았다.
- polykrikoides 자연군집의 동역학중에서 물리 · 화학적 환경요인의 상대적인 중요성을 평가하기 위해 수온, 염분, pH, 조도 조건별로 무균배양을 통한 본 종의 성장을 조사하였다. 그 결과는 25℃ 40‰, pH 7.5, 7, 500lux에서 가장 성장률이 높았다. 그리고, 19~28℃에서도 성장이 잘 이루어져 광온성(euiythermal) 종으로 확인되었으며, 발생해역의 염분 범위인 30~35‰의 환경조건을 만족하는, 즉 내만의 저염분보다는 외양의 고염분 환경에서 발생하여 성장하는 종으로 확인되었고, 광염성(euryhaline) 종이다.
- poiykrikoides는 배양기내에서 빛이 조사되는 쪽으로 군집을 이루는 주광성 종으로 확인되었고, 1,000lux 이상에서 조도가 높으면 높을수록 더 높은 성장이 이루어졌다. 그러나, 배양기내 백색형광등의 최대 허용가능 조도가 8,000~10,000hix이었기 때문에 그 이상의 조도에 대한 성장을 살펴보지 못했지만, 실제 C. polykrikoides 적조가 발생하였을 때 주간의 일사량 증가에 따라 개체군 밀도가 증가하는 것으로 보아 실험실에서 실험한 조도보다 훨씬 높은 40, 000lux 이상의 현장조도에서는 성장시 더 높은 밀도를 나타낼 것으로 기대된다. 또한 조도가 높으면 높을수록 최대성장에 이르는 시간은 짧아질 것으로 판단된다.
- 5, 7, 500lux에서 가장 성장률이 높았다. 그리고, 19~28℃에서도 성장이 잘 이루어져 광온성(euiythermal) 종으로 확인되었으며, 발생해역의 염분 범위인 30~35‰의 환경조건을 만족하는, 즉 내만의 저염분보다는 외양의 고염분 환경에서 발생하여 성장하는 종으로 확인되었고, 광염성(euryhaline) 종이다. 그리고, 높은 일사량을 요구하며 현장해역의 pH 범위에서 성장이 원활히 이루어졌다.
- 05pM을 기준으로 해서 그 이상의 농도에서는 농도가 높아져도 성장률은 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 그리고, 인산인 농도가 높아질수록 최대세포밀도에 이르는데 걸리는 시간은 농도에 비례하여 길어지는 것으로 나타났다.
- /day로 그 성장률이 뚜렷히 감소하였다. 따라서, 121.5 μM 농도 이상의 암모니아질소는 C. polykrikoides의 성장을 저해시키는 결과를 나타내었다.
- 최대세포밀도도 3, 520~ 3, 575cells/mL로 거의 비슷하였다. 따라서, C. polykrikoides는 인산인 농도가 4.05pM을 기준으로 해서 그 이상의 농도에서는 농도가 높아져도 성장률은 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 그리고, 인산인 농도가 높아질수록 최대세포밀도에 이르는데 걸리는 시간은 농도에 비례하여 길어지는 것으로 나타났다.
- 본 실험에 의해 C. polykrikoides의 반포화상수값은 Eppley et al. (1969b)의 보고에 의한 외양성 종 (oceanic species) 의 Ks 값보다는 높고, 연안성 편모조류 (neric flagellates)의 Ks 값보다는 대체적으로 낮은 값을 나타냈다. 그리고, Maclsaac and Dugdale (1969)에 의한 빈영양성 (oligotrophic) 종은 아니며, 부영양성 (eutrophic) 종에 해당하지만 암모니아질소 Ks 값은 부영양성 종보다 낮은 값을 가지는 것으로 나타났다.
- 그리고, 접종시 환경변화로 인하여 성장 유도기가 길어지는 것을 최소화하기 위해 실험에 사용한 배양주들은 접종하기 전 그 환경에서 최소한 2세대 정도 적응시킨 후 사용하였다. 실험오차를 줄이기 위해 각 계열별로 2회 이상 반복 실험하였으며, 배양중인 배양용기를 매일 손으로 잘 흔들어 주었다.
- 염분구간별 성장 실험 결과로부터 C. poiykrikoides는 저염분보다는 고염분인 환경에서 성장이 활발하다는 것이 확인되었다. 실제 C.
- 온도 구간별 C. poiykrikoides의 성장 실험에서 25℃보다 낮은 수온에서는 최대세포밀도에 이르는 시간이 늦어졌으며, 이보다 높은 수온에서는 최대밀도에 이르는 시간이 짧아진 것을 알 수 있었다. 이것은 생물자체의 특이한 생리특성으로 보여진다.
- 57 μM로 확인되었다. 이러한 결과로부터 C. polykrikoides는 타와편모조류에서 보고된 Ks 값보다 대체적으로 낮았고, 빈영양성 (oligotrophic) 종은 아니며, 부영양성 (eutrophic) 종에 해당하지만 암모니아질소 Ks 값은 부영양성 종보다 낮은 값을 가지는 것으로 나타났다. 이것은 C.
- 그 이후에는 암모니아질소와 인산인은 공급한 양에 상당하는 홉수가 배양 18일까지 꾸준히 일어났지만, 질산질소는 거의 흡수되지 않았다. 이러한 사실로부터 무기태 영양염 중에서 암모니아질소와 인산인이 질산질소보다 C. polykrikoides의 성장시 보다 유효한 영양염으로 선택되어지는 것으로 확인되었다. Silva (1985)는 Pro- rocentrum minimum의 초기성장에 암모니아질소와 질산질소가 많이 필요하다고 보고하였다.
- 이상의 결과로 C. poiykrikoides는 질산질소보다 암모니아질소가 성장시 보다 유효한 영양염으로 선택되어 소비되었으며, 암모니아질소가 거의 대부분 흡수된 이후에는 남아있는 질산질소의 흡수로 성장이 이루어지는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과로 C. poiykrikoides의 반연속배양시 질소원으로는 질산질소보다 암모니아질소가 배양기간동안 두드러지게 흡수되었고, 질산질소도 접종직후 초기성장에 유효한 영양염으로 흡수가 이루어졌다. 인산인도 매일 주입한 양만큼 꾸준히 세포의 성장에 이용되었다.
- 3C). 이상의 결과로부터 C. polykrikoidesS] 영양요구량은 질산질소, 암모니아질소, 인산인에 대해 각각 40, 50, 5 μM이었다. 반포화상수는 질산질소, 암모니아질소, 인산인에 대해 각각 2.
- 5 μM의 농도 이상에서 질산질소 농도가 높아지더라도 성장률은 더 이상 증가하지 않았다. 일정한 밀도에 도달하는데 걸리는 시간은 질산질소 농도의 증가에 비례하여 짧아졌고, 질산질소 농도가 높을수록 최대밀도에 도달하는데 걸리는 시간은 길어지는 현상을 보였다.
- 6B에 나타내었다. 접종 후 2일째에 암모니아질소는 21.428 μM, 질산질소는 7.365 μM, 인산인은 0.579 μM이 흡수되었고, 18일간의 배양기간동안 질산질소보다 암모니아질소의 흡수가 두드러지게 나타났으며, 인산인도 첨가한 양만큼 세포의 성장에 이용되었음을 나타내었다.
- ID에 나타내었다. 조도 50~500 lux에서는 성장하지 않았고, 1,000 lux부터 7,500 lux 까지는 조도가 높아질수록 점차 높은 일간성장률과 최대밀도를 나타내었다.
- 조도에 대한 성장실험으로부터 C. poiykrikoides는 배양기내에서 빛이 조사되는 쪽으로 군집을 이루는 주광성 종으로 확인되었고, 1,000lux 이상에서 조도가 높으면 높을수록 더 높은 성장이 이루어졌다. 그러나, 배양기내 백색형광등의 최대 허용가능 조도가 8,000~10,000hix이었기 때문에 그 이상의 조도에 대한 성장을 살펴보지 못했지만, 실제 C.
후속연구
- 이와 같이 빈영양수 또는 영양염 농도가 비교적 낮은 곳에서 적조를 일으키는 종은 성장과 유지에 있어서 영양염의 홉수, 영양 요구량 및 반포화상수와 같은 영양염 요구성과 이용이 부영양 해역에서 발생하는 종과 차이가 있을 것이며, 우리 나라 남해안 외측수역에서 발행하는 C. polykrikoides는 어떤 생리적 특성을 가지는지 살펴볼 필요가 있다.
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