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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대량생산이 가능한 해양성 미세조류의 이용 효율을 높이기 위하여 규조강인 Phaeodactylum tricornutum (P. tn'cornutum)의 추출물에 함유되어 있는 항산화성 물질을 분리 . 정제하여 그 화학적 구조를 결정하였다.
제안 방법
- Dichloromethane:methanol(5:1) 획분은 PTLC에서 4개의 획분으로 나누어 chloroform:methanol (1:1)용매로 용출한 후 감압 건조하여 시료의 농도를 Weg/mL되게 조제하여 RSA 값을 측정하였다 (Fig. 3). Silica gel column chromatography로 정제한 것과 비교하면 같은 농도에서 약 20% 정도 활성이 증가되었다.
- PTLC 획분 중 가장 좋은 활성을 가진 획분을 감압 건조하여 chloroform: methanol (1:1)용매에 녹여 HPLC에서의 시료용액으로 사용하였다. HPLC에서 C18 column을 사용하였으며, 이동상은 任0와 acetonitrile로 하여 단계별 농도구 배 법(80~100% acetonitrile, 60min)으로 용출된 획분 중에서 DPPH radical 소거능이 가장 높은 획분을 HPLC로 다시 정제하였다.
- 4에 나타내었다. HPLC에서 T3 획분은 4개의 획분 (HI~H4)으로 분리되었으며, 각 획분을 감압건조하여 20口g/mL농도에서의 RSA 값을 측정하였다. 각 획 분중에서 RSA 값은 retention time이 18.
- P. fricomu筋n의 각 유기용매 추출물의 항산화성은 chloroform 획분이 가장 좋았으며, 이 획분을 시료로 하여 silica gel column chromatography, PTLC 및 HPLC를 사용하여 항산화성 물질을 분리, 정제하였다. Silica gel column을 사용하여 분리된 획분의 항산화성은 dichloromethane；methanol（5：1）로 용출시킨 획분에서 가장 높았으며, 이 획분의 PTLC 획분은 항산화성이 20% 증가하였다.
- PTLC에서 분리한 획분 중 가장 활성이 좋은 T3 획분을 Cl8 co- lumn이 장치된 HPLC를 이용하여 HQ와 acetonitrile을 이용하여 단계별 농도구배법(80~100% acetonitrile)에 의해 유속 1.0mL/ min로 용 리시켜 정제한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. HPLC에서 T3 획분은 4개의 획분 (HI~H4)으로 분리되었으며, 각 획분을 감압건조하여 20口g/mL농도에서의 RSA 값을 측정하였다.
- (1988)의 방법을 약간 변경하여 측정하였다. 각 획분별로 일정한 농도가 되도록 methanol 2mL에 녹이고 이를1.5X10*M 1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)/methanol용 액 0.5 mL와 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후, 517nm에서 홉 광도를 측정하여 다음 식으로 RSA 값을 계산하였다. 대조구는 시료용액 대신에 2mL의 methanol를 넣어 시료용액과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다.
- 5 mL와 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후, 517nm에서 홉 광도를 측정하여 다음 식으로 RSA 값을 계산하였다. 대조구는 시료용액 대신에 2mL의 methanol를 넣어 시료용액과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. RSA 값은 실험한 값의 평균값으로 나타내었다.
- 동결건조한 P. tricomutum 50g에 3배가량의 methanol을 가하여 801에서 2시간 동안 환류 냉각하면서 2회 추출 여과한 후, 감압 건조하여 methanol 추출물로 하였다. Methanol 추출물은 10% methanol 용액에 부유시킨 후, Fig.
- 미세조류 P. tricomutume chloroform 획분은 slica gel column chromatography에서 8개의 획분으로 분리하여 감압 건조하였으며, 각 획분의 농도 40μg/mL로 측정된 RSA 값은 Fig. 2에 나타내었다. 소수성이 강한 hexane과 그 혼합용매로 용출된 C1~C3의 RSA 값은 모두 10% 이하로 낮게 나타났으며, 혼합용매의 친수성도를 높여 용출시켜 얻은 획분 C7 및 C8은 각각 58% 및 35%로 소수성 혼합용매로 용출된 획분에 비해 높게 나타났다.
- 본 연구에서는 비교적 성장이 빠르고 배양 이 용이한 황갈편조 식물문 중규조강에 속하는 P. f/icomutini］으로부터 선정하여 항산화성 물질을 분리• 정제하여 물질의 구조를 밝혔다.
- 지용성 획분과 수용성 획분 중 DPPH radical 소거능이 가장 좋은 획분을 시료로 사용하였다. 시료량의 약 50배 정도의 silica gel을 중 전시킨 open column (©35X300mnD에 시료를 주입한 후, hexane, hexane: ethylacetate(5 :1), hexane: ethylacetate (1: 1), hexane: ethylacetate (1: 5), ethylacetate, dichloromethane: methanol (10: 1), dichloromethane:methanol (5: 1), methanol 순으로 용리시켜 8가지의 조 추출물을 얻었다.
- 25로 나타났다. 이 물질의 구조를 분석하기 위하여 FT-IR, UV, EIMS 및 NMR를 측정하였으며, 이들 결과를 종합적으로 검토하여 구조를 결정하였다. 이 화합물의 FT-IR spectrume Fig.
- 소수성이 강한 hexane과 그 혼합용매로 용출된 C1~C3의 RSA 값은 모두 10% 이하로 낮게 나타났으며, 혼합용매의 친수성도를 높여 용출시켜 얻은 획분 C7 및 C8은 각각 58% 및 35%로 소수성 혼합용매로 용출된 획분에 비해 높게 나타났다. 이들 8개의 획분 중에서 dichloromethane:methanol(5:1)로 용출시킨 획분 C7이 DPPH radical 소거능이 가장 높아 다음 정제 과정으로 PTLC를 행하였다.
- tricomutum에서 분리. 정제된 항산화 활성 물질의 구조는 NMR (Varian Unity Inova 750, USA), EIMS (JEOL JMS-SX 102, USA), FT-IR (Perkin Elmer Spectrum 2000, USA) 및 UV (Varian Caiy 1C, USA) 기기를 사용하여 확인하였다.
- tn'cornutum)의 추출물에 함유되어 있는 항산화성 물질을 분리 . 정제하여 그 화학적 구조를 결정하였다.
- 최종 활성물질을 l~20Jug/mL 농도가 되게 methanol 2mL에 녹여 1.5X10-, M DPPH/methanol 용액 0.5 mL와 혼합하여 실온에서 30분간 방치한 후, 517nm에서 홉광도로 RSA 값을 구하여 대조구의 흡광도에 대해 50% 흡광도 감소를 나타내는 시료의 농도를 IGo으로 표시하였다. IGo값은 실험한 값의 평균값으로 나타내었다.
- 상기에서 추출된 8가지의 조추출물 중에서 DPPH radical 소거능이 가장 좋은 획분을 분리 정제용 시료로 사용하였다. 활성이 가장 좋은 시료를 약 5-10% 용액으로 조제하여 PTLC plate (10X 20cm)에 capillary syringe를 사용하여 시료를 band 형태로 주입시킨 후 전개용매로 hexane:acetone (7:3)을 사용하여 전개한 다음, 용매를 완전히 건조시키고 UV lamp(254nm)로 흡수대를 확인하였다. 분리된 각 band들을 긁어 모아 chloroform: methanol (1:1)용매를 사용하여 흡착되어 있는 시료를 완전히 용출시킨 다음 여과한 후 감압 건조하여 4개의 획분을 얻었다.
대상 데이터
- 항산화성 물질을 분리 및 정제하기 위한 분석용 thin layer chromatography (TLC)plate와 분취용 Preparative TLC (PTLC) plate는 Merck사의 precoated Kiescgel 60 F254를 사용하였으며, silica gele Merck사의 Kieselgel 60을 사용하였다. High performance liquid chromatography(HPLC)용 columne Shiseido사의 Capcell Pak C18 (046X250mm)을 사용하였으며, 용매는 특급용 시약을 사용하였다.
- PTLC 획분 중 가장 좋은 활성을 가진 획분을 감압 건조하여 chloroform: methanol (1:1)용매에 녹여 HPLC에서의 시료용액으로 사용하였다. HPLC에서 C18 column을 사용하였으며, 이동상은 任0와 acetonitrile로 하여 단계별 농도구 배 법(80~100% acetonitrile, 60min)으로 용출된 획분 중에서 DPPH radical 소거능이 가장 높은 획분을 HPLC로 다시 정제하였다.
- 본 연구에서 사용한 미세조류는 해양에서 서식하는 황갈편 조식물문 (Chrysophyta) 중규조강 (Bacillariophyceae)인 P. t/icomutum을 부경대학교 수산과학연구소의 한국해양 미세조류은행 (한국과학재단 특성화연구사업)으로부터 분양받아 동결건조하여 사용하였다.
- 상기에서 추출된 8가지의 조추출물 중에서 DPPH radical 소거능이 가장 좋은 획분을 분리 정제용 시료로 사용하였다. 활성이 가장 좋은 시료를 약 5-10% 용액으로 조제하여 PTLC plate (10X 20cm)에 capillary syringe를 사용하여 시료를 band 형태로 주입시킨 후 전개용매로 hexane:acetone (7:3)을 사용하여 전개한 다음, 용매를 완전히 건조시키고 UV lamp(254nm)로 흡수대를 확인하였다.
- tricomutum의 chloroform 획분을 분리 . 정제용 시료로 선정하였다.
데이터처리
- 8), m/z 569에서의 molecular peak를 확인할 수 있었다. 이상의 spectra data와 1H-NMR (750 Hz, CD2CI2) spectrum-e Britton et al. (1995)이 보고한 ca- roteiioid의 spectroscopy와 비교. 종합한 결과, zeaxanthin으로 동정되었다 (Fig.
성능/효과
- fricomu筋n의 각 유기용매 추출물의 항산화성은 chloroform 획분이 가장 좋았으며, 이 획분을 시료로 하여 silica gel column chromatography, PTLC 및 HPLC를 사용하여 항산화성 물질을 분리, 정제하였다. Silica gel column을 사용하여 분리된 획분의 항산화성은 dichloromethane；methanol（5：1）로 용출시킨 획분에서 가장 높았으며, 이 획분의 PTLC 획분은 항산화성이 20% 증가하였다. 최종 정제된 물질의 KZ값은 83俸/mL으로 화학적으로 합성된 항산화제인 BHT 및 BHA보다는 낮았지만 천연 항산화제인 Q-tocopherol보다는 다소 높게 나타났으며, 이물질의 화학적 구조는 carotenoid류인 zeaxanthiri으로 동정되었다.
- 6에서와 같이 3, 363cm-1에서 hydroxyl기, 2, 956cn 917cm-® CH의 특징적인 흡수대가 보였으며, l, 442cmT와 964cmf에서의 흡수대로 보아 trans-alkene 구조가 있음을 추정할 수 있었다. UV spectrum (Fig. 7)을 보면 chloroform 용매에서 為紅값이 430, 454 및 483 nm인 것으로 보아conjugation이 많이 되어 있는 물질임을 추정할 수 있었으며, EIMS를 측정한 결과(Fig. 8), m/z 569에서의 molecular peak를 확인할 수 있었다. 이상의 spectra data와 1H-NMR (750 Hz, CD2CI2) spectrum-e Britton et al.
- 미세조류 P. tr/comiHum의 chloroform 추출물로부터 분리 정제된 항산화성 물질의 성상은 적색의 무 결정 분말로써 전개용매 hexane: acetone(7: 3)으로 TLC에서 전개한 결과, %값이 0.25로 나타났다. 이 물질의 구조를 분석하기 위하여 FT-IR, UV, EIMS 및 NMR를 측정하였으며, 이들 결과를 종합적으로 검토하여 구조를 결정하였다.
- 본 연구에서의 DPPH radical 소거능이 가장 높은 물질은 P. tn'comutum의 chloroform 획분으로 Choi et al. (1993)이 보고한 값과 거의 유사하였으며, P. tricomutum의 chloroform 획분을 분리 . 정제용 시료로 선정하였다.
- 2에 나타내었다. 소수성이 강한 hexane과 그 혼합용매로 용출된 C1~C3의 RSA 값은 모두 10% 이하로 낮게 나타났으며, 혼합용매의 친수성도를 높여 용출시켜 얻은 획분 C7 및 C8은 각각 58% 및 35%로 소수성 혼합용매로 용출된 획분에 비해 높게 나타났다. 이들 8개의 획분 중에서 dichloromethane:methanol(5:1)로 용출시킨 획분 C7이 DPPH radical 소거능이 가장 높아 다음 정제 과정으로 PTLC를 행하였다.
- 이 물질의 구조를 분석하기 위하여 FT-IR, UV, EIMS 및 NMR를 측정하였으며, 이들 결과를 종합적으로 검토하여 구조를 결정하였다. 이 화합물의 FT-IR spectrume Fig. 6에서와 같이 3, 363cm-1에서 hydroxyl기, 2, 956cn 917cm-® CH의 특징적인 흡수대가 보였으며, l, 442cmT와 964cmf에서의 흡수대로 보아 trans-alkene 구조가 있음을 추정할 수 있었다. UV spectrum (Fig.
- 이미 carotenoid는 항산화제로써 많이 알려져 있으며, zeaxan- thin, ^-carotene, lutein, fucoxanthin 등 미세조류에 널리 분포하고 있는 carotenoid가 일중항산소 소거활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 carotenoid가 일중항산소, free radical 및 hydroxy radical의 강력한 소거물질이라는 것도 보고되어 있다.
- 5), 정제된 물질과 항산화제인 a-tocopherol, BHT 및 BHA의 IC”값은 Table 1에 비교하여 나타내었다. 정제된 물질의 IGo값은 8.3 題/mL로 합성항산화제인 BHT 및 BHA보다는 활성이 낮았지만 천연 항산화제인 a-tocopherol보다는 다소 높게 나타났다.
- (1995)이 보고한 ca- roteiioid의 spectroscopy와 비교. 종합한 결과, zeaxanthin으로 동정되었다 (Fig. 9).
- Silica gel column을 사용하여 분리된 획분의 항산화성은 dichloromethane；methanol（5：1）로 용출시킨 획분에서 가장 높았으며, 이 획분의 PTLC 획분은 항산화성이 20% 증가하였다. 최종 정제된 물질의 KZ값은 83俸/mL으로 화학적으로 합성된 항산화제인 BHT 및 BHA보다는 낮았지만 천연 항산화제인 Q-tocopherol보다는 다소 높게 나타났으며, 이물질의 화학적 구조는 carotenoid류인 zeaxanthiri으로 동정되었다.
후속연구
- 해양생태계에서 1차 생산자로 대량생산이 가능한 미세조류로부터 분리, 동정된 zeaxanthine 상기 보고에서와 같이 carotenoid 류 중에서 astaxanthin 보다는 항산화성이 낮았지만 g-caro- tene보다는 활성이 높을 뿐만 아니라 자연광에 대한 안정성도 높아 camtenoid와 관련된 산업분야에서 이들의 항산화성을 활용한다면 zcaxanthin의 이용 효율성이 높을 것으로 기대된다.
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