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문제 정의
- 본 연구에서 류마티스 관절염 환자 T세포 항원수용기와 2형 콜라겐의 결합부위를 구조적으로 규명하고자, in vitro상에서 우형 콜라겐 특이 T 세포주를 형성하여 최근 개발된 RT-PCR/SSCP방법을 이용하여 분석하여보니, 환자 8명에서 절반가량이 공통된Vβ 14 CDR3 밴드를 가지고 있음을 관찰하였다. 이 결과는 류마티스 관절염에서 2형 콜라겐을 인식하는 공통된T세포 수용체의 특정아형이 선택적으로 증폭되고 있음을 의미한다.
- 본 연구에서는 in vitro에서 콜라겐으로 자극을 주어 장기간 배양한 한국인 류마티스 관절염 환자들의 제 2형 콜라겐 특이 T세포주를 만들고 이를 RT-PCR/SSCP 방법으로 분석하여, 선택적으로 활성화 되어있는 T 세포들의 cytokine 분비 양상 및 그 수용체의 분자적 구조를 살펴보고자 하였다. 이런 연구결과는 항원 특이 T 세포의 기능을 이해하고 이를 선택적으로 차단시키는 방법을 통하여 류마티스 관절염 치료를 위한 면역제어요법 개발에 매우 유용한 정보를 주리라 생각된다.
- 세포 배양을 통한 콜라겐 자극이 지속됨에 따라 환자의 혈액과 활액의 단핵 세포구들은 SI값이 지속적으로 증가된 반면 정상인의 혈액에서 얻은 세포는 더 이상 증식하지 않았다 (not shown). 본 연구에서는 그 말초혈액이나 활액의 단핵구가 콜라겐 자극에 대하여 양성 증식반응을 보인 환자의 T 세포들을 선별하여 장기간 배양하고 그 분열 반응을 살펴보았다. (Fig.
- 인체에서 항원 특이 T세포에 관한 연구는 실험동물예서와는 달리 커다란 진전이 없는 실정이다. 본 연구진은 제 2형 콜라겐 반응 T 세포가 인체 류마티스 관절염에서 활성화되는 현상을 연구해 보고한 바 있다. 이 연구의 연장으로 제 2형 콜라겐 특이 T세포를 만들어 이들의 사이토카인 분비 양상과 특성을 T 세포 수용체분석을 통하여 관찰하고자 하였다.
- 본 연구진은 제 2형 콜라겐 반응 T 세포가 인체 류마티스 관절염에서 활성화되는 현상을 연구해 보고한 바 있다. 이 연구의 연장으로 제 2형 콜라겐 특이 T세포를 만들어 이들의 사이토카인 분비 양상과 특성을 T 세포 수용체분석을 통하여 관찰하고자 하였다. T세포가 항원 및 이와 결합된 MHC 분자를 인식하는 부위를 T세포 항원 수용기의 CDR3라고 하며, 이 부위의 다양성에 의해서 자연계 내의 수많은 항원들을 모두 인지하여 그에 특이적인 면역반응을 유도할 수 있다.
제안 방법
- 개의 방사선 조사된 항원제시 세포와 40μg/ml 우형 콜라겐을 넣어주었다. 10일 간격으로 이들 세포들을 resuspend시켜 죽은 세포들을 씻어 내고 새로운 방사선조사 항원제세 세포를 T 세포와 혼합배양 하였다. 이와 같은 10일 단위의 배양 사이클을 180일 까지 반복하였다.
- 2형 콜라겐 자극에 대하여 높은 증식반응을 보인 T 세포의 수용기를 분석 조사하기 위하여 배양된 세포들로부터 추출한 mRNA를 역전사 하여 cDNA를 만들어 내고, 이로부터 22개의 Vβ primer를 이용하여 CDR3부위를 포함한 항원 결합장소를 PCR로 증폭시키고, SSCP 젤상에 전기영동 하여 각각의 Vβ CDR3 부위가 단일 가닥의 DNA 형태로 특정 위치에 배열하도록 하였다. 분석 결과 정상인의 말초혈액에서 얻어진 T 세포들은 모든 22개의 Vβ CDR3 부위가 젤 상에 smear한 패턴으로 관찰 된 반면 (Fig.
- 2형 콜라겐으로 자극한 세포 배양을 통하여 환자 및 정상인의 T 세포로부터 분비되는 Th 1 및 Th2 type사이토카인의 분비 양상을 배양 상층액의 ELISA assay로 알아보았다 (Table 2). 류마티스 관절염 환자의 활액에서 분리된 T 세포는 150일 동안 지속된 배양 기간동안 INF-γ의 분비가 계속적으로 증가한 반면 분비된 IL-4의 양은 별다른 변화를 보이지 않았다.
- MiniMACs Column 사용 후 non-T-Cell(CD3-) 단편은 EBV transformation 한 후의 B세포주나 제공된 혈액으로부터 준비된 형태의 자가 항원 제시 세포 (APCs)로 사용하였다. APC즉 EBV 형질전환된 항원제시세포주를 얻기 위하여 CD3- 단편으로부터 나온 세포들을 2 mM L-glutarnine, 100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml steptomy - cine, 20 mM HEPES, 2 mg/ml sodium bicarbonate, 1mM pyruvate, 50 uM β-mercapthoethanol, 1X nonessential amino acids, 10% heat-inactivated fetal calf serum을 포함한 1 ml의 RPMI-1640 배양액에서 배양하였다. 이렇게 준비된 non-T세포에 B95-8세포배양액으로부터 얻은 EBV 포함 상층액 1ml을 넣어주고, 37℃, 5% CO2 항온 항습 배양기에서 한 시간동안 배양한 후 이들 세포들을 다시 새로운 배양액에서 2× 106 cell/ml의 농도로 맞춘 다음 96-well round bottom plate에 세포를 분주하여 EBV transformed APCs을 준비해 두었다.
- B. Vβ14 CDR3를 표현하는SSCP 밴드 (화살표)는 우형 콜라겐으로 자극한 30일까지의 in vitro 배양과 immunodominant human peptide (256-270)으로 자극한 150일까지의 배양에서 모두 관찰되어 이를 표현하는T 세포의 지속적인 증식을 시사해 준다. 1: <환자1>의 배양 전 말초혈액 T 세포, 2 : 배양 9일 말초혈액 T 세포, 3 : 배양 150일 말초혈액 T 세포.
- CD3+ 의 T 세포는 이미 서술한 RPMI- 1640 배양액에서 배양시키고, 대략적으로 96-well plate 한 well당 세포 농도가 2× 105 cells가 되게 분주하고 동량의 방사선조사된 APCs (EBV transformed non T 세포)를 혼합배양 하였다. 제 2형 콜라겐을 인식하는 T세포들만을 특이적으로 선별하기 위하여 배양시에 40μg/ml의 농도의 우형콜라겐으로 자극하거나 대조군으로 chiken ovalbumin을 사용하였다.
- 혈액 단핵 세포와 활액 단핵 세포는 각각 류마티스 관절염 환자와 일반 환자로부터 얻은 혈액 또는 활액으로부터 Ficoll-hypaque 농도를 이용하여 분리하였다. Ficoli-Hypaque-RBC 중간층을 얻어 Mini-MACS 를 통과시켜 각각 CD3+ 세포와 CD3- 세포로 분리하였다. 혈액과 활액 샘플에서 분리된 CD3+ 세포들은 RPMI-1640 culture 배지에 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토 마이신, 20 mM HEPES, 2 mg/ml sodium bicarbonate, 1mM pyruvate, 50μM (-mercapthoethanol, 1X nonessential amino acids , 그리고 10% heat inactive fetal calf serum을 첨가하여 각 혈당 2× 105 세포씩 배양하고, 또 이와 동등한 양의 방사선 조사된 항원 제시 세포를 함께 배양을 하였다.
- 각각의 T세포 mRNA들은 1 unit역전사 효소(Gibco BRL)와 100pmol random hexamer (GibcoBRL)를 사용하여 42℃에서 두시간 동안 반응을 시켜 cDNA로 전환시켰다. 그 다음 각 200 ng의 cDNA을 주형으로 한 25㎕의 반응액 내에 100 nM의 dNTP, 0.3 IU Taq polymerase (Takara, Korea) 그리고 20 pmol의 공통 C( primer와 현재까지 알려진 Vβ 의 22가지 Vβ primer(7)를 사용하여 각T 세포 수용체의 CDR3 부위를 PCR로 증폭시켰다. PCR 의 조건은 94℃에서 45초, 58℃에서 2분, 72℃에서 1분씩 하여 35 cycle을 반복하였다.
- H-TdR의 양을 multiple cell harvester (Cambridge Technology , Cambridge, MA)로 수확한 세포에서 liquid scintillation counter (Model Tri-Carb 300C, Packard International)로 측정하였다. 우형 콜라겐으로 처리한 세포에서 얻어진 결과를 대조군과 비교하여 (SI [stimulation index] = 실험군의 cpm값/대조군의 cpm값), 1,000 CPM 이하는 기계상의 오류 값으로 무시하였으며 SI값이 2 이상인 것을 증식반응 양성으로 평가하였다.
- 증폭된 DNA들을 단일 가닥으로 분리하기 위하여 이들 PCR 산물을 희석하고 94℃의 열을 주어 denaturation 시킨 후 4%의 polyacrylamide에 10% glycerol 이 들어 있는 non-denaturing 젤에서 전기 영동을 하였다. 이렇게 전기영동이 끝난 젤상의 밴드들을 nylon membrane에 첨착시킨 후 해당 DNA의 절편을 바이오틴이 붙은 internal TCR C( probe (5'-AAC AAG CGT GTT CCC ACC CGA GGT CGC TGT GTT-3')로 라벨하고 Phototope star-detection kit (New England Biology, England)로 발색 시켜 X선 필름에 감광 시켜 이동 패턴을 분석하였다.
- 혈액과 활액 샘플에서 분리된 CD3+ 세포들은 RPMI-1640 culture 배지에 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토 마이신, 20 mM HEPES, 2 mg/ml sodium bicarbonate, 1mM pyruvate, 50μM (-mercapthoethanol, 1X nonessential amino acids , 그리고 10% heat inactive fetal calf serum을 첨가하여 각 혈당 2× 105 세포씩 배양하고, 또 이와 동등한 양의 방사선 조사된 항원 제시 세포를 함께 배양을 하였다. 이중제 2형 콜라겐에 반응을 보이는 세포를 선별하기 위하여 우형 콜라겐을 혈당 40μg로 주어 자극을 하였고, 대조군은 동량의 chicken ovalbumin으로 처리 하였다. 장기 배양의 경우 제 30일 까지는 우형 콜라겐 및 ovalbumin control을 사용하고, 30일 이후부터는 immunogenic human peptide (256-270)와 non-immunogenic contorol peptide (27 1-285)을 혈당 40 μg로 주어 자극하였다(6).
- 2. 정상인과 류마티스 관절염 환자의 말초 혈액 내 T 세포 수용체의 양상 비교. 정상인과 환자의 말초혈액에서 분리한 T 세포의 Vβ CDR3 부위를 RT-PCR/SSCP 방법으로 분석하였다.
- 제 2형콜라겐에 반응을 보이는 T 세포의 증식반응검사를 위하여 분리된 세포들을 in vitro에서 5일간 배양을 한 후, 각 혈에 배양 종료 18시간 전에 1μCi 의 3H-methyltymidine을 처리하고, 함입된 3H-TdR의 양을 multiple cell harvester (Cambridge Technology , Cambridge, MA)로 수확한 세포에서 liquid scintillation counter (Model Tri-Carb 300C, Packard International)로 측정하였다. 우형 콜라겐으로 처리한 세포에서 얻어진 결과를 대조군과 비교하여 (SI [stimulation index] = 실험군의 cpm값/대조군의 cpm값), 1,000 CPM 이하는 기계상의 오류 값으로 무시하였으며 SI값이 2 이상인 것을 증식반응 양성으로 평가하였다.
- 증식반응 검사 이후에 합성 human IL-2 (10unit)을 처리하고, 7일 후 각 well마다 1× 105개의 방사선 조사된 항원제시 세포와 40μg/ml 우형 콜라겐을 넣어주었다. 10일 간격으로 이들 세포들을 resuspend시켜 죽은 세포들을 씻어 내고 새로운 방사선조사 항원제세 세포를 T 세포와 혼합배양 하였다.
- PCR 의 조건은 94℃에서 45초, 58℃에서 2분, 72℃에서 1분씩 하여 35 cycle을 반복하였다. 증폭된 DNA들을 단일 가닥으로 분리하기 위하여 이들 PCR 산물을 희석하고 94℃의 열을 주어 denaturation 시킨 후 4%의 polyacrylamide에 10% glycerol 이 들어 있는 non-denaturing 젤에서 전기 영동을 하였다. 이렇게 전기영동이 끝난 젤상의 밴드들을 nylon membrane에 첨착시킨 후 해당 DNA의 절편을 바이오틴이 붙은 internal TCR C( probe (5'-AAC AAG CGT GTT CCC ACC CGA GGT CGC TGT GTT-3')로 라벨하고 Phototope star-detection kit (New England Biology, England)로 발색 시켜 X선 필름에 감광 시켜 이동 패턴을 분석하였다.
- 혈액 단핵 세포와 활액 단핵 세포는 각각 류마티스 관절염 환자와 일반 환자로부터 얻은 혈액 또는 활액으로부터 Ficoll-hypaque 농도를 이용하여 분리하였다. Ficoli-Hypaque-RBC 중간층을 얻어 Mini-MACS 를 통과시켜 각각 CD3+ 세포와 CD3- 세포로 분리하였다.
- Ficoli-Hypaque-RBC 중간층을 얻어 Mini-MACS 를 통과시켜 각각 CD3+ 세포와 CD3- 세포로 분리하였다. 혈액과 활액 샘플에서 분리된 CD3+ 세포들은 RPMI-1640 culture 배지에 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토 마이신, 20 mM HEPES, 2 mg/ml sodium bicarbonate, 1mM pyruvate, 50μM (-mercapthoethanol, 1X nonessential amino acids , 그리고 10% heat inactive fetal calf serum을 첨가하여 각 혈당 2× 105 세포씩 배양하고, 또 이와 동등한 양의 방사선 조사된 항원 제시 세포를 함께 배양을 하였다. 이중제 2형 콜라겐에 반응을 보이는 세포를 선별하기 위하여 우형 콜라겐을 혈당 40μg로 주어 자극을 하였고, 대조군은 동량의 chicken ovalbumin으로 처리 하였다.
- 콜라겐으로 자극한 배양 전과 후의 T 세포 수용체 이용 양상. 환자의 말초 혈액과 활액에서 분리한 T 세포들을 우형 콜라겐으로 자극하여 30일간 배양하여 배양 시작점 (제 0일)과 배양 후 (제 30일)의 수용체 이용 양상을 RT-PCR/SSCP 방법으로 분석하였다. 그림 상단의 화살표는 각 lane의 PCR에 사용된 22개의 Vβ specific prime r들을 나타낸다.
대상 데이터
- Fig. 4. 4명의 관절염 환자에서 공통으로 관찰되는 2형 콜라겐 특이적 Vβ14 CDR3.
- 본 연구에 앞서 관절염 환자의 활막 조직에서 RT-PCR/ SSCP를 이용한 T 세포의 clonality 조사가 실행 된 예는 있으나 (11), 이 경우 항원(제 2형 콜라겐)에 대한 T 세포 반응성을 확인하기에 부족한 시간이며 또 한 환자에서 관찰한 변화이기에 류마티스 관절염의 병인을 설명하기에는 부족하였다. 본 연구는 제 이형 콜라겐 반응T 세포들은 6개월에 걸친 장기 배양으로 지속적으로 증식 유지시켜 제 2형 콜라겐 특이 반응성을 가지는 T 세포들로 선별하였다 (6). 본 연구 결과에서 제 2형 콜라겐을 인식하는 T 세포 중Vβ 14를 사용하는 항원 수용체가 4명의 환자에서 공통적으로 발견이 된다는 사실은, 이미 여러 연구자에서 Vβ 14을 표현하는 T 세포가 류마티스 관절염 발현에 중요한 역할을 한다는 점에서 주목 할 만 하다(2,5).
- 최근의 여러 연구에서 제2형 콜라겐에 반응을 보이는 T 세포 항원 수용기를 분석한 결과 환자의 HLA-DR4가 류마티스 관절염발병과 밀접하게 관련되어 있다고 보고하고 있으나(8, 11), 본 연구의 결과는 non-DR4에서도 뚜렷한 밴드의 pattern이 관찰되었다. 본 연구에서 대상으로 사용한 환자 중 제 2형 콜라겐에 대하여 양성 증식 반응을 보인 7명 중에는 기존에 류마티스 관절염의 발병에 관련되어 있다고 알려진 HLA-DR 1과 DR4 이외에도 DR9, DR7을 비롯한 다양한 종류가 포함되어 있다. 이러한 데이터는 본 연구팀의 선행 연구 결과와도 합치하는 것으로(6), 정확히 설명하기는 어렵지만 제2형 콜라겐의 인식이 HLA-DR 타입에만 관여 하는 것이 아니라 이 외에도 T 세포 수용체의 CDR3 다양성, 특정 J와의 조합에 따른 결합 친화도 등 여러 가지 요인에 따라 결정되기 때문인 것으로 추정된다.
- 본 연구의 대상은 American College of Rheumatology(ACR)의 진단기준에 합당한 8명의 한국인 류마티스 관절염 환자와 3명의 정상인을 대상으로 하였다(Table 1). 환자 및 정상인의 HLA-DR 유전자 typing은 Han 등14의 방법에 따라 각 대립 유전자에 특이적인 primer를 이용한 이중 PCR의 결과로 판정하였다.
- 1: <환자 3> 2 : <환자 4> 3 : <환자 5> 4 : <환자 6>. 실험에 사용된 T 세포들은 말초혈액에서 분리된 배양 9일째의 단핵구들이다.
- cells가 되게 분주하고 동량의 방사선조사된 APCs (EBV transformed non T 세포)를 혼합배양 하였다. 제 2형 콜라겐을 인식하는 T세포들만을 특이적으로 선별하기 위하여 배양시에 40μg/ml의 농도의 우형콜라겐으로 자극하거나 대조군으로 chiken ovalbumin을 사용하였다.
이론/모형
- 정상인과 류마티스 관절염 환자의 말초 혈액 내 T 세포 수용체의 양상 비교. 정상인과 환자의 말초혈액에서 분리한 T 세포의 Vβ CDR3 부위를 RT-PCR/SSCP 방법으로 분석하였다. 그림 상단의 화살표는 각 lane의 PCR에 사용된 22개의 Vβ specific primer들을 나타낸다.
- 본 연구의 대상은 American College of Rheumatology(ACR)의 진단기준에 합당한 8명의 한국인 류마티스 관절염 환자와 3명의 정상인을 대상으로 하였다(Table 1). 환자 및 정상인의 HLA-DR 유전자 typing은 Han 등14의 방법에 따라 각 대립 유전자에 특이적인 primer를 이용한 이중 PCR의 결과로 판정하였다.
성능/효과
- 본 연구에서는 그 말초혈액이나 활액의 단핵구가 콜라겐 자극에 대하여 양성 증식반응을 보인 환자의 T 세포들을 선별하여 장기간 배양하고 그 분열 반응을 살펴보았다. (Fig. 1)에서 본보기로 제시된 실험 결과에서 보여지는 바와 같이, 2형 콜라겐에 대하여 양성 반응을 보이는 환자의 말초 단핵구는 그 SI 값이 180일의 배양 기간동안 약 12배의 증가를 보여주었다.
- 환자의 관절 활액에서 추출한 T 세포들의 SSCP 분석에서도 이와 상이한 SSCP 결과가 얻어졌으며, 이 중 많은 숫자의 밴드가 말초혈액에서 발견된 밴드들과 합치하는 이동 패턴을 보이고 있는 것으로 나타났다 (not shown). 동일 환자의 말초혈액 또는 활액 T 세포의 Vβ CDR3 부위를 콜라겐으로 자극하기 전과 후에 비교 해 본 결과 이 두 시점 사이에 일부 밴드가 사라지거나 또는 새롭게 나타났으며, 전체적으로는 30일 배양 후 밴드들이 더욱 짙고 뚜렷해 진 것을 볼 수 있었다(Fig. 3).
- 류마티스 관절염 환자와 정상인으로부터 얻은 혈액단핵세포 및 활액 단핵세포를 2형 콜라겐으로 자극 한 후 배양 5일째에 비교 평가해본 결과, 환자와 정상인의 말초 혈액 세포들은 그 증식반응에서 별다른 차이를 보이지 않았으나 환자의 활액 단핵 세포들은 상대적으로 높은 SI 값을 나타내었다(Table 1). 세포 배양을 통한 콜라겐 자극이 지속됨에 따라 환자의 혈액과 활액의 단핵 세포구들은 SI값이 지속적으로 증가된 반면 정상인의 혈액에서 얻은 세포는 더 이상 증식하지 않았다 (not shown).
- 본 연구는 제 이형 콜라겐 반응T 세포들은 6개월에 걸친 장기 배양으로 지속적으로 증식 유지시켜 제 2형 콜라겐 특이 반응성을 가지는 T 세포들로 선별하였다 (6). 본 연구 결과에서 제 2형 콜라겐을 인식하는 T 세포 중Vβ 14를 사용하는 항원 수용체가 4명의 환자에서 공통적으로 발견이 된다는 사실은, 이미 여러 연구자에서 Vβ 14을 표현하는 T 세포가 류마티스 관절염 발현에 중요한 역할을 한다는 점에서 주목 할 만 하다(2,5).
- 본 연구에서 조사한 7명의 환자 중 4명에서 공통적으로 증식되어 있는 것으로 나타난 Vβ 14 CDR3 을 발현하는 T 세포들은 배양 전의 말초혈액과 활액에서도 발견되었으며, 배양 30일째에 자극 항원을 우형 콜라겐에서 합성 human peptide (256-270)으로 계대하여도 항원에 반응을 하는 T세포가 유지됨이 관찰되었다. 이는 류마티스 관절염 환자의 조직에서 제 2형 콜라겐에 대한 T 세포 면역 반응이 이 immunodominant 펩타이드(256~270)를 통해서 일어난다고 해석된다.
- RT-PCR/SSCP 방법에서는 젤 상에서 각 DNA의 이동 패턴이 해당 CDR3 부위의 염기서열과 그에 따른 단일 가닥의 꼬임형태에 따라 결정 되어지므로, SSCP 젤 상의 동일 위치에서 밴드가 관찰되면 이는 즉 이들의 염기서열이 동일함을 의미한다(4, 9, 12). 본 연구에서 행한 T 세포 수용체 Vβ 체인의 CDR3 부위 분석 결과, 조사 대상 환자 8명중 네 명에서 동일한 SSCP 밴드 패턴을 나타내는 Vβ 14 밴드가 관찰이 되었다(Fig. 4A). 이들 공통된 Vβ 14 밴드는 환자의 말초혈액과 활액에 모두 존재하며 배양 전의 조직에서도 관찰되었고, 또 자극에 사용된 항원이 우형 콜라겐에서 immunogenic human peptide (256-270)으로 바뀐 뒤에도 유지되어 180일 동안의 배양 기간동안 지속적으로 관찰되었다 (Fig.
- CDR3 부위가 단일 가닥의 DNA 형태로 특정 위치에 배열하도록 하였다. 분석 결과 정상인의 말초혈액에서 얻어진 T 세포들은 모든 22개의 Vβ CDR3 부위가 젤 상에 smear한 패턴으로 관찰 된 반면 (Fig. 2A), 류마티스 관절염환자의 말초 혈액 샘플은 대부분의 Vβ CDR3 부위가 여러 개의 분명한 밴드로 표현 된 것을 볼 수 있었다 (Fig. 2B). 환자의 관절 활액에서 추출한 T 세포들의 SSCP 분석에서도 이와 상이한 SSCP 결과가 얻어졌으며, 이 중 많은 숫자의 밴드가 말초혈액에서 발견된 밴드들과 합치하는 이동 패턴을 보이고 있는 것으로 나타났다 (not shown).
- 여러 항원에 대한 반응성이 있는 다양한 T 세포들이 공존하는 말초 혈액은 이 방법으로 분석 할 경우 SSCP 젤 상에서 smear한 형태로 나타나며, 실제로 정상인의 말초 혈액의 경우 예상된 결과가 관찰되었다. 조사 대상 류마티스 관절염 환자들의 말초 혈액은 smear pattern이 아닌 밴드패턴이 나타난다.
- 4A). 이들 공통된 Vβ 14 밴드는 환자의 말초혈액과 활액에 모두 존재하며 배양 전의 조직에서도 관찰되었고, 또 자극에 사용된 항원이 우형 콜라겐에서 immunogenic human peptide (256-270)으로 바뀐 뒤에도 유지되어 180일 동안의 배양 기간동안 지속적으로 관찰되었다 (Fig. 4B). 두 명 이상의 환자가 공유하고 있는 CDR3 motif는 이 외에도 Vβ 6와 Vβ 13.
- 일반적으로 정상인의 말초 단핵구 T-cell들은 콜라겐 자극에 대하여 양성 증식반응을 보이지 않기 때문에 배양을 유지시킬 수 없었으나, 이중 특이하게 SI 값이 2 이상인 반응을 보이는 두 사람을 대상으로 분석 해 본 결과 이중 한명은 류마티스 관절염 환자로부터의 결과와 비교할 만한 INF-?의 증가를 나타내었다 (Table 2, 정상인 1). 이상의 결과는 항원을 인지하는 T 세포들이 생성이 되어 세포주를 이룬다는 것을 나타낸다.
- 2B). 환자의 관절 활액에서 추출한 T 세포들의 SSCP 분석에서도 이와 상이한 SSCP 결과가 얻어졌으며, 이 중 많은 숫자의 밴드가 말초혈액에서 발견된 밴드들과 합치하는 이동 패턴을 보이고 있는 것으로 나타났다 (not shown). 동일 환자의 말초혈액 또는 활액 T 세포의 Vβ CDR3 부위를 콜라겐으로 자극하기 전과 후에 비교 해 본 결과 이 두 시점 사이에 일부 밴드가 사라지거나 또는 새롭게 나타났으며, 전체적으로는 30일 배양 후 밴드들이 더욱 짙고 뚜렷해 진 것을 볼 수 있었다(Fig.
후속연구
- 본 연구에서는 in vitro에서 콜라겐으로 자극을 주어 장기간 배양한 한국인 류마티스 관절염 환자들의 제 2형 콜라겐 특이 T세포주를 만들고 이를 RT-PCR/SSCP 방법으로 분석하여, 선택적으로 활성화 되어있는 T 세포들의 cytokine 분비 양상 및 그 수용체의 분자적 구조를 살펴보고자 하였다. 이런 연구결과는 항원 특이 T 세포의 기능을 이해하고 이를 선택적으로 차단시키는 방법을 통하여 류마티스 관절염 치료를 위한 면역제어요법 개발에 매우 유용한 정보를 주리라 생각된다.
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