ALI 배양법 이용한 비강 점막 상피세포의 미세구조와 $^{14}C$-mannitol 투과도 Ultra-Structures And $^{14}C$-Mannitol Transport Study of Human Nasal Epithelial Cells Using ALI Culture Technique원문보기
연구배경 : 비강 점막을 통한 약물의 이동이나 대사 등은 실험 동물을 이용한 약력학적인 연구가 이루어져 왔으나 사람의 비강 점막 상피세포의 투과에 대한 연구는 없는 실정이다. 따라서 저자 등은 air-liquid interface (ALI) 방법으로 세포를 배양하여 그 미세구조와 in vitro에서 비강점막 상피세포에 대한 mannitol의 투과도를 알아보고자 하였다. 방 법 : 만성 부비동염 환자의 내시경을 이용한 부비동 수술시 정상 하비갑개의 조직을 채취하여 ALI 방법을 이용하여 transwell내에 monolayer로 상피세포를 배양하였으며 blank filter, 배양 5일째 및 7일째에 transepithelial electrical resistance (TEER) 값을 측정하고 투과전자현미경을 이용하여 견고연접(tight junction)의 형성을 확인하였다. 배양된 세포의 mannitol의 투과도를 알아보기 위해 12일째에 $^{14}C$가 부착된 mannitol $4{\mu}mol$을 배양액과 함께 투여하고 1시간 동안 10분 간격으로 % leakage를 측정하였다. 결 과 : 사람의 비강 상피세포는 7일 내에 confluent monolayer로 배양되었으며 투과전자현미경상 섬모와 견고 연접의 형성이 잘 관찰되었다. TEER 값은 blank filter는 $108.5\;ohm.cm^2$, 배양 5일째는 $141\;ohm.cm^2$, 배양 7일째는 $177.5\;ohm.cm^2$로 측정되었다. Mono-layer를 통한 $^{14}C$-mannitol의 % leakage는 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분에 각각 $35.67{\pm}5.43$, $34.42{\pm}5.60$, $32.75{\pm}5.71$, $31.76{\pm}4.22$, $30.96{\pm}3.49$, $29.60{\pm}3.68%$로 나타났다. 결 론 : ALI 방법으로 배양된 사람의 정상 비강점막 상피세포는 생체와 유사하게 배양되어 세포의 투과도(transcellular permeability) 를 알아보는데 적합하며 in vitro에서 비강점막을 통한 약물의 transport에 대한 연구에 도움이 될 것으로 생각된다.
연구배경 : 비강 점막을 통한 약물의 이동이나 대사 등은 실험 동물을 이용한 약력학적인 연구가 이루어져 왔으나 사람의 비강 점막 상피세포의 투과에 대한 연구는 없는 실정이다. 따라서 저자 등은 air-liquid interface (ALI) 방법으로 세포를 배양하여 그 미세구조와 in vitro에서 비강점막 상피세포에 대한 mannitol의 투과도를 알아보고자 하였다. 방 법 : 만성 부비동염 환자의 내시경을 이용한 부비동 수술시 정상 하비갑개의 조직을 채취하여 ALI 방법을 이용하여 transwell내에 monolayer로 상피세포를 배양하였으며 blank filter, 배양 5일째 및 7일째에 transepithelial electrical resistance (TEER) 값을 측정하고 투과전자현미경을 이용하여 견고연접(tight junction)의 형성을 확인하였다. 배양된 세포의 mannitol의 투과도를 알아보기 위해 12일째에 $^{14}C$가 부착된 mannitol $4{\mu}mol$을 배양액과 함께 투여하고 1시간 동안 10분 간격으로 % leakage를 측정하였다. 결 과 : 사람의 비강 상피세포는 7일 내에 confluent monolayer로 배양되었으며 투과전자현미경상 섬모와 견고 연접의 형성이 잘 관찰되었다. TEER 값은 blank filter는 $108.5\;ohm.cm^2$, 배양 5일째는 $141\;ohm.cm^2$, 배양 7일째는 $177.5\;ohm.cm^2$로 측정되었다. Mono-layer를 통한 $^{14}C$-mannitol의 % leakage는 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분에 각각 $35.67{\pm}5.43$, $34.42{\pm}5.60$, $32.75{\pm}5.71$, $31.76{\pm}4.22$, $30.96{\pm}3.49$, $29.60{\pm}3.68%$로 나타났다. 결 론 : ALI 방법으로 배양된 사람의 정상 비강점막 상피세포는 생체와 유사하게 배양되어 세포의 투과도(transcellular permeability) 를 알아보는데 적합하며 in vitro에서 비강점막을 통한 약물의 transport에 대한 연구에 도움이 될 것으로 생각된다.
Background : The information on nasal transport and the metabolism of peptides have been obtained from pharmacokinetic investigations in experimental animals. However, there are no transport and metabolic studies of human nasal epithelial cells. In this study, the permeability characteristics and th...
Background : The information on nasal transport and the metabolism of peptides have been obtained from pharmacokinetic investigations in experimental animals. However, there are no transport and metabolic studies of human nasal epithelial cells. In this study, the permeability characteristics and the metabolic properties of in vitro human nasal cell monolayers were investigated. Material and Methods : Normal human inferior nasal conchal tissue samples were obtained from patients undergoing endoscopic nasal cavitary surgery. The specimens were cultured in a transwell using an air-liquid Interface (ALI) culture, and the transepithelial electrical resistance (TEER) value of the blank filter and confluent cell monolayers were measured. To determine the % leakage of mannitol, $4{\mu}mol%$$^{14}C$-labelled mannitol was added and the % leakage was measured every 10 minute for 1 hour. Result : Human nasal epithelial cells in the primary culture grew to a confluent monolayer within 7 days and expressed microvilli. The tight junction between the cells was confirmed by transmission electron microscopy. The TEER value of the blank filter, fifth day and seventh day reached $108.5\;ohm.cm^2$, $141\;ohm.cm^2$ and $177.5\;ohm.cm^2$, respectively. Transcellular % leakage of the $^{14}$-mannitol at 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes was $35.67{\pm}5.43$, $34.42{\pm}5.60$, $32.75{\pm}5.71$, $31.76{\pm}4.22$, $30.96{\pm}3.49$ and $29.60{\pm}3.68\;%$, respectively. Conclusion : The human nasal epithelial monolayer using ALI culture techniques is suitable for a transcellular permeability study. The data suggests that human nasal epithelial cells In an ALI culture technique shows some promise for a nasal transport and metabolism study.
Background : The information on nasal transport and the metabolism of peptides have been obtained from pharmacokinetic investigations in experimental animals. However, there are no transport and metabolic studies of human nasal epithelial cells. In this study, the permeability characteristics and the metabolic properties of in vitro human nasal cell monolayers were investigated. Material and Methods : Normal human inferior nasal conchal tissue samples were obtained from patients undergoing endoscopic nasal cavitary surgery. The specimens were cultured in a transwell using an air-liquid Interface (ALI) culture, and the transepithelial electrical resistance (TEER) value of the blank filter and confluent cell monolayers were measured. To determine the % leakage of mannitol, $4{\mu}mol%$$^{14}C$-labelled mannitol was added and the % leakage was measured every 10 minute for 1 hour. Result : Human nasal epithelial cells in the primary culture grew to a confluent monolayer within 7 days and expressed microvilli. The tight junction between the cells was confirmed by transmission electron microscopy. The TEER value of the blank filter, fifth day and seventh day reached $108.5\;ohm.cm^2$, $141\;ohm.cm^2$ and $177.5\;ohm.cm^2$, respectively. Transcellular % leakage of the $^{14}$-mannitol at 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes was $35.67{\pm}5.43$, $34.42{\pm}5.60$, $32.75{\pm}5.71$, $31.76{\pm}4.22$, $30.96{\pm}3.49$ and $29.60{\pm}3.68\;%$, respectively. Conclusion : The human nasal epithelial monolayer using ALI culture techniques is suitable for a transcellular permeability study. The data suggests that human nasal epithelial cells In an ALI culture technique shows some promise for a nasal transport and metabolism study.
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문제 정의
비강 점막을 통한 약물의 이동이나 대사 등은 실험 동물을 이용한 약력학적인 연구가 이루어져 왔으나 사람의 비강 점막 상피세포의 투과에 대한 연구는 없는 실정이다. 따라서 저자 등은 air-liquid interface(ALI) 방법으로 세포를 배양하여 그 미세구조와 in vitro에서 비강점막 상피세포에 대한 mannitol의 투과도를 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 in vitro에서 비강 상피세포를 통한 약물의 운반 및 대사를 알아보기 위한 연구의 일환으로 ALI 방법에 의해 배양된 사람의 비강 상피세포에 대한 14C-mannitol(55.0 mCi/mmol)의 투과도를 알아보았다. MannitoKMW 182)은 단당류(monosc- charide)로서 수용성이며 생체 내에서 대사가 되지 않고 견고연접의 성상을 변화시키지 않으며 이온의 운반 과정에 영향을 주지 않아 세포의 투과성을 알아보는 연구에서 표지자로 흔히 사용된다20-23.
최근까지 호흡기 상피세포를 통한 대사 및 이동과정을 연구하기 위한 세포배양 방법으로 submerged9, suspension10, floating11, air-liquid interface (ALI)12, 13 등의 다양한 방법들이 사용되고 있다. 본 연구에서는 앞으로 비강을 통한 약물의 이동 및 대사 등의 연구에 기초적 자료를 제공하기 위하여 만성 부비동염 환자의 내시경 수술시 정상 하비갑개의 조직을 채취하여 ALI 방법으로 세포를 배양하여 그 미세구조와 in vitro에서 mannitol에 대한 비강점막 상피세포의 투과도를 알아보고자 하였다.
이 방법은 1993년 Kaartinen 등18이 쥐의 기관지 점막에 처음 적용하여 많은 분비상피세포의 관찰을 보고한 바 있으며 Chang 등19은 각막상피세포의 배양에서 ALI 방법이 각막 상피세포의 형성을 촉진시킨다고 보고하였다. 본 연구에서도 ALI 방법을 이용하여 사람의 정상 비강점막 상피세포를 생체와 유사한 형태와 생리학적 및 생화학적 특징을 가진 세포로의 분화를 유도하고자 하였다. 배양된 상피세포들은 평판한지 7~9일 후에 transwell에서 합류를 이루었으며 세포가 합류를 이루면 필터 위의 배지를 제거하여 공기에 노출시키고, 배양액의 성분 변화 없이 매일 배지를 교환하여 상피 세포의 분화를 유도하였다.
제안 방법
ALI 방법에 의해 배양된 사람의 비강점막 상피세포에서 barrier function0] 있는지를 알아보기 위하여 배양 12일째 "C-mannitol을 monolayer에 처리한 뒤 % leakage를 구하였다. Transwell에 사람의 비강 상피세포를 monolayer로 배양한 다음 14C- mannitol 4μ mol을 배양액과 함께 투여한 후 10분 간격으로 60분간 상부에서 하부로 monolayer를 통과한 sample을 채취하여 % leakage를 구하였다.
Petridish에서 배양된 상피세포들은 5~7일째 70% 정도 합류를 이룬 후 0.005% Trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 분리한 다음 1 X 105 cells(passage-2) 을 반투과성막의 insert가 들어있는 6-Transwell (Costar Corp., CA, USA)에 호르몬과 각종 성장인자가 첨가된 BEGM 배지에 부유하여 평판하였다. 세포들은 첫 7일간은 배양액에 잠긴 상태로 두며 배양액은 ALI를 만드는 7일까지 배양용기의 위와 아래쪽 부분을 모두 격일로 갈아주었다.
Monolayer는 TEER 값을 측정하기 전에 transport buffer (Hank's balanced salt solution supplemented with glucose, sodium bicarbonate, HEPES) 로 37 ℃에서 60분간 평형상태가 되도록 처리하였다. TEER 값은 EVOM을 이용하여 측정하였으며 blank filter resistance로 교정하였다.
ALI 방법에 의해 배양된 사람의 비강점막 상피세포에서 barrier function0] 있는지를 알아보기 위하여 배양 12일째 "C-mannitol을 monolayer에 처리한 뒤 % leakage를 구하였다. Transwell에 사람의 비강 상피세포를 monolayer로 배양한 다음 14C- mannitol 4μ mol을 배양액과 함께 투여한 후 10분 간격으로 60분간 상부에서 하부로 monolayer를 통과한 sample을 채취하여 % leakage를 구하였다. 시간에 따른 14C-mannito의 % leakage는 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분에 각각 35.
1). 견고연접 (tight junction) 의 생성은 TEER 값의 측정과 투과전자현미경으로 확인하였다. Blank filter의 TEER 값은 108.
세포들은 첫 7일간은 배양액에 잠긴 상태로 두며 배양액은 ALI를 만드는 7일까지 배양용기의 위와 아래쪽 부분을 모두 격일로 갈아주었다. 그 후는 배양액은 아래쪽 부분만 매일 교환해 주며 위쪽은 배양액을 제거하여 공기에 노출시켜 배양하면서 상피세포의 변화를 관찰하였다.
만성 부비동염 환자의 내시경을 이용한 부비동 수술시 정상 하비갑개의 조직을 채취하여 ALI 방법을 이용하여 transwell내에 monolayer로 상피세포를 배양하였으며 blank filter, 배양 5일째 및 7일째에 transepithelial electrical resistance (TEER) 값을 측정하고 투과전자현미경을 이용하여 견고연접 (tight june&n)의 형성을 확인하였다. 배양된 세포의 mannitol의 투과도를 알아보기 위해 12일째에 %가 부착된 mannitol 4μ mol을 배양액과 함께 투여하고 1시간 동안 10분 간격으로 % leakage를 측정하였다.
본 연구에서도 ALI 방법을 이용하여 사람의 정상 비강점막 상피세포를 생체와 유사한 형태와 생리학적 및 생화학적 특징을 가진 세포로의 분화를 유도하고자 하였다. 배양된 상피세포들은 평판한지 7~9일 후에 transwell에서 합류를 이루었으며 세포가 합류를 이루면 필터 위의 배지를 제거하여 공기에 노출시키고, 배양액의 성분 변화 없이 매일 배지를 교환하여 상피 세포의 분화를 유도하였다. 필터를 공기에 노출한 후 1~2일 정도는 필터위로 배양액이 올라오지만 그 이후에는 배양액이 올라오지 않아 세포의 공기중 노출이 잘 이루어졌다.
만성 부비동염 환자의 내시경을 이용한 부비동 수술시 정상 하비갑개의 조직을 채취하여 ALI 방법을 이용하여 transwell내에 monolayer로 상피세포를 배양하였으며 blank filter, 배양 5일째 및 7일째에 transepithelial electrical resistance (TEER) 값을 측정하고 투과전자현미경을 이용하여 견고연접 (tight june&n)의 형성을 확인하였다. 배양된 세포의 mannitol의 투과도를 알아보기 위해 12일째에 %가 부착된 mannitol 4μ mol을 배양액과 함께 투여하고 1시간 동안 10분 간격으로 % leakage를 측정하였다.
배양된 세포의 mannitol의 투과도를 알아보기 위해 transwell을 장치한 후 12일째에 14C가 부착된 mannitol 4μ mol을 배양액과 함께 투여하고 1시간 동안 10분 간격으로 % leakage를 측정하였다. Monolayer는 TEER 값을 측정하기 전에 transport buffer (Hank's balanced salt solution supplemented with glucose, sodium bicarbonate, HEPES) 로 37 ℃에서 60분간 평형상태가 되도록 처리하였다.
5ng/mℓ triiodothyronine, 25ng/mℓ epidermal growth factor, 10ng/mℓ transferrin, 50nM all-trans retinoic acid, 1% w/v bovine pituitary extract, 600 μg/mℓ bovine serum albumin, 50 μg/mℓ : 5Ong/mℓ의 gentamycin : amphotericin이 들어있는 Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM, Clonetics, San Diego, CA)에 부유시킨 다음 37℃, 5 % CO2-95% air의 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2~3일에 한번씩 교환해 주었고, 배양후 3일, 5일 및 7일에 상피세포의 모양을 위상차 현미경으로 관찰하였다.
Louis, MO)가 들어있는 1 : 1 mixture of Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient F12 (DMEM/F12, Gibco)에 넣어 16~24시간동안 4℃에서 반응시켰다. 유리된 상피세포들을 fetal bovine serum (FBS)이 들어있는 DMEM/F12로 세척하여 protease의 효소작용을 정지시킨 후 10% FBS가 들어있는 DMEM/F12에 부유시켰다. 섬유아세포, 근세포 및 혈관내피세포들을 제거하기 위해 플라스틱 배양용기에 평판한 후 37℃에서 1시간동안 정치시켰다.
이후 50%에서 100% 에탄올까지 단계적으로 탈수하여 Epon 812에 포매하였다. 포매된 조직을 toluidine blue 로 염색한 다음 semithin section(1000nm thickness)하여 광학현미경으로 적당한 부위를 선택하고 ultra-thin section (50-60nm thickness)하여 uranyl acetate에 실온에서 6분, lead citrate에 실온에서 3분간 염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 검체는 만성 부비동염 환자의 내시경을 이용한 부비동 수술시 정상 하비갑개의 점막을 채취하여 이용하였다. 원심분리기는 미국 Eppendorf 사의 Centrifuge 5415C, liquid scintillation count- er(LSC) 는 미국 PACKARD 사의 liquid scintillation analyzer 2200CA TRI-CARB A2200, LSC cocktaile 미국 PACKARD사의 ULTIMA GOLD LSC cocktail 77-0031을 이용하였으며 transepithelia] resistance(TEER) 값의 측정은 미국 WPI 사의 Epithelial Voltohmmeter(EVOM), 위상차 현미경은 일본 Nikon사의 ECLIPSE TE300 기종, 투 과전자현미경은 일본 JEOL사의 JEM 1200EX-Ⅱ 기종을 사용하였다.
본 연구에 사용된 검체는 만성 부비동염 환자의 내시경을 이용한 부비동 수술시 정상 하비갑개의 점막을 채취하여 이용하였다. 원심분리기는 미국 Eppendorf 사의 Centrifuge 5415C, liquid scintillation count- er(LSC) 는 미국 PACKARD 사의 liquid scintillation analyzer 2200CA TRI-CARB A2200, LSC cocktaile 미국 PACKARD사의 ULTIMA GOLD LSC cocktail 77-0031을 이용하였으며 transepithelia] resistance(TEER) 값의 측정은 미국 WPI 사의 Epithelial Voltohmmeter(EVOM), 위상차 현미경은 일본 Nikon사의 ECLIPSE TE300 기종, 투 과전자현미경은 일본 JEOL사의 JEM 1200EX-Ⅱ 기종을 사용하였다.
데이터처리
통계 프로그램은 MINITAB을 이용하였고, TEER 값은 student t-test, mannitol의 % leakage는 ANOVA를 시행하였으며 p값이 0.05 미만인 경우에 통계적 유의성을 인정하였다.
이론/모형
본 연구에서도 ALI 방법에 의해 배양된 사람의 비강 상피세포의 투과성을 알아보기 위한 방법으로 14C- mannitol을 이용하였다. 비강 상피세포를 monolayer로 배양하여 장벽(barrier)을 만든 다음 14C-mannitol을 통과시켰을 경우에 Table 1 에서처럼 시간에 따라 통과하는 양이 비교적 일정한 결과를 보여 배양된 상피세포가 barrier function이 있음을 알 수 있었다.
성능/효과
67 + 5. 43, 34.42 + 5.60, 32.75 + 5.71, 31.76±4.22, 30.96 ±3.49, 29.60±3.68%로 시간에 따라 비교적 일정한 % leakage 를 나타내어 배양된 상피세포는 barrier function이 있음을 알 수 있었다(Table 1).
결론적으로 이 실험에서 사용한 ALI 방법으로 배양된 비강 상피세포는 monolayer로 잘 배양되었으며 시간이 지남에 따라 TEER 값이 증가하고 투과전자 현미경상에서 섬모의 발생과 견고연접의 형성이 잘 관찰되었다. 따라서 향후 ALI 배양법으로 사람의 비강 상피세포를 배양하여 각종 peptides나 약물 등의 정확한 운반 기전 및 대사 등을 빍히기 위한 연구에 도움이 될 것으로 사료된다.
필터를 공기에 노출한 후 1~2일 정도는 필터위로 배양액이 올라오지만 그 이후에는 배양액이 올라오지 않아 세포의 공기중 노출이 잘 이루어졌다. 노출 8~12일 후에는 transwell에서 필터를 분리하여 투과전자현미경적 관찰을 실시한 결과 미세융모로 덮여 있는 분비상피로 추정되는 세포와 세포사이에 견고연접을 관찰할 수 있었다. 이 배양법은 위에서 언급한 바와 같이 배양 환경이 생체와 유사하기 때문에 in vitro에서 배양된 세포가 생체의 세포와 형태 및 생리학적, 생화학적으로 유사하므로 세 포에 대한 약물의 운반(transport) 및 대사 등에 대한 연구에 효과적으로 이용될 수 있다.
사람의 비강 상피세포는 7일 내에 conflumnt mono- layer로 배양되었으며 투과전자현미경상 섬모와 견고 연접의 형성이 잘 관찰되었다. TEER 값은 blank filter는 108.
상피세포들을 평판한 후 3일째 부분적으로 cluster 를 이루어 자라기 시작했고 5~7일째에 거의 70% 이상 합류되었으며 대부분의 세포들은 위상차 현미경 으로 관찰한 결과 전형적인 상피세포의 형태를 보였다 (Fig. 1). 견고연접 (tight junction) 의 생성은 TEER 값의 측정과 투과전자현미경으로 확인하였다.
2). 투과전자현미경으로 관찰한 결과 섬모의 발생이 관찰되었고, 세포사이에 세포사이연접 (intercellular junction)의 하나인 견고연접의 형성이 잘 관찰되었다(Fig. 3).
후속연구
ALI 방법으로 배양된 사람의 정상 비강점막 상피세포 는 생체와 유사하게 배양되어 세포의 투과도(tran- scellular permeability)를 알아보는데 적합하며 in vitro에서 비강점막을 통한 약물의 transport에 대한 연구에 도움이 될 것으로 생각된다.
결론적으로 이 실험에서 사용한 ALI 방법으로 배양된 비강 상피세포는 monolayer로 잘 배양되었으며 시간이 지남에 따라 TEER 값이 증가하고 투과전자 현미경상에서 섬모의 발생과 견고연접의 형성이 잘 관찰되었다. 따라서 향후 ALI 배양법으로 사람의 비강 상피세포를 배양하여 각종 peptides나 약물 등의 정확한 운반 기전 및 대사 등을 빍히기 위한 연구에 도움이 될 것으로 사료된다.
노출 8~12일 후에는 transwell에서 필터를 분리하여 투과전자현미경적 관찰을 실시한 결과 미세융모로 덮여 있는 분비상피로 추정되는 세포와 세포사이에 견고연접을 관찰할 수 있었다. 이 배양법은 위에서 언급한 바와 같이 배양 환경이 생체와 유사하기 때문에 in vitro에서 배양된 세포가 생체의 세포와 형태 및 생리학적, 생화학적으로 유사하므로 세 포에 대한 약물의 운반(transport) 및 대사 등에 대한 연구에 효과적으로 이용될 수 있다.
지금까지 비강 점막을 통한 약물의 이동이나 대사 등은 쥐6, 7, 토끼7, 8, 양8 등 실험 동물을 이용한 연구가 주로 이루어져 왔 으나 사람의 비강 상피세포를 통한 약물의 이동 및 대사에 대해서는 아직까지 연구가 없었기 때문에 그 기전이 정확히 알려져 있지 않다. 이런 기전을 알기 위해서는 먼저 in vitro에서 생체와 유사하게 세포를 배양하고 이를 바탕으로 세포수준의 생물학적인 과정과 이동 현상을 연구해 볼 수 있을 것이다. 최근까지 호흡기 상피세포를 통한 대사 및 이동과정을 연구하기 위한 세포배양 방법으로 submerged9, suspension10, floating11, air-liquid interface (ALI)12, 13 등의 다양한 방법들이 사용되고 있다.
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