마우스 폐암 세포에서 Insulin-Like Growth Factor-I (IGF-I) 및 IGF Binding Protein (IGFBP)의 역할 The Role of Insulin-like Growth Factor I(IGF-I), and IGF Binding Protein (IGFBP) in Mouse Lung Cancer Cells원문보기
연구배경 : 세포성장에 관여하는 여러 growth factor중 IGF-I은 IGF-IR와 결합하여 세포증식을 유발하는 mitogen으로 알려져 있다. 대부분의 정상세포 및 암세포는 IGFBPs을 분비하는데 이들은 IGF-I과 결합하여 IGF-I의 세포증식 효과를 증가 혹은 억제시킨다. 마우스 폐암세포주 (3LL)에서 IGF-I이 세포성장에 미치는 효과를 보고, 3LL 세포에서 분비되는 IGFBP을 추출 확인하고, IGFBPs이 세포 성정에 미치는 영향을 관찰하였다. 방 법 : 마우스 폐암세포주 (3LL)를 이용하여, IGF-I을 투여하여 세포성장을 MTT assay로 측정하였고, 3LL에서 분비되는 IGFBP을 추출하여 Western ligand blot 및 western immunoblot으로 확인하였다. 또한 분비된 IGFBP이 세포성장에 미치는 영향을 보기위해, anti-IGFBP antibody을 첨가하여 이의 기능을 억제하여 세포성장에 관한 기능을 관찰하였다. 결 과 : IGF-I은 serum free media에서 3LL 세포성장을 증가시켰다. 3LL 세포는 IGFBP-4를 생성하는 것을 확인하였고, anti-IGFBP-4 antibody를 첨가시 세포성장이 증가된 소견이 관찰되어 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있음을 간접적으로 알 수 있었다. 결 론 : 이상의 실험 결과로 3LL 마우스 폐암세포에서 IGF-I은 세포성장을 증가시키며, 3LL에서 생성된 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 관찰하였다. 향후 IGF-I과 IGFBPs이 암 성장에 미치는 기전과 임상적 적용에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
연구배경 : 세포성장에 관여하는 여러 growth factor중 IGF-I은 IGF-IR와 결합하여 세포증식을 유발하는 mitogen으로 알려져 있다. 대부분의 정상세포 및 암세포는 IGFBPs을 분비하는데 이들은 IGF-I과 결합하여 IGF-I의 세포증식 효과를 증가 혹은 억제시킨다. 마우스 폐암세포주 (3LL)에서 IGF-I이 세포성장에 미치는 효과를 보고, 3LL 세포에서 분비되는 IGFBP을 추출 확인하고, IGFBPs이 세포 성정에 미치는 영향을 관찰하였다. 방 법 : 마우스 폐암세포주 (3LL)를 이용하여, IGF-I을 투여하여 세포성장을 MTT assay로 측정하였고, 3LL에서 분비되는 IGFBP을 추출하여 Western ligand blot 및 western immunoblot으로 확인하였다. 또한 분비된 IGFBP이 세포성장에 미치는 영향을 보기위해, anti-IGFBP antibody을 첨가하여 이의 기능을 억제하여 세포성장에 관한 기능을 관찰하였다. 결 과 : IGF-I은 serum free media에서 3LL 세포성장을 증가시켰다. 3LL 세포는 IGFBP-4를 생성하는 것을 확인하였고, anti-IGFBP-4 antibody를 첨가시 세포성장이 증가된 소견이 관찰되어 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있음을 간접적으로 알 수 있었다. 결 론 : 이상의 실험 결과로 3LL 마우스 폐암세포에서 IGF-I은 세포성장을 증가시키며, 3LL에서 생성된 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 관찰하였다. 향후 IGF-I과 IGFBPs이 암 성장에 미치는 기전과 임상적 적용에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
Background : IGF-I is an important mitogen in many types of malignancies. Tumors also express many IGF binding proteins, which modulate IGF action. The propose of this study was to evaluate the effect of IGF-I and IGFBP on cell proliferation in mouse lung cancer cells (3LL). Methods : The cellular p...
Background : IGF-I is an important mitogen in many types of malignancies. Tumors also express many IGF binding proteins, which modulate IGF action. The propose of this study was to evaluate the effect of IGF-I and IGFBP on cell proliferation in mouse lung cancer cells (3LL). Methods : The cellular proliferation of 3LL with the treatment of growth factors was evaluated using MTT assay. Western ligand blot was performed in order to determine whether 3LL cells secrete IGFBPs and we evaluated the effect of IGFBP on cellular proliferation. Results : The treatment of 3LL cells with IGF-I increased cellular proliferation in a serum free media. Western ligand blot of conditioned medium of 3LL with $^{125}I$-IGF-I demonstrated one single major band with an estimated molecular mass of 24 kDa. This band was identified as IGFBP-4 with immunoblot analysis using antisera. The addition of anti-IGFBP-4 antibody to abrogate the effect of IGFBP-4 resulted in increased cellular proliferation suggesting that IGFBP-4 inhibits cell growth. Conclusion : IGF-I increases cellular proliferation, however the secreted IGFBP-4 has an inhibitory function on cell growth in 3LL. These findings suggest that IGF-I and IGFBP are involved in the cell proliferation.
Background : IGF-I is an important mitogen in many types of malignancies. Tumors also express many IGF binding proteins, which modulate IGF action. The propose of this study was to evaluate the effect of IGF-I and IGFBP on cell proliferation in mouse lung cancer cells (3LL). Methods : The cellular proliferation of 3LL with the treatment of growth factors was evaluated using MTT assay. Western ligand blot was performed in order to determine whether 3LL cells secrete IGFBPs and we evaluated the effect of IGFBP on cellular proliferation. Results : The treatment of 3LL cells with IGF-I increased cellular proliferation in a serum free media. Western ligand blot of conditioned medium of 3LL with $^{125}I$-IGF-I demonstrated one single major band with an estimated molecular mass of 24 kDa. This band was identified as IGFBP-4 with immunoblot analysis using antisera. The addition of anti-IGFBP-4 antibody to abrogate the effect of IGFBP-4 resulted in increased cellular proliferation suggesting that IGFBP-4 inhibits cell growth. Conclusion : IGF-I increases cellular proliferation, however the secreted IGFBP-4 has an inhibitory function on cell growth in 3LL. These findings suggest that IGF-I and IGFBP are involved in the cell proliferation.
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제안 방법
IGFBP-4가 세포증식에 미치는 영향을 보기 위해 anti-IGFBP-4 antibody# 첨가한 후, 마우스 폐암세 포(3LL)의 세포증식을 MTT assay로 측정하였다. Serum free conditioned media에서의 수치는 0.
5 X106 cpm) (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)로 ¥C 에서 18시간 배양하고 자가 방사선으로 판독하였다. Immunobhttlng을 위해 membrane< 일차 항체인 rabbit anti-human IGFBP-2, -3, ~4 antisera (UBI, Lake Placid, NY, USA)로 실온에서 1시간 동안 배 양하였다. 이차항체 인 peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antitody (Ameraham, Arlington Heights, IL, USA)로 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척하였고, ECL (Amersham, Arlireton Heights, IL, USA)를 실행하였다.
5% SDS-PAGE로 전기영동한 후, nitrocellulose membrane (Amersham, Arlington Heights, 1L} USA)에 전이시켰다. Ligand bk诡ting을 위해 membrane을 0.1% Tween-20을 함유하고 있는 TBS buffer에서 四项訐니 (1.5 X106 cpm) (Amersham, Arlington Heights, IL, USA)로 ¥C 에서 18시간 배양하고 자가 방사선으로 판독하였다. Immunobhttlng을 위해 membrane< 일차 항체인 rabbit anti-human IGFBP-2, -3, ~4 antisera (UBI, Lake Placid, NY, USA)로 실온에서 1시간 동안 배 양하였다.
세포는 96 well 세포배양 용기에 2, 500 cells/well로 분주한 후 12시간 이상 배양하여 부착시키고, FBS 가 없는 세포 배양액에서 24시간 배양하였다. 그 후 serum free 혹은 serum containing media에서 IGF- I, IGF-Ⅱ, des-IGF-I 및 anti-IGFBP-4 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)를 처리하고 3일간 배양한 후, MTT(최종농도 : 80 您/ml)를 첨가하여 2 내지 3시간 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 세포의 증식 정도는 100 以의 dimethylsulfoxide (DMSO) (Sigma Chemical Co.
Conditioned media에서 분비된 IGFBP 를 각각의 anti-IGFBP antibody로 Western immuno- blot을 시행한 결과 관찰된 IGFBP는 IGFBP-4임이 확인되었다. 또한 분비된 IGFBP-4가 세포증식에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 IGFBP-4의 anti- body를 투여하여 세포증식의 변화를 관찰하였다. Serum free media에 비하여 anti-IGFBP-4 antibody를 첨가하였을 때 세포증식이 약 50% 증가하는 소견을 보였다.
마우스 폐암 세포주 (3LL) 를 이용하여, IGF-1을 투여하여 세포 성장을 MTT assay로 측정하였고, 3LL 에서 분비되는 IGFBP을 추출하여 Western ligand blot 및 western immunoblot으로 확인하였다. 또한 분비된 IGFBP이 세포 성장에 미치는 영향을 보기 위 해, anti-IGFBP antibody을 첨가하여 이의 기능을 억제하여 세포 성장에 관한 기능을 관찰하였다.
마우스 폐암 세포(3LL)에서 분비되는 IGFBP틀 확인하기 위해 serum free media를 24시간 처려 후 conditioned media를 추출하고 원심분리하였다. 1251 시GF시을 이용하여 Western ligand biot을 시행한 결과 분자량 24 kDa의 단일 밴드를 관찰할 수 있었 다(Fig.
마우스 폐암 세포주 (3LL) 를 이용하여, IGF-1을 투여하여 세포 성장을 MTT assay로 측정하였고, 3LL 에서 분비되는 IGFBP을 추출하여 Western ligand blot 및 western immunoblot으로 확인하였다. 또한 분비된 IGFBP이 세포 성장에 미치는 영향을 보기 위 해, anti-IGFBP antibody을 첨가하여 이의 기능을 억제하여 세포 성장에 관한 기능을 관찰하였다.
대부분의 정상 세포 및 암세포 는 IGFBPs을 분비하는데 이들은 IGF시과 결합하여 IGF-I의 세포증식 효과를 증가 혹은 억제시킨다. 마우스 폐암세포주 (3LL) 에서 IGF-1이 세포 성장에 미치는 효과를 보고, 3LL 세포에서 분비되는 IGFBP 을 추출 확인하고, IGFBPs이 세포 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
본 실험에서는 3LL 폐암 세포주에서 IGFBP-4 분비를 Western ligand blot, Western immunoblot으로 확인하였다. Conditioned media에서 분비된 IGFBP 를 각각의 anti-IGFBP antibody로 Western immuno- blot을 시행한 결과 관찰된 IGFBP는 IGFBP-4임이 확인되었다.
세포의 중식 정도는 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 -diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포는 96 well 세포배양 용기에 2, 500 cells/well로 분주한 후 12시간 이상 배양하여 부착시키고, FBS 가 없는 세포 배양액에서 24시간 배양하였다.
그 후 serum free 혹은 serum containing media에서 IGF- I, IGF-Ⅱ, des-IGF-I 및 anti-IGFBP-4 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)를 처리하고 3일간 배양한 후, MTT(최종농도 : 80 您/ml)를 첨가하여 2 내지 3시간 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 세포의 증식 정도는 100 以의 dimethylsulfoxide (DMSO) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)를 각 well에 첨가한 후, spectrophotometer (Dyna- tech, Inc., Alexandria, VA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이에 저자 등은 마우스 폐암 세포주(3LL)에서 IGF -1을 투여하여 세포 성장을 관찰하였으며, 또한 IGFBP# 추출하고 그 기능을 확인하여, IGF-I 및 3LL 세포에서 분비되는 IGFBP이 3LL 세포의 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
데이터처리
모든 실험 결과값은 평균값 土 표준편차(mean土SD)로 표현하였고, 통계학적 분석은 Student's £-test로 검증하였으며, P값이 0.05 이하일 때를 통계햑적으로 유의한 결과로 규정하였다.
이론/모형
IGF사:에 의한 세포증식 여부를 알아보기 위해 MTT assay# 시행하였다. 0% serum media인 대조군예 비해 여러 농도의 (10, 50, 100 ng/ml) IGFT을 투 여시 세포증식이 의의 있게 증가하였으며(pCO.
Moiia were aspirated and cells were treated with serum free media in the presence or absence of different doses of IGF-I, 50 ng/ml Etes-IGF-I and 50 ng/ml IGF- II for 72 h. The cellular proliferation was checked by MTT assay.
성능/효과
IGF사:에 의한 세포증식 여부를 알아보기 위해 MTT assay# 시행하였다. 0% serum media인 대조군예 비해 여러 농도의 (10, 50, 100 ng/ml) IGFT을 투 여시 세포증식이 의의 있게 증가하였으며(pCO.05), IGFM의 유도체인 des-IGFT과 IGF-H을 투여 시 대조군에 비해 의의 있는 세포증식을 보였다(p< 0.05) (Fig. 1)
IGF-Ie serum free media에서 3LL 세포 성장을 증가시켰다. 3LL 세포는 IGFBP-4를 생성하는 것을 확인하였고, anti-IGFBP-4 antibody® 첨가 시 세 포성 장이 증가된 소견이 관찰되어 IGFBP-4는 세포 증식을 억제하는 기능을 가지고 있음을 간접적으로 알 수 있었다.
본 실험에서는 3LL 폐암 세포주에서 IGFBP-4 분비를 Western ligand blot, Western immunoblot으로 확인하였다. Conditioned media에서 분비된 IGFBP 를 각각의 anti-IGFBP antibody로 Western immuno- blot을 시행한 결과 관찰된 IGFBP는 IGFBP-4임이 확인되었다. 또한 분비된 IGFBP-4가 세포증식에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 IGFBP-4의 anti- body를 투여하여 세포증식의 변화를 관찰하였다.
IGFBP-4가 세포증식에 미치는 영향을 보기 위해 anti-IGFBP-4 antibody# 첨가한 후, 마우스 폐암세 포(3LL)의 세포증식을 MTT assay로 측정하였다. Serum free conditioned media에서의 수치는 0.91 ±0.4이었고, 1:5000으로 회석한 antTGFBP-4 antibody# 투여했을 때 144±0.17로 유의하게 세포증식 이 증가되는 소견을 관찰할 수 있었다(p<0.01) (Fig. 3). 이러한 결과로 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있음을 간접적으로 알 수 있었다.
또한 분비된 IGFBP-4가 세포증식에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 IGFBP-4의 anti- body를 투여하여 세포증식의 변화를 관찰하였다. Serum free media에 비하여 anti-IGFBP-4 antibody를 첨가하였을 때 세포증식이 약 50% 증가하는 소견을 보였다. 따라서 본 실험의 결과에서 보듯이 anti- IGFBP-4 antibody# 처리하였을 때 세포증식이 증가하는 것으로 보아 분비된 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 간접적으로 알 수 있었다.
본 실험에서는 IGF니 이 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTT assay를 시행하였는데, 3LL 세포에서 serum free media(0% serum)에서는 IGF-I 첨가 시 대조군에 비해 세포증식이 증가하였으나, 1% 및 5% serum containing media에서 는 세포증식에 영향을 미치지 않았다. 따라서 1% 및 5% serum media, 즉 IGF시이 기존에 존재하는 배지에 IGF-I을 첨가 시에는 세포증식에 변화가 없었으나, serum free media, 즉 IGF-I이 존재하지 않는 배지에 IGF-1을 첨가 시에는 세포증식의 증가를 관찰할 수 있었다. 즉 1% 및 5% serum containing media에 는 기존의 IGF니에 의해 세포주기가 진행되고 있어서 여기에 IGF-I을 첨가하더라도 세포주기의 진전을 통한 세포증식에는 큰 영향이 없었던 반면, IGF-I이 없는 free media에 IGF-I을 첨가 시에는 비로소 세포 주기가 진행되어 세포증식이 증가된 것으로 생각된다.
Serum free media에 비하여 anti-IGFBP-4 antibody를 첨가하였을 때 세포증식이 약 50% 증가하는 소견을 보였다. 따라서 본 실험의 결과에서 보듯이 anti- IGFBP-4 antibody# 처리하였을 때 세포증식이 증가하는 것으로 보아 분비된 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 간접적으로 알 수 있었다.
마우스 폐암 세포 (3LL) 에서 IGF-Ie 세포 성장을 증가시키며, 3LLe IGFBP-4를 생성하며, 이는 3LL의 세포 성장을 억제하였다. 그러나 IGFBP-4은 IGF-I 와 결합하여 IGF-Io] 그 수용체와 반응하는 것을 저해할 수 있고, 세포 표면과의 관계, 세포 외 기질(extracellular matrix)과의 관계, 인산화 또는 단백질분해 등과 같은 여러가지 요소들에 의해서 각각의 IGFBP는 ligand에 대한 친화력과 표적 세포에 대한 작용을 변화시킬 수 있다.
본 실험에서는 IGF니 이 세포증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTT assay를 시행하였는데, 3LL 세포에서 serum free media(0% serum)에서는 IGF-I 첨가 시 대조군에 비해 세포증식이 증가하였으나, 1% 및 5% serum containing media에서 는 세포증식에 영향을 미치지 않았다. 따라서 1% 및 5% serum media, 즉 IGF시이 기존에 존재하는 배지에 IGF-I을 첨가 시에는 세포증식에 변화가 없었으나, serum free media, 즉 IGF-I이 존재하지 않는 배지에 IGF-1을 첨가 시에는 세포증식의 증가를 관찰할 수 있었다.
2). 분비된 24 kDa의 IGFBP는 anti- IGFBP-4 antibody로 Western immumbiot을 시행한 결과 IGFBP-4인 것이 확인되었다.
3). 이러한 결과로 IGFBP-4는 세포증식을 억제하는 기능을 가지고 있음을 간접적으로 알 수 있었다.
이상의 실험 결과로 3LL 마우스 폐암 세포에서 IGF쉬 은 세포 성장을 증가시키며, 3LL에서 생성된 IGFBP -4는 세포 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 관찰하였다. 향후 IGF시과 IGFBPs이 암 성장에 미치는 기전과 임상적 적용에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
후속연구
이상의 실험 결과로 3LL 마우스 폐암 세포에서 IGF쉬 은 세포 성장을 증가시키며, 3LL에서 생성된 IGFBP -4는 세포 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다는 것을 관찰하였다. 향후 IGF시과 IGFBPs이 암 성장에 미치는 기전과 임상적 적용에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
그러나 IGFBP-4은 IGF-I 와 결합하여 IGF-Io] 그 수용체와 반응하는 것을 저해할 수 있고, 세포 표면과의 관계, 세포 외 기질(extracellular matrix)과의 관계, 인산화 또는 단백질분해 등과 같은 여러가지 요소들에 의해서 각각의 IGFBP는 ligand에 대한 친화력과 표적 세포에 대한 작용을 변화시킬 수 있다. 현재는 생체 내 연구가 부족하고 IGFBPs이 IGF의 세포 성장에 대한 증가 및 감소 효과가 모두 보고되고 있어서 향후 더 많은 연구가 있어야 하겠으며, 특별한 IGFBP 유전자를 결손 시 키는 유전자 표적 연구(gene targeting study)가 이러한 의문을 해결하는데 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.
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