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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내에서 많이 양식 되고 있는 왕 달팽이<Achatina fulica) 내 장으로부터 6 ■ galactosidase를 분리 . 정 제 하여 이들 효소의 생 화학적 특성을 밝힘 으로써 식 용 달팽이 효소 연구의 기초자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 정제되어 이용되고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 많이 양식 되고 있는 왕 달팽이<Achatina fulica) 내 장으로부터 6 ■ galactosidase를 분리 . 정 제 하여 이들 효소의 생 화학적 특성을 밝힘 으로써 식 용 달팽이 효소 연구의 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 효소의 정제는 투석 후 농축하여 얻은 효소액을 20 mM phosphate buffer(pH 6.5)로 미리 평 형 시 켜 놓은 DEAE Sephadex A-50 column(3.0x25 cm)에 5:mL를 흡착시 키고, 이온교환수지에 결합되지 않은 단백질을 동일 완충용액 320 mL로 용출시킨 다음, 0-1.0 M NaCl 농도구배법을 적용하여 0.4 mL/min 유속으로 8 n丄씩 분획 하였다. 이 온교환 크로마토그■래피 과정에서 얻어 농축한 효소액 5 niL를 Sephacryl S-200 column(3.
- 4 mL/min 유속으로 8 n丄씩 분획 하였다. 이 온교환 크로마토그■래피 과정에서 얻어 농축한 효소액 5 niL를 Sephacryl S-200 column(3.0X50 cm)에 주입한 다음, 동일한 완충용액을 사용하여 0.2 mL/mm유속으로 4 mL씩 분획하였다. Sephacryl S -200 젤 여과에서 얻ep-galactosidase 활성 분획을재 농축한 후 20 mM phosphate buffer(pH 6.
- 5 x 10 cm)에 주입 하였다. 이온교환수지에 결합되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 용출시 킨 다음, 0-0.5 M NaCl 농도구배법을 적용하여 1 mL/min 유속으로 1 rn止씩 분획 하였디, . Mono Q HR 5/5 이온교환 크로마토그래피에서 얻은 분획물 농축한 후 Su- perose 12 HR 10/30 coluiim(1.
- 5 M NaCl 농도구배법을 적용하여 1 mL/min 유속으로 1 rn止씩 분획 하였디, . Mono Q HR 5/5 이온교환 크로마토그래피에서 얻은 분획물 농축한 후 Su- perose 12 HR 10/30 coluiim(1.0X30 cm)에 주입하여 정제하였■으며, 이 때의 유속은 0.5 mL/min였고, 0.5 mL씩 분획하였다. 각 분획에 대해서 280 nm에서의 흡광도와 P-galactosi- dase 활성을 측정하였으며, 각 단계에서 분리된 효소액은 Diaflo PM10 Ultrafiltration Membrane(MW cut-off; 10, 000) 이 부착된 Amicon Diaflo System(Amicon Co.
- 5 mL씩 분획하였다. 각 분획에 대해서 280 nm에서의 흡광도와 P-galactosi- dase 활성을 측정하였으며, 각 단계에서 분리된 효소액은 Diaflo PM10 Ultrafiltration Membrane(MW cut-off; 10, 000) 이 부착된 Amicon Diaflo System(Amicon Co., USA)을 사용하여 N2 gas로 가압, 농촉하였다.
- 0 x 50 cm)을 20 mM sodium phosphate 완충용액으로 평 형시켜 blue dextran으로 void volume(Vo)■§- 구하였다. 표준단백질을 column에 주입 하여 각각의 elution voIume(Ve)을 구한 다음, 표준단백질의 분자량에 데한 Ve/ Vo을 작성한 후 검량선에 의해서 각 효소의 분자량을 측정하였다.
- 사용하였다. 농축용 젤과 분리 용 겔은 각각 5%, 10% polyacrylamide gel로 하였고, 시료는 sodium dodecylsulfate (SDS)와 2-mercaptoethano]을 각각 2%와 5%되 게 가하여 100℃에서 5분간 열처리하였다. 전기영동(Hoefer, Pharmacia, Sweden)은 20 mA로 90분간 실시하였고, 염 색은 0.
- 농축용 젤과 분리 용 겔은 각각 5%, 10% polyacrylamide gel로 하였고, 시료는 sodium dodecylsulfate (SDS)와 2-mercaptoethano]을 각각 2%와 5%되 게 가하여 100℃에서 5분간 열처리하였다. 전기영동(Hoefer, Pharmacia, Sweden)은 20 mA로 90분간 실시하였고, 염 색은 0.25% Coo- massic brilliant blue R-250으로, 탈색은 메탄올 : 아세트산 : 증류수(4.5 :1: 4.5) 혼합용액으로 행 하였다.
- 효소의 등전 점 은 Pharmacia Calibration Kits (Pharmacia Co., Sweden)를 사용하여 측정하였£며, pH 3T0용 5% polyacrylamide gel 상에 정제된 효소와 pl 표준단백질(IEF- Mix 36-93, Sigma, USA)을 loading하여 전기영동한 후 Coomassie brilliant blue로 염색하여 등전점을 확인하였다.
- 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위하여 pH 2.0 에서 pH 11.0까지 에서의 효소 활성도를 측정하였디..
- 0)를 사용하였다. 효소의 pH에대 한 안정 성 은 일정 량의 효소용액 과 각 100 mM 완충용액 을혼합하여 4℃에서 24시간 방치 한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다.
- 효소의 반응 최적 온도를 조사하기 위해 정제된 효소 용액을 20~80℃에서 반응시켜 효소의 활성을 측정하였으며, 효소의 온도에 데한 안정성을 검토하기 위해 정제된 효소 용액을 30 ~ 80℃ 에서 30분간 방치 한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다.
- 금속이온이 효소의 활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 각종 금속이온(KCl, NaCl, L1SO4, CaCI-;, FeCh, HgCh, MgCh, Mn04, ZnCh, AgNC% Pb(CHsCOO)2, CuSO4, BaClz) 을 최종농도가 1 mM이 되도록 첨가한 다음 30분간 방치한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다冬
- 1), 0」~CMMNaCl의 넓은 범위에서 件-galactosidase의 활성 peak가 나타났다. 이 중 대부분의 (3-galactosidase 활성이 있는 fraction No. 42 ~56의 분획을 농축한 후에 Sephacryl S-200 column에 주입 하여 분획 하였다. 그 결과, Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 식용달팽이(Zk加f诚z创ica)는 경북 칠곡군 동명면에 소재한 농가 양식장에서 살아있는 채로 구입하여 실험실에 운반 후 세척, 탈각하여 오물과 물기를 제거한다음 견육을 분리 하고 내 장만을 -35℃에 동결, 저 장하여 두고 시료로 사용하였다.
- Chromatograms of P-galactosidase from Mono Q HR 5/5 on Superose 12 HR 10/30. Column size: 1X30 cm. Flow rate' 0.
이론/모형
- 단백 질의 함량은 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 Lowry 등(29)외 방법으로 정량하였으며, 크로마토그래피를 이용한 정제과정 에서는 280 nm에서 흡광도로 단백 질의농도를 표시하였다.
- 효소의 분자량은 Whitaker(30)의 방법에 따라 Sephacryl S-200 겔 여 과 크로마토그래피로 측정하였다. 먼저 Sephacryl S-200 column(3.
- 전기 영동은 Laemnili(31)으] 방법에 따라 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS -PAGE)-^| 방법을 사용하였다. 농축용 젤과 분리 용 겔은 각각 5%, 10% polyacrylamide gel로 하였고, 시료는 sodium dodecylsulfate (SDS)와 2-mercaptoethano]을 각각 2%와 5%되 게 가하여 100℃에서 5분간 열처리하였다.
성능/효과
- 3과 같았다. 0.05 M에서 0.2 M NaCl사이 에서 단백질과 f-galactosidase 활성 peak를 얻었으며, 이 중 0.1 M에서 0.2 M NaCl농도에서 높은 g-galac- tosidase 활성이 확인되었다. Mono Q HR 5/5 이온교환 크로마토그■래피에서 얻어진 p-galactosidase 활성 분획을 농축한 후 Superose 12 HR 10/30 column에 주입하여 용출한 결과는 Fig.
- 26~36에서 (3- galactosidase 활성 peak가 확인되었다. 이 분획을 모아 전기영동을 실시한 결과, 단일밴드를 나타내었으며, 따라서 달팽이 내장으로부터 추출한 6-galactosidase는 정 제가 되 었음을확인하였다.
- 정제과정이 진행될수록 단백질 함량은 크게 감소하였으며, 비활성도는 증가하였다- 조효소액, 황산암모늄 염석, DEAE Sephadex A-50, Sephacryl S-200 겔 여과, Mono Q HR 5/5 column 및 Superose 12 HR 10/30 column 후오] 비 활성도는 각각 0.6, 1.1, 4.4, 6, 8, 12.5 및 188 units/mg protein으로, Mono Q HR 5/5 column으로 분리한 경우 비활성도가 크게 증가하였음을 알 수 있었다, Mono Q HR 5/5 column콰 Superose 12 HR 10/30 cqIlueii 정제과성 후 조효소액에 비해 각각 208배, 31.3 배 정제되었다.
- pH에 따른 효소활성 변화를 조사한 결과는 Fig. 8(A)와같이 pH 3.0에서 최대 활성을 보였고, pH 5.0이상에서는 50% 활성의 감소를 나타내어 산성 효소임을 알 수 있었다. 쥐의장과 간장의 lysosome에서 정제된 P-galactosidase 경우에는 0 -nitrophenyl-p-D-galactopyranoside*!] 대한 가수분해율이 각각 pH 2.
- 111M의 HLe 효소활성을 저 해하였다(37). 이상에서와 같이 금속이온이 효소활성에 미치는 영향은 Hg”에 의한 효소활성 저해를제외하고 효소의 급원에 따라 많은 차이를 가지는 것을 알수 있었다.
- Sucrose와 lactose는 상대 효소활성이 1 mM 에서 각각 ioi%t 105%이 었고, 10 曲에서는 102%와 107% 로 증가되어 효소활성에 큰 영향을 주지 않았다. Fnictose, glucose, galactose, maltose 및 xylose에 경우에는 두 농도모두에서 효소작용을 저해하였으며, 10 mM 농도가 1 mM 농도에 비해 상대활성이 낯은 것으로 보아 이들의 농도가 높을수록 효소활성을 더 강하게 저해하는 것을 알 수 있었다. Bacillus sp.
- 8%이었다. 阡60加詞건晓의 분자량을 측정하기 위해 겔 여과와 전기영동을 실시한 결과, native molecular weight/} 든¥ 144, 000으로, SDS-PAGE 결과, 약 72,000으로 나타나 이 효소는 동일한 polypeptidee- 구성된 dimer로 추측되었으며, 등전점은 pl4.1 이었다. P-Galactosidasee 최척 pH 와 온도는 각각 pH 3.
- 0~8.0에서는 8。%이상의 활성이 유지되어 비교적 넓은 범위에서 안정하였고, pH 9.0이상 알칼리 영역에서는 활성이 많이 감소하였다. Takenishi등(28)은尸em'a'〃讪"”讪- 阮如。厂로부터 정제한 [3-galactosidase를 pH 2.
후속연구
- 달팽 이는 주로 요리 로서 즐겨 먹는데 프랑스, 이탈리 아, 스페인, 중구 일본 등지 에서 인기가 대단히 높으며, 최근 국내에서도 호텔 전문음식점, 백화점 등에서 달팽이의 수요가 점차 늘고 있는 추세이고(2, 3) 양식기술의 발달 및 보급과 함께 인공양식 이 급증하고 있다. 또한 달팽 이의 소화액은 한 종류의 효소반이 함유된 미 생물과는 달리 여러 종류의 우수한 carbohydrase가 포함되어 있으며, 특히 cellulase, P-galactosidase 및 chitin日訟모} 같온 효소가 많이 함유되 어 (4, 5) 학문적 으로 뿐만 아니라 수용성 식 이 섬 유소 및 복합 올리고당 생산과 같온 산업적 이용 가치를 기대할 수 있다. 이 중 p-galactosidase(B'rD-galactosidase galactohydrolase, EC.
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