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문제 정의
- 본 연구는 in vitro 실험에서 항산화 및 생리활성 작용이 우수한 것으로 보고되고 있는 두충잎의 이용성을 증진시키고자, 사염화탄소를 투여하여 간손상을 유발시 킨 횐쥐 에서 두충잎 물추출물을 투여한 후 이들의 혈청 및 간에서의 지질함량과 효소 활성도를 살펴 보고 간조직 세포의 형 태 학적 변화를 관찰함으로 간기능 회복 정도를 검토하였다.
가설 설정
- 3) Means followed by the same letter in the column are not significantly different (p<0.05).
- 3) Means followed by the same letter in the column are not significantly different (p<0.05).
- E: Hepatic lobular structure is relatively well preserved. Focal congestion is noted in hepatic sinusoids (H&E stain, x200).
제안 방법
- 올리브유를 위와 동일한 방법으로 투여하였다. TE군은 사염 화탄소를 위와 동일하게 1주간 투여한 후 두충잎 물추출물을 4주 투여하였고, 사육기 간 동안 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하게 하였다-
- 급성 간손상을 유도한 T군은 사염화탄소를 올리브유에 1:1의 비율로 녹여 체중 kg당 1 mL씩 3일 간격으로 복강 내로 2회 투여 후 정상 식이를 하였으며, 각군의 대조군에는 동량의 올리브유를 위와 동일한 방법으로 투여하였다. TE군은 사염 화탄소를 위와 동일하게 1주간 투여한 후 두충잎 물추출물을 4주 투여하였고, 사육기 간 동안 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하게 하였다-
- 사육실의 온도는 25±1℃, 습도 50%, 명 암은 12시간 주기 로 조절하였으며 정 상 식 이는 고형사료(삼양사)를 사용하였다. 두충잎 물추출물은 체중 100 g당 0.5 mL를 1일 1회 경구 투여하였다.
- 두충잎의 생약 및 식품자원으로서의 이용성을 증진시킬목적으로 두충잎의 물 추출물을 사염화탄소를 투여한 횐쥐의간손상에 미치 는 영향을 검토하기 위해, 정상군, 사염 화탄소군, 두충잎 물 추출익 투여군, 사염화탄소 처리 후 두충잎 불추출액을 투여 한 군의 4개군으로 나누어 6주간 사육하여 얻은결과는 다음과 같다. 혈청 중의 AST, ALT, LDH 활성은 사염화탄소 투여 에 의해 현저히 증가하였으나 두충잎 물추출물을 함께 뚜여함으로 정상군과 비슷한 수준으로 회복되 었다.
- 실험동물은 Sprague-Dawley 종의 평균 체중이 110±10 g 인 웅성 흰쥐를 1주일간 고형사료로 적응시킨 후, 정상군(N), 사염화탄소 투여군(T), 두충잎 물추출물 투여군(E), 사염화탄소 투여 1주일 후 두충잎 물추출물을 투여 한 군(TE)으로 나누어 난괴 법 에 의하여 각 군당 8마리 씩 4군으로 분리 하여 총 사육기 간을 6주간 하였다. 사육실의 온도는 25±1℃, 습도 50%, 명 암은 12시간 주기 로 조절하였으며 정 상 식 이는 고형사료(삼양사)를 사용하였다.
- 실험동물은 희생전 12시간 동안 물만 주고 절식시킨 뒤 에테르로 마취한 후 개복하여 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하여 30분 동안 방치한 다음 3, 000 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
- 적 출한 간조직 을 10% 증성 포르말린액 에 고정 하고 탈수한 후 침투과정을 거쳐 파라펀에 포매하고 4 μm의 박 절편을 만들어 hematoxylin-eosin 염 색 하여 광학현미 경 (Nikon Co., Japan)으로 관찰하였다為
- 15 M NaCl 용액으로 10% 조직마쇄 엑을만든 후 Folch 등(21)의 방법에 준하여 chloroform: methanol(2 :1, v/v) 혼합액으로써 지질을 추출하여 각종 지질성분을 정 량하였다. 중성지질 함량은 위의 추출액 0.5 mL을 휘발시킨 후, 혈청 총 지질과 동일한 방법으로 측정하여 그 함량을 구하였다.
- 체중은 측정 10시간 전에 식 이 급여를 중단하여 매일 일정 시각에 측정하였고, 횐쥐의 간장 중량은 채혈직후 빙냉의 0.85 -0.9% 생리식염수 용액으로 간을 관류하여 간조직 내에 남아있는 혈액을 제거하였고 생리식염수로 씻어내고 여과지로 수분을 제거한 후 칭 량하여 체중 100 g당의 장기중량으로 환산하였다.
- 또한 각 단백질의 band는 Bio-Capt. 프로그램과 Bio ID 프로그램을 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 또한 Western blottinge Laemmli(23)^ 방법에 의한 SDS-PAGE를 이용하여 정 량한간조직에 5배의 loading dye를 첨가하고 100℃에서 4분간 처리 후 각 well당 20/1。Ug으로 loading하여 tris-glycine buffere 120 volt에서 4시간 전기영동하였다. Standard marker 는 Bio-Rad Co의 myosin(206 K), p-galactosidase(117 K), bovine serum albumin(79 K), ovalbumin(48.3 K) carbonic anhydrase(34.7), soybean trypsin inhibitor(28.8 K)를 사용하였다. 또한 각 단백질의 band는 Bio-Capt.
- 실험에 사용된 두충잎은 경북 영천에서 채취한 것을 음건하여 마쇄한 후 추출기 에 넣고 10배의 증류수를 가해 80℃에서 10시간 이상 추출한 다음 여 과하여 회전 감압농축기 로 농축시켜 두충잎 물추출물을 제조하였다. 농축정도는 건시료 100 g당 물추출물이 100 mL되 게 농축하였으며 4℃에서 보관하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 실험 성적온 평균士표준편차로 표시하였고 실험군간의 통계적 유의성 검정은 SPSS package program을 이용하여 one way ANOVA(분산분석)의 Duncan's multiple test(24)에 의해 유의확률 £ = 0X)5에서 검증하였다.
이론/모형
- AST와 ALT활성도 측정은 Reitman과 Frankel(13)의 방법 에 따라 각각의 기질액 1.0 mL에 혈청 0.2 mL를 첨가하고 37℃에서 ALT는 30분, AST는 60분간 반응시킨 다음 발색 시 약 L0 mL를 가해 발색 시 키 고 0.4 N NaOH 10.0 mL를 가해 10분간 방치 후 505 nm에서 홉광도를 측정하여 검 량선 에 준해 활성도를 환산하였으며 혈청 리터당 Karmen 단위(14)로나타내었 다.
- Alkaline phophatase(ALP) 활성은 Kind-King(JL6)방법 에준하여 측정용 kit(Eiken Co.)를 사용하였으며, 기질액 2.0 mL를 취하여 혈청 0.05 mL를 첨가한 후 37℃에서 15 분간반응 시 켰다. 여기 에 발색액 2.
- Lactate dehydrogenase(LDH) 활성 측정은 Berga와 Broida (15)의 방법에 준하여 조제된 kit(Eiken Co.)를 사용하였으며, 기질엑 0.50ml/l〕발색정 1정을 잘 녹인 다음3분간 전항온처 리 하고 혈청 0.05 mL를 첨가한 후 37℃에서 10분간 반응시 켰다. 여기 에 0.
- 간조직의 지질함량 : 간조직의 지질 함량은 간조직을 균질기를 사용하여 0.15 M NaCl 용액으로 10% 조직마쇄 엑을만든 후 Folch 등(21)의 방법에 준하여 chloroform: methanol(2 :1, v/v) 혼합액으로써 지질을 추출하여 각종 지질성분을 정 량하였다. 중성지질 함량은 위의 추출액 0.
- 중성지질의 함량은 MullerCl少의 방법에 준한 효소법으로, 중성지질 측정용 kit(Eiken Co.)로 측정하였다. 즉 혈청 0.
- 콜레스테롤 함량은 Richmond(20)의 방법으로 조제된 kit (Eiken Co.)를 사용하여 측정하였다. 총 콜레스테롤은 혈청 0.
- 콜레스테롤 함량은 위 추출액 2.0 mL을 휘 발시 킨 후 Zak-Dickman(22)법으로 측정하였다. 즉 건조된 시료를 초산에용해시켜 ferric chloride 용액 2.
- 혈청중의 지질함량 : 혈청 중의 총 지 질 함량은 Frings와 Dunn(18)의 방법에 준하여 혈청 0.1 mL에 진한황산 2.0 mL 를 넣고 잘 혼합한 후 5~10분간 냉각하고, 그 혼합익 0.1 mL 를 취하여 phosphovanillin 용액 5.0 mL를 넣어 잘 혼합한다음, 37℃에서 15분간 가온하고 실온에서 5분간 냉각시켜 540 皿에서 흡광도를 측정하여 산출하였다.
성능/효과
- Table 3은 두충잎 열수 추출물이 사염화탄소를 투여한 흰쥐의 혈청중의 중성지질과 콜레스테롤의 함량에 미치는 영향을 관찰한 것으로서 사염화탄소의 투여는 내형실세망의막에 영향을 미쳐 내형질세망의 다불포화지방산을 산화시켜과산화지질을 형성함으로써 그 기능을 감퇴시키고 중성지질의 축적을 유발하는 보고(30)에서처럼 사염화탄소가 간의실질 세포에 지방, 특히 중성 지질을 비 정상적으로 축적 시 키는 것을 관찰할 수 있었다(Table 4). 한편 두충잎 열수추출액의 투여에 의해 중성지질의 함량이 유의적으로감소되어 Kim 과 Han(31)이 보고한 버 섯추출물은 사염 화탄소에 의해 층가된 중성지질의 함량을 감소시 켰다는 보고와 유사하게 나타났다.
- 간 조직 중의총콜레스테롤, 총지질, 중성 지질의 함량은 사염화탄소에 의해 유의적인 증가를 나타내었으나 두충잎 물추 출엑의 투여로 인해 이들의 함량이유의성 있는 감소는 관찰되지 않았다. 광학현미경에 의한 간조직 세포의 병리 학적인 검사에서는 사염화탄소군에서 간손상시 나타나는 간 조직의 지방변화, 풍선양변성, 호산성 변성 , 국소성 괴사, 부위별 괴사가 관찰되었으나 그 후 두충잎 투여에서 변화가 나타나지 않아 간 손상이 회복되었음을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 두충잎 열수 추출물은 CC14에 의 해손상된 간 기능을 회복시키는 데 효과가 있었으며, 특히 혈 청지질 개선에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 21 mg/g 으로 정상군에서보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 이들의함량은 사염화탄소 투여에 의해 증가하였으나 두충잎의 물추출물의 두여 에 의해 유의성 있는 감소는 나타나지 않았다 (Tabic 4). 또한 사염화탄소 투여는 간조직의 중성 지 질 함량을 유의적으로 증가시켰으나 두충잎 물추출물의 투여에 의해서 유의성 있는 감소가 관찰되지 않았다.
- 2와 Table 5에 나타난 바와 같이 정상군은 간소엽 의 구조가 잘 유지 되 었으며 간세포들은 풍부한 호산성 세포질과 둥근헥을가지고 있었으며 간제포판은 대부분 한층으로 잘 유지되어있었다- T군의 경우 간세포의 풍선양 변성, 괴사 및 림프구등의 염증세포 침윤, 소포성 지 방 변성 이 소엽 중심 대 에 주로나타나 사염화탄소에 의한 손상이 관찰되었다- 두충잎 투여군(E군)에서는 간소엽의 구조가비교적 잘 유지되었으며 간혹 동모양 혈관이나 문맥정맥에 울혈이 관찰되었다. 사염화탄소 유도후 두충잎 물추출물을 투여한 TE군에서는 간소엽을 구성하고 있는 간세포들이 전반적으로 균일하게 배열되어 있어 정상적 인 간 소견을 닮았으며, 간혹 2개의 핵을 가진간세포들이 관찰되어 사염화탄소 두여에 의해 손상된 간세포들의 재생을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 두충잎 물추출물이 사염화탄소에 의해 손상된 간기능의 회복정도를 간세포의 형 태 학적 인 관찰을 통해 명 확히 뒷받침 해 주고 있으며 두충잎은 손상된 간기능의 회복에 아주 효과적인 신소재로서의 개발가능성을 시사해 주고 있다.
- 사염화탄소 투여 에 의 헤 증가된 총 콜레스테롤 함량은 두충잎 물추출물 투여 에 의해 정 상군 수준까지 유의 적 인 감소를 나타내었으며, LDL콜레스테롤의 함량도 같은 경향을 나타내었다. 혈청 중 총 cholesterol 함량 측정은 체내 지질 대사이상의 지표로서 중요하며 관상 동맥 질환, 지 방대사 이상, 췌징-, 간장질환 등의 경우 농도가 증가하는 것으로 알려져 있다.
- 2에 나타낸 바와 같다. 사염화탄소 투여로(T군) 흰쥐의 혈청 AST와 ALT 활성은 정상군(N군)에 비해 4.1 배와 2.9배 증가하였으나, 두충잎을 투여 함으로 약 61%와 70%가각각 감소되었다. Mun 등(26)은 사염화탄소 투여 에 의 헤 마우스의 혈청의 AST 활성이 33.
- 광학현미경에 의한 간조직 세포의 병리 학적인 검사에서는 사염화탄소군에서 간손상시 나타나는 간 조직의 지방변화, 풍선양변성, 호산성 변성 , 국소성 괴사, 부위별 괴사가 관찰되었으나 그 후 두충잎 투여에서 변화가 나타나지 않아 간 손상이 회복되었음을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 두충잎 열수 추출물은 CC14에 의 해손상된 간 기능을 회복시키는 데 효과가 있었으며, 특히 혈 청지질 개선에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 체중증가량은 정상군(M과 두충잎 물추출물군(E) 이 가장 높았교, 사염화탄소 투여 한 T군에 비해 사염화탄소 투여 후 두충잎 물추출물을 투여 한 TE군의 체중 증가량이 유의적으로 높게 나타났다.
- 간조직의 총콜레스테롤 함량. 총지질, 중성지질의 함량은 Table 4에 나타난 바와 같이 두충잎 투여군에서 총콜레스테롤 함량이 7.06士 LU mg/g, 총지질 함량이 52.00±9.21 mg/g 으로 정상군에서보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 이들의함량은 사염화탄소 투여에 의해 증가하였으나 두충잎의 물추출물의 두여 에 의해 유의성 있는 감소는 나타나지 않았다 (Tabic 4). 또한 사염화탄소 투여는 간조직의 중성 지 질 함량을 유의적으로 증가시켰으나 두충잎 물추출물의 투여에 의해서 유의성 있는 감소가 관찰되지 않았다.
- 25 mg/dL에 비해 57%나높게 나타났으며, 정상군(N)의 경우 사염화탄소군(T)에 비해 약간의 감소는 나타났으나 유의 성 은 관찰되 지 않았는데, Kim과 Han(31)은 흰쥐 에서 사염화탄소를 투여함으로 혈청 내 HDL 콜레스테롤의 양은 식 이 내 지 방함량의 차이와 관계없이 모두 유의적으로 감소하였다고 보고하였다. 특히 두충잎 열수추출물 두여한 군(E군, TE군)에서 총콜레스테롤에 대한 HDL 콜레스테롤의 백분율이 유의적으로 높게 나타났으며, 동맥경화증을 일으킬 수 있는 위험인자의 지표인 동맥경화지수(A丄)의 비율은 낮게 나타나 두충잎 열수 추출물이 흰쥐의 사염화탄소에 의해 증가된 혈청내 콜레스테롤의 함량을 감소시키는데 상당한 영향을 미 칠 것으로 생각된다.
- 혈청중의 중성지질, 총 콜레스테롤 함량과 LDL콜레스테롤의 함량은 사염화탄소군에서만 유의적인 증가를 나타내었을 뿐 나머지 각군간의 유의적인 차이는 없었다. 한편 혈청중의 HDL콜레스테롤의 함량은 두 충 단독 투여군 및 사염화탄소 투여 후 두충잎 두여 군이 정상군 및 사염화탄소 단독 투여군들보다 유의적으로 높게 나타났다. 간 조직 중의총콜레스테롤, 총지질, 중성 지질의 함량은 사염화탄소에 의해 유의적인 증가를 나타내었으나 두충잎 물추 출엑의 투여로 인해 이들의 함량이유의성 있는 감소는 관찰되지 않았다.
- 한편 사염 화탄소에 의해 증가된 혈청중의 ALP 활성은 두충잎 투여 에 의해 유의성 있게 감소하지 않았다. 혈청중의 중성지질, 총 콜레스테롤 함량과 LDL콜레스테롤의 함량은 사염화탄소군에서만 유의적인 증가를 나타내었을 뿐 나머지 각군간의 유의적인 차이는 없었다. 한편 혈청중의 HDL콜레스테롤의 함량은 두 충 단독 투여군 및 사염화탄소 투여 후 두충잎 두여 군이 정상군 및 사염화탄소 단독 투여군들보다 유의적으로 높게 나타났다.
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