선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구는 AFB로 의심되는 병의 발생 시 또는 발병 이전에 방역의 목적으로 오염된 봉군 여 부를 판정하기 위하여, EZarvae 및 그 포자를 쉽고 빠르게 검색할 수 있는 P. larvae 검색용 ELISA법을 개발하고자 하였다. 본 ELISA법은 기니아피그를 면역숙주로 제작한 P.
제안 방법
- 6MKC1)에 lOmg/ml로 부 유하여 면역항원단백질을 제조하였다. 1차 면역주사에 2.5 mg의 면역항원을 complete Freund's adjuvant (Gibco-BRL, U.S.A)와 1 : 1로 혼합하여 기니아피그의 등에 피하주사하였고, 2주 간격으로 5 mg의 면역항원을 incomplete Freund's adjuvant와 1:1로 혼합하여 2, 3차 면역주사하였다.4차, 5차 및 6차 면역은 2, 3차와 같은 양을 각 1주 간격으로 주사하였다.
- 2차, 3차 면 역 주사 후 증가된 항체가가 4차, 5차, 6 차의 면역 시에 큰 변화를 보이지 않기에 면역을 중단하고 기니아피그 1두 당 약 15 ml의 혈액을 채취하여 항혈청(다클론항체)을 회수하였다. 다클론 항체를 1/100, 1/1,000, 1/10, 000, 1/100, 000AS.
- 이차 항체반응은 3% skim milk-TBST로 1/10, 000 희석시킨 anti-guineapig IgG 항체(Sigma)로 상온, 30분간 진행하였고 반응이 끝난 후 TBST로 5분간 3회 세척하였다. DAB solution을 처리하여 발색반응을 확인하였고, 물로 세척하여 반응을 종결시켰다.
- , 1979)으로 비교하였다. P. larvae 표준 균주 및 부저 발병 양봉장에 서 분리한 분리 균주, 그 외 다른 균주를 대상으로 비교하였으며, 각 균주를 초음파 파쇄하여 실험에 이용하였다. 1차 항체로는 전채혈로 얻어낸 기니아피그 다항체를 사용했고, 2차 항체로는 ELISA와 마찬가지로 anti-guineapig IgG 항체를 사용하였다.
- P. larvae에 대한 다클론항체로 꿀벌 소비 내에서 P. larvae 잔류포자 검출이 가능한지 비교하였다. 미국부저병이 발병한 적이 없는 강군의 꿀벌소비와 미국 부저병이 발병했었던 오염된 소비에서 벌꿀 화분 저장부위(소비의 상단부 좌우)와 산란부위(소비의 중심부) 및 소비하단 좌우부위를 지 정하고 벌집을 뜯어 멸균증류수에 분쇄하였고, 10분간 정치하여 고형물을 침전시킨 후 상등액을 BHI 배지에 접종 배양하였다.
- 반응 후 PBS로 3회 세척하고, 1/10, 000 (PBST)로 희석한 이차항체를 각 well 당 50 枠1씩 가하고 상온에서 30분 동안 정치하였다. PBS (Phosphate-buffer saline pH 7.2)로 3회 세 척 후 50 ^1, 0.04% OPD 기질용액 (4 mg o-phenylene- diamine, 4|il H2O2 (30%), 10ml (Citrate-phosphate buffer pH 5.0)을 가하여 기질효소반응을 확인(15-30 분)하였고, stop solution (2.5N H2SO4)으로 반응을 종결시켰다. 반응한 발색 정도를 ELISA reader (Bio-rad 사를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Western blotting으로 다클론 항체 의 P- Zarvae 특이성을 비교하였다. P.
- larvae 표준균주 ATCC 25748, /YTCC 25747과 부저 발병양봉장에서 분리한 SJ15 (한국산 분리균주), & s泌沥E. c沥의 균체파쇄물 등을 SDS-PAGE를 수행하여 단백질 크기별로 분리 하고 다클론 항체로 검출 부위를 확인하였다. 그 결과 P.
- 각 면역주사 전에 귀에서 채혈하고 혈청을 분리하여 항체가 비교에 사용하였으며, 최고의 항체가를 보인 6차 면역 완료 후 기니아피그를 마취 해부하여 심장에서 전채혈하고, 상온에서 2시간, 4℃18시간 정치한 두], 원심분리(8000 rpm, 30분)로 혈청을 분리하여 P/arvae 에 대한 항혈청을 회수하였다. 회수한 항혈청(다클론항체)은 그대로 분주하여 냉동 보관하며 실험에 사용하였다.
- 0 이하의 낮은 역가를 나타내었다. 따라서 다항 체 1/10, 000, 항원 농도 1迎을 최적 농도로 정하였고, 이후 ELISA 및 western blotting에 적용하였다. 기니아피그에서 회수된 항혈청은 두 당 약 15ml로, 이는 본 실험에 따르면 약 300, 000회의 ELISA검사 를 수행할 수 있는 양이다.
- 면 역 항원 P- larvae ATCC 25748을 skim milk plate 에 배양하여 투명환을 확인하고 PCR 검출법(Yang, Yoon, 2001; Govan, 1999)과 현미경 검경으로 확인하였다. PCR 검출 반응을 수행했을 때 각각 405 bp 와 973 bp의 P.
- larvae 잔류포자 검출이 가능한지 비교하였다. 미국부저병이 발병한 적이 없는 강군의 꿀벌소비와 미국 부저병이 발병했었던 오염된 소비에서 벌꿀 화분 저장부위(소비의 상단부 좌우)와 산란부위(소비의 중심부) 및 소비하단 좌우부위를 지 정하고 벌집을 뜯어 멸균증류수에 분쇄하였고, 10분간 정치하여 고형물을 침전시킨 후 상등액을 BHI 배지에 접종 배양하였다. 벌집 부유액과 배양 1일 경과 sam- ple, 배 양 3일 경과 sample, 배 양 5일 경과 sample, 배양 11일 경과 sample에 대한 ELISA 비교실험 결과, 오염소비 산란부위(애벌레가 있던 부위: D), 배양 5, 11일 경과 sample에서 P.
- 5N H2SO4)으로 반응을 종결시켰다. 반응한 발색 정도를 ELISA reader (Bio-rad 사를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
- larvae 검색용 ELISA법을 개발하고자 하였다. 본 ELISA법은 기니아피그를 면역숙주로 제작한 P. Zarvae에 대한 특이 다항체를 사용하였으며, 이 항체로 여러 / larvae 균주들의 균주 특이성을 비교하였으며, 오염된 소비로부터 P. larvae의 검출을 확인하였다.
- 부저병이 발병하기 전에 면역학적 방법으로 부저 병균을 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여 부저 병이 발생했던 오염 소비와 오염되지 않은 소비의 벌집을 이용해서 균의 검출을 시도하였다. 소비의 상단 좌우부(벌꿀저장부위), 소비의 중앙부(산란부위), 하단 좌우부에서 3×3cm 크기로 벌집을 잘라내, 이를 멸균증류수에서 분쇄한 뒤 상온에서 20분간 정치해서 고형물을 가라 앉힌 후 상등액 100 pil 를 BHI에 접종, 배양(37℃, 180 rpm 진탕배양)하였다.
- 5초, 1 분). 분쇄액을 원심분리하고 침전물을 Disruption buffer (0.05 M Tris-HCl pH 7.8, 0.5%TritonX-100, 0.6MKC1)에 lOmg/ml로 부 유하여 면역항원단백질을 제조하였다. 1차 면역주사에 2.
- 부저병이 발병하기 전에 면역학적 방법으로 부저 병균을 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여 부저 병이 발생했던 오염 소비와 오염되지 않은 소비의 벌집을 이용해서 균의 검출을 시도하였다. 소비의 상단 좌우부(벌꿀저장부위), 소비의 중앙부(산란부위), 하단 좌우부에서 3×3cm 크기로 벌집을 잘라내, 이를 멸균증류수에서 분쇄한 뒤 상온에서 20분간 정치해서 고형물을 가라 앉힌 후 상등액 100 pil 를 BHI에 접종, 배양(37℃, 180 rpm 진탕배양)하였다. 접종 후 1 일, 3일, 5일 11일 경과된 배양액을 ELISA 검색하여3 larvae 검출여부 및 시기와 소비 에서의 검출부위를 비교 확인하였다.
- 소비의 상단 좌우부(벌꿀저장부위), 소비의 중앙부(산란부위), 하단 좌우부에서 3×3cm 크기로 벌집을 잘라내, 이를 멸균증류수에서 분쇄한 뒤 상온에서 20분간 정치해서 고형물을 가라 앉힌 후 상등액 100 pil 를 BHI에 접종, 배양(37℃, 180 rpm 진탕배양)하였다. 접종 후 1 일, 3일, 5일 11일 경과된 배양액을 ELISA 검색하여3 larvae 검출여부 및 시기와 소비 에서의 검출부위를 비교 확인하였다.
- 기니아피그에 대한 면역은 다음과 같이 면역항원을 제조하여 실시하였다(Yoon, 1999). 즉, ATCC 25748 균주를 1LBHI에 증균배양, 원심분리로 침전시키고, PBS에 100mg/ml로 부유시켜 초음파 분쇄하였다(VCX-400, Sonics & Materials Inc.; Amplitude 40%, Pulse on/off0.5초, 1 분). 분쇄액을 원심분리하고 침전물을 Disruption buffer (0.
- 파쇄된 균체 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 이 단백질 패턴을 PVDF membrane (Boeringer manheim 사)에 Protein Blotter (Biometra사)를 사용하여 5 mA/cnX의 전류로 50~70분 동안 처리하여 이동시킨 후, Ponceau S 용액으로 염색해서 옮겨진 band를 확인하였다. PVDF membrane을 blocking solution (3% skim milk-TBS)에 넣고 30분간 상온에서 약하게 진탕시킨 후 TBST로 5분 동안 3회 세척하였다.
- 항체가 및 특이성 비교를 위해 제작된 다클론 항체를 1 차 항체로, E /arvae 및 비교 균주를 항원으로, anti-guineapig-IgG 항체를 2차 항체로 하여 ELISA를 수행하였다. 본 실험법은 본 / larvae 검색용 ELISA법의 최적조건으로 재구성된 것으로 기본적인 방법은 다음과 같다.
- 항체의 P. larvae 균주 특이성을 조사하기 위해 P.larvae ATCC 25748, Bacillus subtilis, 한국산 분리 단간균 KG5 를 비롯한 꿀벌 유충 유래 기타 균주들을 ELISA법으로 조사하였다. 본 연구에서 생산된 항체는 단지 P.
- 다클론 항체를 1/100, 1/1,000, 1/10, 000, 1/100, 000AS. 희석하였고 각각의 희석된 다클론 항체를 항원농도 10 Ng, 1 [ig, 0.1 jig, 0.01 Ng에 대하여 그 항체 역가를 비교하였다(Fig. 2). 1/1,000의 다클론 항체는 10~ 0.
대상 데이터
- larvae 표준 균주 및 부저 발병 양봉장에 서 분리한 분리 균주, 그 외 다른 균주를 대상으로 비교하였으며, 각 균주를 초음파 파쇄하여 실험에 이용하였다. 1차 항체로는 전채혈로 얻어낸 기니아피그 다항체를 사용했고, 2차 항체로는 ELISA와 마찬가지로 anti-guineapig IgG 항체를 사용하였다.
- coli, 기타 꿀벌 유래 세균 등을 대조군으로 사용하였다. 균주 배양은 일반적으로 BHI (Brain Heart In- fusion, Difco)배지를 사용하였으며, 면역숙주로는 생후 8개월 수준의 기니아피그(약 800 g)들을 대한 실 험동물(주)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 균주 중 Paenibacillus larvae ATCC 25748, ATCC 25747, ATCC 9545은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받았으며, 경북 상주 양봉장에서 분리된 균주인 SJ15 및 P. al.,ei 한국산 분리 균주 KG5, Bacillus subtilis, E. coli, 기타 꿀벌 유래 세균 등을 대조군으로 사용하였다. 균주 배양은 일반적으로 BHI (Brain Heart In- fusion, Difco)배지를 사용하였으며, 면역숙주로는 생후 8개월 수준의 기니아피그(약 800 g)들을 대한 실 험동물(주)에서 구입하여 사용하였다.
- 1). 이 ATCC 25748을 증균배양하여 초음파 분쇄 후 면역항원단백질로 제조하였다.
- 시간 정치한 두], 원심분리(8000 rpm, 30분)로 혈청을 분리하여 P/arvae 에 대한 항혈청을 회수하였다. 회수한 항혈청(다클론항체)은 그대로 분주하여 냉동 보관하며 실험에 사용하였다.
이론/모형
- BHI-milk plate (5%)에서 투명환을 형성하는 ATCC 25748 단일 균집락을 선별하여 P. larvae 특이 PCR 검출법(Yang and Yoon, 2001)으로 확인하였다. 기니아피그에 대한 면역은 다음과 같이 면역항원을 제조하여 실시하였다(Yoon, 1999).
- 다항체의 P. larvae 특이성을 Western blotting (Towbin et al., 1979)으로 비교하였다. P.
- 항체가 및 특이성 비교를 위해 제작된 다클론 항체를 1 차 항체로, E /arvae 및 비교 균주를 항원으로, anti-guineapig-IgG 항체를 2차 항체로 하여 ELISA를 수행하였다. 본 실험법은 본 / larvae 검색용 ELISA법의 최적조건으로 재구성된 것으로 기본적인 방법은 다음과 같다. 96-well ELISA plate (Coming사)를 사용하여 각 well 당 50 μ1 항원(각 균주의 18시간 배양액 또는 그 균체 파쇄액)으로 코팅(Coating buffer; carbonate-bicarbonate, pH 9.
성능/효과
- 3). 이 결과는 ELISA법의 것과 동일한 결과로써, 본 연구에서 생산된 항 P. /"vae 항체 의 특이성이 ATCC 25748의 항원으로 제작한 다클론항체지만 ATCC 25747, ATCC 9545, SJ15에서도 동일한 항체 역가를 나타내는 것으로 보아 P- larvae 특이 공통 항원에만 반응하는 것으로 확인되었다.
- 면 역 항원 P- larvae ATCC 25748을 skim milk plate 에 배양하여 투명환을 확인하고 PCR 검출법(Yang, Yoon, 2001; Govan, 1999)과 현미경 검경으로 확인하였다. PCR 검출 반응을 수행했을 때 각각 405 bp 와 973 bp의 P. Zarvae 특이 band를 전기영동으로 확인할 수 있었고, 배양액을 현미경으로 검경하였을 때 균사처럼 길게 붙어 자라는 P. /arvae의 특성을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 이 ATCC 25748을 증균배양하여 초음파 분쇄 후 면역항원단백질로 제조하였다.
- c沥의 균체파쇄물 등을 SDS-PAGE를 수행하여 단백질 크기별로 분리 하고 다클론 항체로 검출 부위를 확인하였다. 그 결과 P. larvae ATCC 25748, ATCC 25747, 한국산분리 균주 SJ15 등 E Zarvae의 균체 파쇄물에서만 뚜렷한 발색 반응을 확인하였고, 다항체와 반응하는 항원 단백질들의 크기와 반응정도가 비슷한 양상임을 확인할 수 있었다. 표준균주에서의 반응정도와 한국산 분리균주(SJ15)의 반응정도에서 약간의 발색차이가 나는 것은 한국산 균주와 표준 균주의 차이라 생각되나/ larvae7\ 아닌 다른 균주에서는 발색반응이 거의 없어 P- /arvae에 대한 높은 항체 특이성을 증 명하였다(Fig.
- 미국부저병이 발병한 적이 없는 강군의 꿀벌소비와 미국 부저병이 발병했었던 오염된 소비에서 벌꿀 화분 저장부위(소비의 상단부 좌우)와 산란부위(소비의 중심부) 및 소비하단 좌우부위를 지 정하고 벌집을 뜯어 멸균증류수에 분쇄하였고, 10분간 정치하여 고형물을 침전시킨 후 상등액을 BHI 배지에 접종 배양하였다. 벌집 부유액과 배양 1일 경과 sam- ple, 배 양 3일 경과 sample, 배 양 5일 경과 sample, 배양 11일 경과 sample에 대한 ELISA 비교실험 결과, 오염소비 산란부위(애벌레가 있던 부위: D), 배양 5, 11일 경과 sample에서 P. larvaee}- 검출되었고 (Table 1) 이 결과로 오염된 애벌레가 있던 벌집부위에 P. /arvae 포자가 잔류하는 것을 증명하였다.
- larvae ATCC 25748, Bacillus subtilis, 한국산 분리 단간균 KG5 를 비롯한 꿀벌 유충 유래 기타 균주들을 ELISA법으로 조사하였다. 본 연구에서 생산된 항체는 단지 P. /arvae만에 특이적 반응을 보임을 확인할 수 있었으며, 이는 각 배양액 및 균체 파쇄물에 대하여도 같은 특이성을 보였다. 한국산 분리 단간균인 KG5는 부저 증상를 보이는 애벌레에서 가장 많이 발견되는, 2차 침입세균인 Paenibacillus al.
- ,eie] 한국산 균주이다. 본 연구에서 생산된 항체는 이 P- al.,eie 반응하지 않음은 물론 다른 포자형성 세균인 B. subtilts, 그리고 기타 꿀벌 유래 세균에 대하여도 반응하지 않는 높은 항체 특이성을 나타내었다.
- larvae ATCC 25748, ATCC 25747, 한국산분리 균주 SJ15 등 E Zarvae의 균체 파쇄물에서만 뚜렷한 발색 반응을 확인하였고, 다항체와 반응하는 항원 단백질들의 크기와 반응정도가 비슷한 양상임을 확인할 수 있었다. 표준균주에서의 반응정도와 한국산 분리균주(SJ15)의 반응정도에서 약간의 발색차이가 나는 것은 한국산 균주와 표준 균주의 차이라 생각되나/ larvae7\ 아닌 다른 균주에서는 발색반응이 거의 없어 P- /arvae에 대한 높은 항체 특이성을 증 명하였다(Fig. 3). 이 결과는 ELISA법의 것과 동일한 결과로써, 본 연구에서 생산된 항 P.
후속연구
- 미국부저병의 정확하고 신속한 진단방법은 발병 이후 정확한 처치를 위하여 중요할 뿐 아니라, 발병 이전의 봉군이 원인균인 P- /arvae에 의해 오염되었는지 여부를 판단하기 위하여도 매우 중요한 도구이다. 이러한 역학 조사는 P. larvae 또는 그 포자의 존재여부로 판단할 수 있으며, 이는 대량의 시료를 처리할 수 있는 또는 현장판독이 가능한 면역학적 방법에 의하여야 실효를 거둘 수 있을 것이다.
- 이로써 미오염봉군과 오염봉군의 판정법에 본 연구 결과인 P. larvae 검색용 ELISA법이 매우 유용하며, 이를 근거로 한 오염봉군 판정법으로 AFB 원인균을 봉군에서 쉽게 monitoring 할 수 있게 하여 발병의 예측 및 예방 또한 이로 인한 항생제 남용 및 오용을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.